王美娟，王 洋，申澤丹，馬旭君，撒 剛，鄧澍榮，劉丹丹，張玉紅，沈 昕，陳少良

(1 北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院，北京 100083；2 房山區(qū)琉璃河鎮(zhèn)大陶村委會，北京 102403)

胡楊PeSOS1對擬南芥鹽誘導H2O2信號途徑的調控

王美娟1，王 洋1，申澤丹1，馬旭君1，撒 剛1，鄧澍榮1，劉丹丹2，張玉紅1，沈 昕1，陳少良1

(1 北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院，北京 100083；2 房山區(qū)琉璃河鎮(zhèn)大陶村委會，北京 102403)

【目的】 研究胡楊質膜Na+/H+逆向轉運蛋白(SOS1)通過H2O2信號途徑對鹽脅迫的感知和適應作用?！痉椒ā?克隆胡楊質膜SOS1基因(PeSOS1)，并將其轉化到擬南芥中，比較野生型和轉PeSOS1基因擬南芥在100 mmol/L NaCl脅迫下的萌發(fā)率，根長，干質量，K+、Na+和Ca2+含量，活體植株根尖離子流(K+、Na+和 H+)的流動情況，H2O2的產生和抗氧化酶活性的變化以及抑制劑對根尖離子流的影響，分析100 mmol/L NaCl脅迫下異源表達PeSOS1基因擬南芥與野生型擬南芥耐鹽性的差異?！窘Y果】 在NaCl脅迫下，轉PeSOS1基因擬南芥株系的萌發(fā)率、根長和干質量明顯高于野生型擬南芥；轉PeSOS1基因擬南芥K+和Ca2+含量也高于野生型擬南芥，而Na+含量較野生型擬南芥低。100 mmol/L NaCl處理后，轉PeSOS1基因擬南芥中K+和Na+的平衡(K+/Na+值)與NaCl脅迫前相比下降幅度較小。轉PeSOS1基因植株在NaCl脅迫下能更快地產生H2O2，并使抗氧化酶保持較高的活性。SOS1抑制劑阿米洛利(Amiloride)對NaCl脅迫下野生型和轉基因擬南芥根尖離子流的變化有明顯影響，用質膜NADPH氧化酶抑制劑DPI (抑制H2O2的產生)處理后，轉PeSOS1基因擬南芥根尖K+內流減弱，Na+外流和H+內流增強，植株維持K+和Na+平衡的能力減弱?！窘Y論】 在擬南芥中異源表達PeSOS1基因可促進H2O2快速產生，維持了SOS1 mRNA的穩(wěn)定性，調控了K+和Na+平衡，并激活了抗氧化防御系統(tǒng)，因而顯著提高了其耐鹽性。

胡楊；鹽脅迫；轉基因擬南芥；質膜Na+/H+逆向轉運蛋白(SOS1)；H2O2信號；K+/Na+平衡；離子流

質膜Na+/H+逆向轉運蛋白(SOS1)基因在植物抗鹽中的重要作用已廣為人知。2007年，Wu等[1]用RACE技術克隆了胡楊SOS1蛋白的基因PeSOS1 (GenBank登錄號:DQ517530.1)，其cDNA全長為3 665 bp，包含一個長3 438 bp的開放讀碼框，編碼1 145個氨基酸，理論分子質量為127 ku，預測此蛋白N端有12個跨膜區(qū)，其跨膜區(qū)與其他植物和微生物高度相似；C端有一個位于胞質內的長親水性尾巴，其氨基酸序列與擬南芥的質膜Na+/H+逆向轉運蛋白(AtSOS1)相似度為64%，在鹽脅迫下其蛋白水平會上調，轉化到缺失Na+/H+逆向轉運蛋白EcNhaA 和 EcNhaB活性的鹽敏感大腸桿菌EP432中后，發(fā)現(xiàn)可以抑制大腸桿菌對鹽的敏感性，提高其耐鹽性?？贵w定位試驗結果證明，PeSOS1定位在質膜上，其功能是將細胞內的Na+排出胞外以避免胞質內過多Na+的積累；鹽脅迫下，胡楊葉片中PeSOS1的表達上調，質膜H+-ATPase也同時上調；上調的質膜H+-ATPase可為PeSOS1外排Na+提供動力[2]。Chung等[3]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下本身不穩(wěn)定的AtSOS1 mRNA穩(wěn)定性有所增加，主要是由活性氧介導所致；AtSOS1活性同時受轉錄后水平的調控[4]。但目前對SOS1和H2O2的相互作用機制尚不清楚。

