呂二鎖，逯曉萍，王樹彥，薛春雷，韓平安，董 婧，任 銳，李美娜

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010019；2 呼和浩特市合創(chuàng)農(nóng)業(yè)科技研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特011500；3 呼和浩特市種子管理站，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

玉米誘變與原自交系株高變化的蛋白質(zhì)組學(xué)及差異基因的功能分析

呂二鎖1，逯曉萍1，王樹彥1，薛春雷2，韓平安1，董 婧1，任 銳2，李美娜3

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010019；2 呼和浩特市合創(chuàng)農(nóng)業(yè)科技研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特011500；3 呼和浩特市種子管理站，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

【目的】 研究玉米經(jīng)EMS處理后誘變系與原自交系的蛋白表達機制，為從蛋白質(zhì)組學(xué)角度揭示誘變后選育材料在株高發(fā)生變化及生物產(chǎn)量明顯提高等方面的分子理論奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?以玉米(ZeamaysL.)優(yōu)良自交系A(chǔ)MD16和誘變后選育材料為試材，采用雙向電泳、質(zhì)譜分析以及檢索技術(shù)，比較選育材料與原自交系葉片蛋白質(zhì)組的差異，并對其候選基因進行分離、克隆，構(gòu)建植物表達載體p3300-ZmMDH6，最后進行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定。【結(jié)果】 EMS誘變后選育材料的蛋白質(zhì)組中出現(xiàn)21個差異蛋白質(zhì)點，其中5個蛋白質(zhì)點在選育材料中特異表達，1個蛋白質(zhì)點下調(diào)表達，7個蛋白質(zhì)點上調(diào)表達，有2個差異蛋白質(zhì)點在原自交系中表達，而未在選育材料中表達。通過 MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜測序和 MASCOT 序列分析，鑒定出了15個差異表達蛋白質(zhì)點，其功能涉及生物細胞代謝/能量代謝、防御/抗脅迫、細胞蛋白合成和葉綠素合成等細胞過程。用RT-PCR方法克隆了其候選基因ZmMDH6的編碼區(qū)cDNA，長度1 296 bp，由432個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量46.80 ku，等電點5.79；并構(gòu)建植物表達載體進而轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)檢測證明已獲得T1代轉(zhuǎn)基因植株?！窘Y(jié)論】 玉米誘變系與原自交系在蛋白豐度上存在明顯的差異；差異表達蛋白涉及到各個生長發(fā)育過程，可能與玉米生物產(chǎn)量的提高和株高的改變有密切關(guān)系。

玉米；蛋白質(zhì)組；蘋果酸脫氫酶；基因克??；基因表達

玉米(ZeamaysL.)已成為當今世界上重要的糧食與經(jīng)濟作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的地位[1]。優(yōu)良的玉米自交系是利用玉米雜種優(yōu)勢和發(fā)展玉米產(chǎn)業(yè)的基本材料，也是玉米育種的物質(zhì)載體[2-3]。伴隨農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平的逐漸提高和新品種的不斷推廣應(yīng)用，對玉米優(yōu)良育種材料的要求也越來越高；但在玉米選育過程中，多數(shù)優(yōu)良玉米種質(zhì)資源利用頻率高，品種間相近的親緣關(guān)系使得優(yōu)良基因的利用潛力受到極大限制，因而遺傳基礎(chǔ)狹窄、缺乏持續(xù)選擇的有利基因已成為提高玉米產(chǎn)量、改善品質(zhì)及增強抗性的主要瓶頸，創(chuàng)造出具有豐富遺傳基礎(chǔ)的玉米種質(zhì)資源是目前玉米育種工作者迫切需要解決的首要問題[4]。選用化學(xué)誘變育種EMS-石蠟油誘變玉米成熟花粉技術(shù)現(xiàn)已成為玉米種質(zhì)創(chuàng)新和自交系改良的有效方法。但是，對誘變后代材料的選育及研究工作主要集中于植株農(nóng)藝性狀及突變基因定位等方面[5-7]，而從蛋白質(zhì)組學(xué)角度去揭示株型、產(chǎn)量性狀誘變后變化的相關(guān)報道較少。

目前功能基因組學(xué)已成為后基因組時代的研究重心，蛋白質(zhì)組學(xué)則是其研究熱點，而玉米作為重要的糧食、經(jīng)濟和能源作物，關(guān)于玉米的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)展也在不斷進行中，并涉及到遺傳、生理生化以及脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)研究。Von Wiren等[8]利用雙向電泳技術(shù)對玉米野生型與突變型材料的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究表明，2種不同類型玉米在鐵離子跨膜蛋白中有4個蛋白質(zhì)點存在差異； Damerval等[9]通過對玉米不同近等基因自交系的2D-PAGE圖譜進行分析，從酶學(xué)的角度證明了Opaque 2是因為玉米轉(zhuǎn)錄因子的點突變從而引起的蛋白質(zhì)效應(yīng)，Opaque 2在谷類作物不同代謝過程中具有調(diào)節(jié)作用；Chang等[10]應(yīng)用2D-PAGE圖譜與質(zhì)譜測序方法，研究了35S-Met的攝入量對玉米缺氧脅迫條件下根內(nèi)蛋白質(zhì)合成的影響評價，結(jié)果表明蛋白質(zhì)表達的選擇性可能對玉米生長發(fā)育和細胞功能造成一定影響；Okamoto等[11]對玉米卵母細胞中的主要蛋白質(zhì)組進行研究、鑒定，確定了6個已知功能的蛋白質(zhì)點，并認為在玉米代謝過程中幾種蛋白酶的表達水平在卵母細胞較高。采用蛋白質(zhì)雙向電泳和MALDI-TOF技術(shù)，Hochholdinger Frank等[12]對玉米側(cè)根生長的缺陷突變體與正常野生型根進行蛋白質(zhì)組分析比較，發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白質(zhì)點中有4個蛋白質(zhì)點與木質(zhì)素的代謝相關(guān)。

蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenasa,MDH)是一種普遍存在于自然界各種生物體中的酶類，在動植物細胞中有著重要的生理功能，能夠催化蘋果酸和草酰乙酸的相互轉(zhuǎn)化，并使其植物體內(nèi)的蘋果酸含量增加，進而使植物體對耐酸及鋁毒等非生物脅迫的抗性提高[13-14]。相關(guān)研究表明，蘋果酸脫氫酶在促進植物細胞發(fā)育、植株生長、花粉發(fā)育和果實發(fā)育過程及抗逆性等方面起著重要的作用[15-16]，表明蘋果酸脫氫酶對植物的生長發(fā)育起到重要作用。

本研究以自交系A(chǔ)MD16經(jīng)EMS-石蠟油誘變后選育的材料及原自交系為試材，采用改進后的三氯乙酸-丙酮(TCA)法提取總蛋白質(zhì)，運用雙向電泳、質(zhì)譜分析確定玉米誘變體與原自交系存在差異的候選基因，并對其候選基因蘋果酸脫氫酶(MDH)基因進行分離、克隆，構(gòu)建了植物表達載體p3300-ZmMDH6，進行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定，為進一步研究該基因在玉米抗逆及增產(chǎn)中的作用奠定基礎(chǔ)，同時為玉米種質(zhì)資源的創(chuàng)制以及誘變育種提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取18份優(yōu)良玉米自交系為原始誘變材料，于2011年4月下旬在呼和浩特市合創(chuàng)農(nóng)業(yè)科技研究中心園區(qū)進行種植，并于當年7月中旬開花期利用EMS-石蠟油對玉米成熟花粉進行誘變處理，每個自交系采用5種不同濃度的EMS-石蠟油處理，每個濃度下選取6株，共處理540株，10月對誘變材料進行收獲(EMS-石蠟油處理濃度為0.667×10-3時誘變率最高可達到4.30%)。11月將收獲的M1代誘變材料在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗田進行加代繁殖。2012年同樣進行呼和浩特種植、南繁加代，同時對誘變后代材料連續(xù)進行考查。在對自交系A(chǔ)MD16誘變選育材料與原始材料的考查中發(fā)現(xiàn)其株型(株高、穗位高、葉長、葉寬及雄穗分枝數(shù))、生物產(chǎn)量等指標發(fā)生較大變化，詳見表1。因此，2013年選取株高、生物產(chǎn)量明顯提高的AMD16誘變第4代材料與原自交系A(chǔ)MD16為試材。野生型擬南芥(Ecotype Columbia)為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米遺傳育種實驗室原有保存材料。

1.2 酶與試劑

聚丙烯酰胺凝膠組分為DTT、碘乙酰胺、硫脲、Tris、CHAPS、甘氨酸，均為 Amersham Biosciences公司產(chǎn)品；尿素、考馬斯亮藍、兩性電解質(zhì)載體、固相線性 pH 梯度 IPG 膠條(17 cm,pH 4～7)，均購于美國 Bio-Rad 公司；蛋白定量試劑盒購自上海生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自TaRaKa公司；質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購自天根公司；超表達載體pCAMBIA 3300 (p3300)由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米遺傳育種實驗室保存，北京華大基因公司進行PCR引物的合成與測序任務(wù)。

1.3 玉米葉片總蛋白提取及濃度測定

1.3.1 玉米葉片總蛋白提取 將玉米幼苗培養(yǎng)至3葉期，取3葉期玉米葉片，用超純水清洗、無菌濾紙擦干，然后去掉葉片主脈將其剪成約1 cm左右的小段，液氮速凍保存于-80 ℃?zhèn)溆?。稱取0.3 g速凍玉米葉片，加入0.03 g聚乙烯吡咯烷酮，立即在液氮冷凍條件下研磨至精細粉末狀。吸取4.5 mL的預(yù)冷蛋白質(zhì)提取液Ⅰ(含0.07% β-巰基乙醇的10% 三氯乙酸丙酮溶液) 加入經(jīng)研磨的粉末中，后冰浴研磨2 min，快速轉(zhuǎn)入已預(yù)冷的5 mL離心管中，渦旋混合后于-20 ℃冰箱冷凍放置1 h后，4 ℃下12 000 r/min離心45 min，棄上清液。再吸取 4.5 mL預(yù)冷的蛋白提取液Ⅱ(含 0.07% β-巰基乙醇的丙酮)加入離心管，充分混合，懸浮、振蕩，使其蛋白質(zhì)充分溶解，于-20 ℃冰箱冷凍放置1 h后離心棄上清液。此步驟重復(fù)操作 2 次。再加4.5 mL 預(yù)冷的80%丙酮，然后進行懸浮、振蕩，離心后棄上清液，將沉淀風(fēng)干。干燥后稱重減掉試管質(zhì)量得蛋白質(zhì)干粉質(zhì)量。每毫克蛋白質(zhì)干粉加入0.02～0.03 mL裂解液(9.0 mol/L 尿素、0.2% pH 3～10 兩性電解質(zhì)載體、5% β-巰基乙醇、4% 兩性電解質(zhì)NP40)，對其蛋白質(zhì)溶液進行懸浮、振蕩3 min，并于35 ℃保溫30 min 以上，12 000 r/min離心 45 min，取上清液適量分裝，快速放入-80 ℃冷凍備用。