本試驗將胡楊的PeSOS1基因轉到擬南芥中，通過實時熒光定量PCR分析不同轉基因株系擬南芥中PeSOS1表達量的差異；并利用3個PeSOS1表達量較高的株系進行耐鹽性及PeSOS1與H2O2相關性研究，比較野生型擬南芥和轉PeSOS1基因擬南芥在鹽脅迫下的萌發(fā)率、根長、離子含量、根尖離子流、H2O2的產生及相關抗氧化酶活性等指標，以期為探明胡楊PeSOS1響應鹽脅迫的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試植物 胡楊為新疆2年生胡楊實生苗，4月份將其栽種在10 L塑料花盆里(1株/盆)，培養(yǎng)基質為土和砂按1∶1體積比混合的基質，置于北京林業(yè)大學的苗圃中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間視天氣情況定期澆水和除草，且每隔1周每桶苗木澆1 L Hoagland全營養(yǎng)液。

擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型(Columbia ecotype,Col-0)，由北京林業(yè)大學沈昕實驗室留存。培養(yǎng)條件為：溫度25/22 ℃(晝/夜)，相對濕度70%，光照強度150 μmol/(m2·s)，光照周期為8 h黑暗/16 h光照。

1.1.2 菌株、質粒與試劑 大腸桿菌TOP10及感受態(tài)，由北京林業(yè)大學沈昕實驗室留存或制備；農桿菌GV3101，購自北京科百奧生物科技有限責任公司；中間載體pENTR/D-TOPO試劑盒(2 580 bp，篩選標記為卡那霉素)，購自Invitrogen公司。植物穩(wěn)定表達載體pK7m34GW2-8m21GW3D.0 (pK7，15 801 bp，篩選標記為壯觀霉素)，由北京林業(yè)大學沈昕實驗室留存。

rTaqDNA polymerase、ExTaqDNA polymerase，Takara (寶生物工程大連有限公司)生產；Silwet-77，美國GE公司生產；質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix、RNA提取試劑Trizol reagent和逆轉錄試劑盒 SuperScript?Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒，購自Invitrogen公司；Oligo (dT)15，購自Promega；十二烷基硫酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、DEPC、瓊脂糖、氨芐青霉素、卡那青霉素和壯觀霉素，為Sigma公司生產；胰蛋白胨、酵母提取物，為英國Oxoid公司生產；其他普通國產分析純試劑為北京化工廠生產。

1.2 方 法

1.2.1 胡楊RNA提取與cDNA 一鏈的合成 按照Trizol說明書提取胡楊幼嫩葉片的總RNA[2]，用SuperScript?Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒反轉錄合成cDNA。

1.2.2PeSOS1的克隆 根據(jù)胡楊質膜PeSOS1(GenBank登錄號:DQ517530.1)的序列，用Primer Primier 5.0軟件設計引物(S-P1f：5′-ATGGGGAGCGCGATAGAAACAG-3′，S-P1r：5′-CTAAGAAGCATGATGGAACGAC-3′) 進行PCR擴增。PCR體系為：2.5 μL 10×Taqbuffer，17.5 μL ddH2O，1 μL dNTP mix (10 mmol/L)，引物(S-P1f、S-P1r)各1 μL，1 μL DNA模板，1 μL ExTaqDNA polymerase (5 U/μL)。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸3.5 min，35個循環(huán)；72 ℃反應后延伸10 min。用ddH2O代替模板為陰性對照 。

1.2.3 載體的構建PeSOS1測序無誤后，用帶接頭的引物,即CACC+S-P1f和S-P1r擴增PeSOS1，取定量PCR產物按照pENTR/D-TOPO試劑盒說明書直接構建中間載體pENTR/D-TOPO-PeSOS1；反應產物轉化大腸桿菌TOP10后鋪板，挑單菌落提質粒，鑒定成功后按照Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix說明書重組pENTR/D-TOPO-PeSOS1與pK7，構建植物表達載體pK7-PeSOS1。利用Primer Primier 5.0軟件，設計鑒定檢測所用引物S-P2f：5′-AGGATGAGGAACTTGGA-CCTG-3′，S-P2r：5′-CCTGAGGAAATGTAACAC-GGAC-3′，其PCR產物長度約600 bp。PCR反應體系(25 μL)為：ddH2O 18 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTP 1 μL,S-P2f 1 μL,S-P2r 1 μL,DNA 1 μL,rTaqDNA polymerase 0.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃反應后延伸10 min,然后于10 ℃保存。

1.2.4 擬南芥的轉化 將pK7-PeSOS1和空載體pK7 質粒(陰性對照)轉化農桿菌GV3101后，用蘸花侵染方法轉化擬南芥[5]。用卡那霉素篩選擬南芥轉PeSOS1陽性植株，再根據(jù)孟德爾分離定律篩選純合子，用其種子開展后續(xù)試驗。PCR鑒定時，陽性對照為用質粒pK7作模板進行PCR擴增；陰性對照為用ddH2O作模板進行擴增。