1.3.2 總蛋白濃度的測定 蛋白質(zhì)樣品的濃度測定參考1976年由Bradford建立的考馬斯亮藍法(Bradford法)。

1.4 蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠電泳及考馬斯亮藍染色

等電聚焦參照 Bio-Rad 公司的雙向凝膠電泳系統(tǒng)使用說明書進行操作，采用固相線性pH梯度IPG膠條(17 cm，pH 4～7)和 IPGphorⅡ系統(tǒng)。吸取0.8 g的蛋白質(zhì)提取液到IPG等電聚焦槽，儀器運行條件設(shè)置為 20 ℃、50 V主動水化16 h，250 V線性除鹽 30 min，500 V快速除鹽30 min，4 000 V線性升壓 3 h，20 000 V/h 快速聚焦和500 V 72 h保持；聚焦完成后，迅速把含蛋白樣品的IPG 膠條放入平衡液Ⅰ(6 mol/L Urea，2.0%SDS，20.0%甘油，0.375 mol/L This-HCl (pH 8.8)， 2.0%DTT)及平衡液Ⅱ(6 mol/L Urea，2.0%SDS，20.0%甘油，0.375 mol/L This-HCl (pH 8.8)，2.5%碘乙酰胺)先后各平衡12～15 min，然后將平衡好的膠條立即轉(zhuǎn)移至 12% SDS-PAGE 均勻分離膠(厚度為1 mm)上端，并使兩膠面緊密接觸，排凈氣泡后用 1%低熔點瓊脂糖進行封膠。最后將板膠置于 Ettan Dalt six(GE Healthcare，USA)系統(tǒng)中進行第二向變性膠恒溫(25 ℃)電泳，電泳功率參數(shù)設(shè)置為 120 V/膠 0.5 h，180 V/膠 6 h。

雙向電泳結(jié)束后，先將電泳膠板放入固定液中固定30 min，然后采用考馬斯亮藍染色法，將凝膠在染色液中慢速搖動染色4 h以上，不可超過12 h，染色后轉(zhuǎn)移至脫色液中搖動脫色，其間可以更換脫色液1～2次，直至膠板背景清晰、無色。

1.5 玉米葉片總蛋白雙向電泳凝膠圖譜分析

考馬斯亮藍染色后的凝膠經(jīng)UMAX Powerlook 2100XL透射掃描獲取清晰電泳凝膠圖像，光學(xué)分辨率一般為600 dpi，其對比度與亮度均采用軟件默認值。掃描后獲得的凝膠圖像用PDQUEST 8.0軟件進行背景消減、斑點檢測、匹配及獲取斑點位置坐標等分析比對。

1.6 差異蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定與匹配搜索

本試驗對21個差異表達蛋白質(zhì)點進行脫色和膠上原位消化、酶解操作；將其酶解后的肽混合物送往中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，對其進行MALDI-TOF-MS測序分析，其中 15個蛋白質(zhì)點獲得肽質(zhì)量指紋圖，運用軟件 MASCOT (http://www.matrixscience.com/)選擇 NCBI 數(shù)據(jù)庫進行 PMF分析獲得鑒定結(jié)果。

1.7 基因克隆與測序

根據(jù)本研究中差異蛋白質(zhì)點質(zhì)譜測序獲得的ZmMDH6(登錄號Accession No.gi|162462- 055)基因，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取其全長cDNA序列，在其編碼區(qū)設(shè)計正向引物5′-GCTCTAGAGCCCAAAGCCACTCCCAAAC-3′(下劃線為正向引物BamHⅠ位點)和反向引物5′-CGGGATCCCGGTCGAAATCACAGGCAAA-3′(下劃線為反向引物XbaⅠ位點)；提取AMD16誘變后選育材料幼苗期葉片的總RNA，并以其反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系總體積為25 μL，包括10 mmol/L dNTP mix 2.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 0.25 μL，ExTaq酶(5 U/μL) 0.25 μL，ddH2O 18 μL。反應(yīng)程序為:94 ℃ 3 min； 94 ℃40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收，將回收后的目的片段與克隆載體 pMD19-T(TaKaRa)進行連接，隨后進行大腸桿菌DH5α的轉(zhuǎn)化，將PCR鑒定為陽性克隆的菌液送往北京華大基因公司測序。

1.8 植物表達載體的構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

分別選用BamHⅠ和XbaⅠ將已構(gòu)建好的克隆載體pMD19-T-ZmMDH6和超表達載體pCAMBIA 3300(p3300)空質(zhì)粒進行雙酶切，回收目的基因小片段與載體基因大片段，將二者用T4 DNA連接酶連接，然后進行大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞的遺傳轉(zhuǎn)化。挑取顏色、形態(tài)均正常的單菌落搖菌，用ZmMDH6基因特異性引物進行菌液PCR的擴增與鑒定(方法同1.7節(jié))，陽性克隆菌液用質(zhì)粒小提試劑盒(天根公司)提取質(zhì)粒DNA，隨后用BamHⅠ和XbaⅠ內(nèi)切酶再進行酶切鑒定。預(yù)先制備GV3101根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞：取1 μL構(gòu)建好的表達載體p3300-ZmMDH6質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，挑取平板上顏色、形態(tài)正常的單菌落搖菌，用ZmMDH6基因特異性引物進行菌液PCR鑒定(方法同1.7節(jié))，陽性克隆保存于-76 ℃，同時選擇陽性克隆用于擬南芥轉(zhuǎn)化。

1.9 玉米半定量RT-PCR分析

將玉米β-Actin基因作為內(nèi)參基因進行 RT-PCR 反應(yīng)，每個反應(yīng)設(shè)2次重復(fù)。將玉米供試材料的cDNA 稀釋10 倍后作為模板，引物設(shè)計在基因的 3′非編碼區(qū)，β-Actin的上下游引物分別為5′-AAATGACGCAGATTATGTTTGA-3′和5′-GCTCGTAGTGAGGGAGTACC-3′。PCR反應(yīng)體系為10×Buffer 1.5 μL，dNTP 1.2 μL，ExTaq酶(5 U/μL) 0.15 μL，正、反向引物(10 μmol/L) 各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 10.15 μL，終體積15 μL。擴增程序為94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，25個循環(huán)；最后72 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.10 擬南芥的轉(zhuǎn)化與鑒定

將野生型擬南芥(Ecotype Columbia)種子在實驗室培養(yǎng)20 d左右，按照沾花法將預(yù)先配制好的農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)化野生型擬南芥?；旌鲜斋@轉(zhuǎn)化植株種子得到T1代遺傳轉(zhuǎn)化種子，將T1代種子播種，于出苗后20 d用0.5‰的除草劑PPT(phosphinothricin)噴霧并篩選其陽性擬南芥植株，大約在1周后非轉(zhuǎn)化植株枯黃、死亡，而獲得轉(zhuǎn)化的擬南芥則生長正常。提取經(jīng)PPT噴霧篩選后生長正常的擬南芥植株基因組DNA，然后用ZmMDH6基因特異性引物通過PCR(方法同1.7節(jié))鑒定擬南芥陽性植株。同時，為了避免擴增出擬南芥內(nèi)源MDH基因序列，確保擬南芥轉(zhuǎn)基因株系鑒定的真實可靠，選用載體上的篩選標記基因bar進行擴增鑒定，以質(zhì)粒為正對照,非轉(zhuǎn)基因擬南芥為負對照。用于擴增標記基因的正向引物為5′-CCAGAAACCCACGTCATGCC-3′，反向引物為5′-CAGGAACCGCAGGAGTGGA-3′，基因擴增產(chǎn)物長度為370 bp。擴增程序為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)32次；72 ℃延伸8 min。PCR反應(yīng)體系為10×Buffer 2.5 μL，ExTaq酶(5 U/μL) 0.2 μL，dNTP 2.0 μL，正、反向引物(10 μmol/L) 各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 17.3 μL，終體積25 μL。產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測、鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米幼苗葉片雙向電泳圖像分析

本研究采用三氯乙酸-丙酮法分別提取玉米優(yōu)良自交系A(chǔ)MD16原始材料及其誘變系選育材料的幼苗3葉期葉片總蛋白質(zhì)，經(jīng)蛋白濃度定量后進行雙向電泳分析，得到了重復(fù)性與分辨率都較好的 2-D 圖像(圖1)。對電泳圖譜采用PDQUEST 8.0軟件進行分析、比較，發(fā)現(xiàn)2個處理材料的2-D電泳圖譜十分接近，在蛋白質(zhì)等電點為4.0～7.0，分子質(zhì)量為8.0～100.0 ku 的雙向電泳圖譜上，分別平均鑒定出436與457個清晰的蛋白質(zhì)點，2個處理的蛋白質(zhì)點圖譜匹配率達到 92%，大多數(shù)蛋白質(zhì)點主要集中在15.0～94.0 ku、等電點在5.0～6.5，表明2個處理材料之間的蛋白質(zhì)存在差異，但其表達數(shù)量和種類大致相同，僅有少量蛋白質(zhì)發(fā)生了變化，這些差異蛋白可用于進一步分析研究。

2.2 玉米誘變系與原自交系蛋白質(zhì)差異表達譜分析

本研究使用PDQUEST 8.0軟件對自交系A(chǔ)MD16和經(jīng)EMS誘變后選育材料苗期葉片蛋白質(zhì)電泳圖譜進行分析，共獲得21個差異蛋白質(zhì)點(圖1)，其中5個蛋白質(zhì)點在誘變后的選育材料中特異表達，7個蛋白質(zhì)點上調(diào)表達，只有1個蛋白質(zhì)點下調(diào)表達，并且2個差異蛋白質(zhì)點僅在原自交系中表達，未在選育材料中表達；這些差異表達蛋白質(zhì)點經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜測序，從21個差異表達的蛋白質(zhì)點中成功測定出15個，運用MASCOT對其進行序列分析。圖2顯示了部分差異表達蛋白質(zhì)點的局部放大圖，有8個差異蛋白質(zhì)點在2個不同材料中同時出現(xiàn)，其蛋白質(zhì)點編號為1、2、3、5、8、15、17和18，其中蛋白質(zhì)點1、2、3、5、15、17和18在誘變后代材料中呈上調(diào)表達，而蛋白質(zhì)點8在誘變后代材料中呈下調(diào)表達；在誘變后代材料中呈特異表達的蛋白質(zhì)點有5個，它們分別為14、20、21、22、和25，而蛋白質(zhì)點19和23在原自交系中特異表達。

2.3 玉米誘變系與原自交系差異表達蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定

在21個差異表達蛋白質(zhì)點中，對其中的15個蛋白質(zhì)點進行了質(zhì)譜鑒定(表2)，而其他6個蛋白質(zhì)點由于其蛋白豐度、蛋白酶切特性和得分不夠未能鑒定出有意義的結(jié)果。功能分類表明，差異表達蛋白涉及生物細胞代謝/能量代謝、防御/抗脅迫、細胞蛋白合成和葉綠素合成等細胞過程；另外，還有4個未知功能的蛋白。其中，參與生物細胞代謝/能量代謝的蛋白質(zhì)最多，其次是細胞蛋白合成類的蛋白。按照相應(yīng)蛋白質(zhì)點的等電點和匹配肽段的多少與得分進行分析后，從中確定了4個候選蛋白質(zhì)點，分別為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、50S核糖體蛋白、β-D-葡萄糖苷酶和蘋果酸脫氫酶(MDH)。

2.4 玉米ZmMDH6基因的克隆

采用植物總RNA提取試劑盒提取玉米幼苗葉片總RNA(圖3)，以其反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用ZmMDH6基因編碼區(qū)的特異性引物進行PCR擴增，獲得預(yù)期長度為1 296 bp的目的片段(圖4)。將該片段與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌液PCR檢測獲得陽性克隆,測序結(jié)果表明，獲得由1 296 bp組成且序列正確的ZmMDH6編碼區(qū)cDNA。該編碼區(qū)蛋白由432個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量約為46.80 ku，等電點為5.79。

2.5 玉米半定量RT-PCR檢測

為了確定玉米誘變系材料基因組中ZmMDH6基因是否表達量上升，將玉米β-Actin作為內(nèi)參基因，以原自交系和誘變系的cDNA為模板，通過半定量RT-PCR方法分別對2個重復(fù)材料進行了檢測，結(jié)果(圖5)表明ZmMDH6在2個誘變系材料中都有較高水平的表達，但在2個原始自交系中表達量較低，2次重復(fù)試驗的結(jié)果基本一致，確定該基因在玉米誘變系中呈上調(diào)表達，明確了觀察到的MDH蛋白積累增多是基于其轉(zhuǎn)錄激活。因此可以將表達量較高的誘變系材料用于擬南芥轉(zhuǎn)基因研究。

2.6 ZmMDH6植物表達載體的構(gòu)建

利用內(nèi)切酶BamHⅠ與XbaⅠ對含有ZmM-DH6基因編碼區(qū)的cDNA片段和植物表達載體p3300進行雙酶切，然后將酶切后的目的片段再用T4 DNA連接酶連接到植物表達載體p3300的CaMV35S啟動子，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，分別進行菌液PCR 檢測與質(zhì)粒的酶切鑒定，均獲得與預(yù)期大小一致的目的條帶(圖6和7)，結(jié)果證明其表達載體構(gòu)建成功(圖8)，并命名為p3300-ZmMDH6。通過凍融法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，挑取顏色、形狀正常的單菌落搖菌，并進行菌液PCR鑒定，陽性克隆在-76 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7 擬南芥轉(zhuǎn)化及陽性植株的檢測和鑒定

用帶有p3300-ZmMDH6載體的農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，收獲擬南芥種子，得到T1代種子；將獲得的T1代種子播種于小花盆中，3～4周后用篩選劑PPT對擬南芥幼苗進行噴霧篩選，因為本試驗所使用的植物表達載體p3300上含有PPT抗性基因，因而在播種1周后未轉(zhuǎn)化的野生型幼苗枯黃、死亡，而含有轉(zhuǎn)基因成分的幼苗存活下來。將T1代種子經(jīng)篩選劑PPT幼苗噴霧篩選后，得到了12株抗PPT的植株。對其中10株陽性克隆的株系進行基因組DNA的提取，利用ZmMDH6基因特異性引物進行PCR擴增檢測，結(jié)果表明有9株得到了與預(yù)期目的片段大小一致的條帶(1 296 bp)，初步表明其目的基因ZmMDH6已插入擬南芥植株的基因組DNA中(圖9)。

將擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中呈陽性克隆的株系進行基因組DNA提取，利用植物表達載體p3300標記基因bar的特異性引物進行PCR擴增檢測，以質(zhì)粒為正對照，非轉(zhuǎn)基因擬南芥植株為負對照。結(jié)果(圖10)表明：在質(zhì)粒正對照和3個轉(zhuǎn)基因株系中均檢測出與預(yù)期目的片段大小一致的條帶(370 bp)，而非轉(zhuǎn)基因植株中無該目的片段表達。表明含目的基因ZmMDH6的表達載體已成功插入擬南芥植株的基因組DNA中。

3 討 論

3.1 玉米苗期葉片差異蛋白質(zhì)的表達模式與功能

研究表明，在利用EMS-石蠟油誘變玉米成熟花粉的育種過程中，誘變后代材料的變異多發(fā)生于株高、葉寬等農(nóng)藝性狀的變異，并且其中的大部分變異屬于基因的點突變[17]。在一般情況下，如果植物生長較快，其呼吸代謝強度也將增高，與代謝有關(guān)的酶類活性也升高；而生長較慢的植物其呼吸代謝強度偏低，相應(yīng)酶類的活性也低[18]；植物呼吸作用產(chǎn)生的中間產(chǎn)物是合成蛋白質(zhì)、脂肪和核酸等重要有機物的原料，因此呼吸作用直接影響植物體內(nèi)各種物質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)化[19]。本研究中，與原自交系相比，誘變后選育材料參與生物細胞呼吸代謝的差異蛋白質(zhì)點的表達量均呈上調(diào)趨勢，可能是隨著植物生長發(fā)育的加快，表達量增加。同時，本研究中參與生物細胞蛋白合成的差異蛋白(蛋白質(zhì)點21)為誘變后代材料的特異表達蛋白，而蛋白質(zhì)點18為誘變后代材料的上調(diào)表達蛋白，這些蛋白可能參與了細胞蛋白的合成；而功能預(yù)測表明，蛋白質(zhì)點2、5、14與15可能參與植物細胞的生長代謝活動，為植物生長發(fā)育提供更多的能量和中間產(chǎn)物，與玉米株高的改變和生物產(chǎn)量的提高有著密切聯(lián)系。另幾個未知蛋白質(zhì)點1、8、17、19、20、22和25，一方面可能參與植物體內(nèi)某些代謝活動；也可能與植物生長發(fā)育和干物質(zhì)的積累有著密切關(guān)系。

3.2 玉米誘變與原材料候選蛋白質(zhì)點的功能

在玉米EMS誘變育種研究過程中，誘變后代一般從M2代開始選擇，成株期的質(zhì)量性狀發(fā)生明顯變異的較少，但株高、穗位高和葉型等數(shù)量性狀發(fā)生變化明顯[20]。因此運用蛋白質(zhì)組學(xué)進行分析，對了解玉米EMS誘變處理發(fā)生變化的原因及其對該過程的調(diào)節(jié)具有重要作用。

本研究中蛋白質(zhì)點 2、14、15分別被鑒定為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和烯醇化酶Ⅱ，與原自交系相比，在誘變后的選育材料中這些蛋白質(zhì)點均呈上調(diào)趨勢。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為生物體內(nèi)糖酵解過程的一個重要酶，在各種生物體的細胞內(nèi)能夠催化甘油醛-3-磷酸進行氧化磷酸化成為1,3-二磷酸甘油酸[21-22]。通常認為，甘油醛-3-磷酸在進行氧化磷酸化過程中，GAPDH能夠催化Cys149巰基和底物醛基形成半縮醛，而后脫氫再生成一個酰化酶，隨之底物脫下的氫則被NAD+所接受[23]。同時，GAPDH如果在氧化脅迫條件下也可參與多種有利于糖分解與糖異生過程中的生理生化途徑，將對植物的生長產(chǎn)生有利的影響。相關(guān)研究表明，蘋果酸脫氫酶(MDH)可促進草酰乙酸鹽氧化形成蘋果酸鹽，從而使植物體內(nèi)的蘋果酸含量增加，顯著增強植物體的耐酸性以及對鋁毒的抗性[24]。Gallardo等[25]在轉(zhuǎn)化cpMDH基因的煙草研究中發(fā)現(xiàn)，當煙草中葉綠體MDH高表達時會促進植物體內(nèi)L-蘋果酸的增加，MDH表達量的高低也影響了植物的碳同化、代謝過程。本研究中，誘變后代從株高、穗位高和生物產(chǎn)量等數(shù)量性狀上都發(fā)生了明顯變化，這與刁鈺嬋等[20]的研究結(jié)果一致，同時也說明在生物細胞內(nèi)相關(guān)酶類的變化以及表達量的高低直接影響植物的代謝和生長。

3.3 玉米誘變與差異候選基因ZmMDH6的功能

許云峰等[26]利用EMS誘變劑對小麥品種煙農(nóng)15進行誘變處理，經(jīng)過M2代和M3代篩選鑒定，得到11個農(nóng)藝性狀發(fā)生明顯變異的突變系；徐艷花等[27]利用EMS誘變處理豫農(nóng)201的小麥種子，對M2代植株進行農(nóng)藝性狀及其他生物學(xué)性狀的表型篩選，并運用SDS-PAGE對突變體的高分子量麥谷蛋白亞基進行分析，得到了21個缺失不同類型亞基的突變體。研究表明，植物體內(nèi)的蘋果酸脫氫酶(MDH)是糖異生、光合作用、TCA循環(huán)以及多個穿梭系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶類之一，其變化能夠引起植物體內(nèi)其他物質(zhì)含量的變化，從而影響植物的抗脅迫應(yīng)答[28-30]。張建斌等[31]對香蕉蘋果酸脫氫酶基因進行克隆并對其逆境脅迫表達進行了研究，結(jié)果表明：MDH基因在植物耐鹽、抗冷及延緩衰老等逆境中發(fā)揮著重要作用，并且MDH基因的高表達可使轉(zhuǎn)基因植株ATP含量升高、呼吸速率加快，同時具有更高的抗氧化酶活性和較低的活性氧含量、相對電導(dǎo)率和MDH含量，說明蘋果酸脫氫酶基因可以提高植物對鹽害和冷害等非生物脅迫的抵抗能力，為植物生長發(fā)育提供足夠多的能量，保證植物的正常生長發(fā)育從而提高產(chǎn)量。

本研究中的誘變后代材料在株高、葉寬及生物產(chǎn)量上明顯高于其原自交系，同時蘋果酸脫氫酶(MDH)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的蛋白質(zhì)點的表達量均呈顯著上調(diào)趨勢。初步認為蘋果酸脫氫酶(MDH )和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)在誘變體中的上調(diào)表達可能是造成植株生長較快、生物產(chǎn)量較高的原因。賈晉等[32]對大白菜蘋果酸脫氫酶基因進行克隆及序列分析研究，發(fā)現(xiàn)大白菜花蕾敗育過程可能與其體內(nèi)的蘋果酸脫氫酶基因mRNA表達量下降有關(guān)，并獲得了大白菜蘋果酸脫氫酶基因cDNA的全長序列(1 209 bp)，該序列編碼403個氨基酸；利用該序列推導(dǎo)的氨基酸序列與擬南芥中的蘋果酸脫氫酶進行對比，發(fā)現(xiàn)其同源性為100%。 因此，本研究對蘋果酸脫氫酶基因進行了分離、克隆，并構(gòu)建植物表達載體，對野生型擬南芥進行遺傳轉(zhuǎn)化研究，為進一步研究該基因在玉米抗逆與增產(chǎn)中的作用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究通過對玉米經(jīng)EMS誘變后的選育材料與原自交系苗期葉片總蛋白質(zhì)組的比較分析，發(fā)現(xiàn)誘變后選育材料與原自交系葉片蛋白質(zhì)組有明顯的差異，而且生長發(fā)育較快的誘變后選育材料與原自交系差異蛋白質(zhì)相比，大部分呈上調(diào)趨勢，并有特異蛋白質(zhì)出現(xiàn)；差異蛋白質(zhì)分別參與生物細胞代謝/能量代謝、防御/抗脅迫、細胞蛋白合成及葉綠素合成等細胞過程；同時，玉米誘變系與原自交系在蛋白豐度上存在明顯的差異；差異表達蛋白涉及到各個生長發(fā)育過程，可能與玉米生物產(chǎn)量的提高和株高的改變有密切關(guān)系。本研究進一步通過RT-PCR 方法克隆了差異候選基因ZmMDH6的編碼框cDNA，獲得了由1 296 bp組成且序列正確的ZmMDH6編碼區(qū)cDNA，其編碼蛋白由432個氨基酸殘基組成，分子量46.80 ku，等電點5.79；將構(gòu)建的植物表達載體成功轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，而且對已獲得T1代轉(zhuǎn)基因株系進行分子水平檢測、鑒定，為進一步研究該基因在玉米抗逆與增產(chǎn)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[1] 陳俊意,徐 莉.玉米自交系遺傳多樣性的SSR分析 [J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2009,2(1):29-31.

Chen J Y,Xu L.Genetic diversity revealed by SSR analysis in 33 maize(ZeamaysL.) [J].Southwest China Journal of Agricultural Sciences,2009,2(1):29-31.(in Chinese)

[2] 李美娜,逯曉萍,張瑞霞,等.玉米自交系主要農(nóng)藝性狀遺傳參數(shù)的研究 [J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2004,25(2):40-43.

Li M N,Lu X P,Zhang R X,et al.Study on genetic paraneter of main agnoromic characteristics in maize inbreed line [J].Journal of Inner Mongolia Agricultural University,2004,25(2):40-43.(in Chinese)

[3] 王 亮,景希強,周旭梅,等.13個玉米自交系配合力及通徑分析 [J].農(nóng)業(yè)科技與裝備,2009(4):1-4.

Wang L,Jing X Q,Zhou X M,et al.Analysis of combining ability and path on 13 maize inbred lines [J].Agricultural Scien-ce & Technology and Equipment,2009(4):1-4.(in Chinese)

[4] 劉祥久,劉曉麗.利用EMS誘發(fā)玉米性狀變異的效果 [J].雜糧作物,2010,30(2):88-90.

Liu X J,Liu X L.Effect on maize trait variation of EMS-induced [J].Rain Fed Crops,2010,30(2):88-90.(in Chinese)

[5] 薛守旺,周洪生.利用花粉化學(xué)誘變創(chuàng)造玉米自交系的研究 [J].作物雜志,1998(6):6-8.

Xue S W,Zhou H S.Study on maize inbred lines by pollen chemical mutagenesis [J].Crops Magazine,1998(6):6-8.(in Chinese)

[6] 劉治先.玉米育種新技術(shù) [J].玉米科學(xué),1995,3(4):12-15.

Liu Z X.New techniques of maize breeding [J].Maize Sience,1995,3(4):12-15.(in Chinese)

[7] 孫 躍,楊仲南,崔永蘭.擬南芥白化突變體EMS30的基因定位與分析 [J].植物生理學(xué)報,2011,47(3):263-268.

Sun Y,Yang Z N,Cui Y L.Genetic mapping and analysis of albino geneEMS30 inArabidopsisthaliana[J].Plant Physiology Journal,2011,47(3):263-268.(in Chinese)

[8] Von Wiren N,Peltier J B,Rouquie D,et al.Four root plasmalemma polypeptides under-represented in the maize mutant ys1 accumulate in a Fe-efficient genotype in response to iron-deficiency [J].Plant Physiology and Biochemistry,1997,35:945-950.

[9] Damerval C,Guilloux M L.Characterization of novel proteins affected by the O2mutation and expressed during maize endosperrm development [J].Molecular and General Genetics,1998,257:354-361.

[10] Chang W W,Huang L,Shen M,et al.Patterns of protein symthesis and tolerance of anoxia in root tips of maize seedlings acclimated to a low-oxygen environment,and identification of proteins by mass spectrometry [J].Plant Physiology,2000,122:295-318.

[11] Okamoto T,Higuchi K,Shinkawa T,et al.Identification of major proteins in maize egg cells [J].Plant Cell Physiology,2004,45:1406-1412.

[12] Hochholdinger Frank,Guo Lin,Patrick S Schnable.Lateral roots affect the proteome of the primary root of maize (ZeamaysL.) [J].Plant Molecular Biology,2004,56(3):397-412.

[13] Ma J F,Ryan P R,Delhaize E.Aluminium tolerance in plants and the complexing role of organic acids [J].Trends in Plant Science,2001,6:273-278.

[14] Kochian L V,Hoekenca O A,Pineros M A.How do crop plants tolerate acid soils:Mechanisms of aluminum tolerance and phosphorous efficiency [J].Annual Revuews of Plant Biology,2004,55:459-493.

[15] Yao X Y,Li M, Zhai H,et al.Isolation and characterization of an apple cytosolic malate dehydrogenase gene reveal its function in malate synthesis [J].Plant Physiology,2011,168(5):474-480.

[16] Yao X Y,Dong Q L,Zhai H,et al.The functions of an apple cytosolic malate dehydrogenase gene in growth and tolerance to cold and salt stresse [J].Plant Physiology and Biochemistry,2011,49:257-264.

[17] 張必良,王 瑋.RNA在核糖體催化蛋白質(zhì)合成中的作用 [J].中國科學(xué),2009,39(1):69-77.

Zhang B L,Wang W.RNA effect on ribonuclease catalytic protein synthesis [J].Science in China,2009,39(1):69-77.(in Chinese)

[18] 向 洋,丁志寶,吳筱媚,等.植物生長調(diào)節(jié)劑對呼吸作用及光合作用等有關(guān)性狀的影響(Ⅲ) [J].長沙電力學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,1997,12(1):106-109.

Xiang Y,Ding Z B,Wu Y M,et al.Effect of plant growth regulators on the respiration and photosynthesis of relevant traits [J].Journal of Changsha University of Electric Power:Naturals Science,1997,12(1):106-109.(in Chinese)

[19] 李志霞,秦嗣軍,呂德國,等.植物根系呼吸代謝及影響根系呼吸的環(huán)境因子研究進展 [J].植物生理學(xué)報,2011,47(10):957-966.

Li Z X,Qin S J,Lü D G,et al.Research progress in root respiratory metabolism of plant and the environmental influencing factors [J].Plant Physiology Journal,2011,47(10):957-966.(in Chinese)

[20] 刁鈺嬋,陳志斌,焦 楊,等.EMS誘變玉米花粉M2代生物學(xué)效應(yīng)研究 [J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(3):33-36.

Diao Y C,Chen Z B,Jiao Y,et al.The biological effects of M2 generation by EMS inducing maize pollens [J].Henan Agricultural Sciences,2008(3):33-36.(in Chinese)

[21] 盧 倩,弭曉菊,崔繼哲.植物甘油醛-3-磷酸脫氫酶作用機制的研究進展 [J].生物技術(shù)通報,2013(8)：1-6.

Lu Q,Mi X J,Cui J Z.Research advances on the mechanism of glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase in plant [J].Biotechnology Bulletin,2013(8)：1-6.(in Chinese)

[22] 宋時英,郭 劍,李 軍,等.甘油醛-3-磷酸脫氫酶結(jié)構(gòu)的保守性 [J].生物物理學(xué)報,1998,14(3):401-406.

Song S Y,Guo J,Li J,et al.Conservative of glyceraldehydes-3-phosphate structure [J].Acta Biophysica Sinica,1998,14(3):401-406.(in Chinese)

[23] 梁 穎,李玉花.植物中磷酸甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)在氧化脅迫下的生理功能 [J].植物生理學(xué)通訊,2009,45(10):1027-1032.

Liang Y,Li Y H.Physiological functions of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in plants under oxidative stress condition [J].Plant Physiology Communications,2009,45(10):1027-1032.(in Chinese)

[24] 王曉云,畢玉芬.植物蘋果酸脫氫酶研究進展 [J].生物技術(shù)通報,2006(4):44-47.

Wang X Y,Bi Y F.Research progress of plant malate dehydrogenase [J].Biotechnology Bulletin,2006(4):44-47.(in Chinese)

[25] Gallardo F,Miginiac-Maslow M,Sangwan R S,et al.Monocotyledonous C4 NADP(+)-malate dehydrogenase is efficiently synthesized,targeted to chloroplasts and processed to an active form in transgenic plants of the C3 dicotyledon tobacco [J].Planta,1995,197(2):324-332.

[26] 許云峰,蔣方山,郭 營，等.EMS誘導(dǎo)小麥品種煙農(nóng)15突變體的鑒定和EST-SSR分析 [J].核農(nóng)學(xué)報，2008,22(4):410-414.

Xu Y F,Jiang F S,Guo Y,et al.Identification and EST-SSR analysis of mutants from wheat variety/yannong 15 induced by EMS [J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2008,22(4):410-414.(in Chinese)

[27] 徐艷花,陳 鋒,董中東,等.EMS誘變的普通小麥豫農(nóng)201突變體庫的構(gòu)建與初步分析 [J].麥類作物學(xué)報,2010,30(4):625-629.

Xu Y H,Chen F,Dong Z D,et al.Construction and analysis of EMS induced mutant library of hexaploid wheat cultivar Yunong 201 [J].Journal of Triticeae Crops,2010,30(4):625-629.(in Chinese)

[28] 姜瑞華,林長發(fā),申國安,等.水稻蘋果酸脫氫酶基因的克隆及其在E.coli中的表達 [J].復(fù)旦學(xué)報:自然科學(xué)版,2002,41(1):67-69.

Jiang R H,Lin C F,Shen G A,et al.Cloning of the rice cytoplasmic malic dehydrogenase gene(RcMDH) and its expression inE.coli[J].Journal of Fudan University:Natural Science,2002,41(1):67-69.(in Chinese)

[29] 鄧秋菊,劉菊華,金志強,等.香蕉果實采后成熟過程中蘋果酸脫氫酶(MDH)及蘋果酸含量的變化 [J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,31(7):34-38.

Deng Q J,Liu J H,Jin Z Q,et al.Changes of malate dehydrogenase and malic acid content during the ripening of banana fruit [J].Chinese Journal of Tropical Agriculture,2011,31(7):34-38.(in Chinese)

[30] 汪新穎,王 波,侯松濤,等.蘋果酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)及功能 [J].生物學(xué)雜志,2009,26(4):69-72.

Wang X Y,Wang B,Hou S T,et al.Structure and function of malate dehydrogenase [J].Journal of Biology,2009,26(4):69-72.(in Chinese)

[31] 張建斌,賈彩紅,鄧秋菊,等.香蕉蘋果酸脫氫酶基因克隆及其逆境脅迫表達 [J].西北植物學(xué)報,2012,32(10):1942-1949.

Zhang J B,Jia C H,Deng Q J,et al.Cloning and expression analysis of MaMDH in banana under environmental stress [J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2012,32(10):1942-1949.(in Chinese)

[32] 賈 晉,張魯剛.大白菜蘋果酸脫氫酶基因的克隆及序列分析 [J].園藝學(xué)報,2009,36(3):363-368.

Jia J,Zhang L G.Cloning and sequence analyzing of malate dehydrogenase gene in chinese cabbage [J].Acta Horticulturae Sinica,2009,36(3):363-368.(in Chinese)

Function analysis of proteomic and differential genes of plant height between mutagenic line and control inbred of maize

Lü Er-suo1,LU Xiao-ping1,WANG Shu-yan1,XUE Chun-lei2,HAN Ping-an1,DONG Jing1,REN Rui2,LI Mei-na3

(1CollegeofAgronomy,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot,InnerMongolia010019,China; 2HuhhotHechuangAgricultureScientificResearchCenter,Huhhot,InnerMongolia011500,China;3HuhhotSeedManagementStation,Huhhot,InnerMongolia010020,China)

【Objective】 This paper studied the expression differences of mutagenic line and inbred line of maize through proteomic analysis to provide reference for improving plant height and biomass of mutagenic maize line.【Method】 The proteomic differences of mutagenesis and inbred line AMD16 were compared using two-dimensional gel electrophoresis (2-DE),MALDI-TOF-MS mass spectrometry and retrieval technology,and the candidate genes were separated and cloned to construct plant expression vector p3300-ZmMDH6 before being introduced intoArabidopsisand identified.【Result】 The proteome of mutagenic line contained 21 differentially expressed protein spots,including 5 specifically expressed spots,7 up-regulated spots and 1 down-regulated spots.Meanwhile there were two differences expressed in inbred line AMD16,but not expressed in the breeding materials.15 of them were identified as homologous to known proteins in the databases by MALDI-TOF-MS and MASCOT analysis,and its functions involved in biological cell metabolism/energy metabolism,defense/stress responses,protein synthesis in cells,and chlorophyll synthesis.The complete coding region cDNA ofZmMDH6 was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).The genes had the length of 1 296 bp and constituted 432 amino acid residues with molecular of 46.80 ku and pI of 5.79.The plant expression vector for the gene was constructed and introduced intoArabidopsis.The T1transgenic plants were identified by PCR.【Conclusion】 Protein abundance was significantly different between mutagenic line and inbred line of maize.The different expression of protein involved in all growth and development processes,indicating that it related to biomass and plant height.

maize (ZeamaysL.);proteome;MDH;gene cloning;gene expression

2014-10-31

內(nèi)蒙古自治區(qū)科學(xué)技術(shù)項目(20131410)；內(nèi)蒙古呼和浩特科學(xué)技術(shù)項目(2013-重-計-1)

呂二鎖(1986-),男,內(nèi)蒙古包頭人,在讀博士,主要從事作物遺傳育種及生物技術(shù)研究。

逯曉萍(1960-),女,內(nèi)蒙古呼和浩特人，教授,博士,博士生導(dǎo)師,主要從事作物遺傳育種及生物技術(shù)研究。 E-mail:LXP1960@163.com

時間:2015-05-11 15:02

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.006

S513.01

A

1671-9387(2015)06-0088-11

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1502.006.html