1.2.5 不同擬南芥株系PeSOS1表達量的實時熒光定量PCR (Real Time PCR)分析 取在人工營養(yǎng)土中生長4周并用0和100 mmol/L NaCl處理3 d的野生型(WT)、轉空載體(VC)和轉PeSOS1基因擬南芥，提取RNA (RNA提取方法同1.2.1)，反轉錄合成cDNA(方法同1.2.1)，用熒光定量PCR儀(美國 Bio-Rad MJ Opticon 2)進行Real time PCR，檢測鹽處理對不同株系PeSOS1基因表達量的影響。PCR反應體系(25 μL)為：2.5 μL 10×buffer，17 μL ddH2O，1 μL dNTP mix (10 mmol/L)，引物(S-P3f (5′-GTGAACAGAACGGTGTAGGG-3′)、S-P3r (5′-CGAGTCTCATTTGTGCCTGT-3′)或內參基因Actin的Actin-f (5′-AT-TACCCGATGGGCAAGTCA-3′)、Actin-r (5′-TG-CTCATACGGTCAGCGATAC-3′))各1 μL，DNA Evagreen Green Ⅰ MIX 1 μL，1 μL cDNA模板，0.5 μL rTaqDNA polymerase (10 U/μL)。反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)；72 ℃反應后延伸10 min。以Actin為內參基因，采用2-ΔΔCt方法計算PeSOS1基因的相對表達量。

1.2.6 轉基因擬南芥的耐鹽性分析 1)鹽脅迫對轉PeSOS1基因擬南芥萌發(fā)率的影響。取野生型和轉PeSOS1基因株系擬南芥的T3代純合子種子，先用質量分數(shù)2%次氯酸鈉和體積分數(shù)75%乙醇無菌消毒處理，再用無菌水洗3次，然后播種在鹽濃度分別為0，100和150 mmol/L的1/2 MS培養(yǎng)基上，每天觀察并記錄其萌發(fā)率，至第5 天結束。

2)鹽脅迫對轉PeSOS1基因擬南芥根長的影響。擬南芥種子萌發(fā)3 d后(種子無菌處理方法同上)，在無菌條件下轉移到含0和100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，為了保證試驗處理條件的一致性，需要將種子播在同一培養(yǎng)皿的同一水平線上，且培養(yǎng)皿要垂直放，每1～2 d觀察1次，拍照并測量其根長，至第12天結束。

1.2.7 鹽脅迫下轉基因擬南芥生理指標的變化 1)鹽脅迫對擬南芥干質量及K+、Na+、Ca2+含量的影響。野生型與轉PeSOS1基因擬南芥種子萌發(fā)5 d后，轉移至含0,50 和 100 mmol/L NaCl的直徑9 cm花盆中，花盆中營養(yǎng)土和蛭石的體積比為1∶1(用PNS營養(yǎng)液泡過夜后使用)，每盆4～6株，每個株系種6盆，覆膜后避光培養(yǎng)2 d后見光，光照3 d后揭膜，培養(yǎng)3周后取地上部分稱取鮮質量，殺青后烘干，稱干質量，樣品粉碎后消煮，用原子吸收分光光度計測定K+、Na+、Ca2+含量，材料培養(yǎng)與處理等參見Wang等[6]的方法。

2)鹽脅迫對擬南芥根尖離子流的影響。野生型與轉PeSOS1基因擬南芥種子萌發(fā)后，均轉移至含0和100 mmol/L NaCl的 1/2 MS培養(yǎng)基上生長1或7 d，以0 mmol/L NaCl處理作為對照(CK)，測定K+、Na+、H+流的變化，具體步驟見Wang等[6]和Sun等[7]的方法。因在0 mmol/L NaCl處理培養(yǎng)基上生長1與7 d時根尖離子流的變化趨勢一致，因此對照僅列1 d時的結果。

3)SOS1抑制劑阿米洛利(Amiloride)對鹽脅迫下擬南芥根尖離子流的影響。野生型與轉PeSOS1基因擬南芥種子萌發(fā)7 d后，轉移至含0和100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上生長7 d左右，測定K+、Na+、H+流的變化。在含0和100 mmol/L NaCl的1/2 MS液體培養(yǎng)基中，加入100 μmol/L Amiloride處理NaCl脅迫前后擬南芥2 h，再用含100 μmol/L Amiloride的測試液泡30 min，然后測定其K+、Na+、H+流的變化。

1.2.8 鹽脅迫下轉基因擬南芥根中H2O2的產生及抗氧化酶活性的變化 1)產生H2O2的測定。在1/2 MS培養(yǎng)基上播種無菌處理的擬南芥種子，培養(yǎng)擬南芥無菌組培苗，生長1周時，分別移到含有0 (CK)和100 mmol/L NaCl的1/2 MS固體培養(yǎng)基上(配制培養(yǎng)基時加入相應濃度的NaCl)分別培養(yǎng)10 min，24 h和7 d，利用含50 μmol/L H2O2的探針H2DCFDA避光孵育處理5 min，用1/2 MS液體培養(yǎng)基洗去探針，熒光顯微鏡(Leica DMI4000 B)下檢測其熒光強度并采集圖像，用圖像處理軟件Image Pro-Plus，在根尖上取6～8個點進行檢測，計算得到平均熒光強度，以其表示H2O2水平。每個處理取5個樣本作重復，以降低個體差異帶來的誤差。

2)抗氧化酶活性的測定。將野生型和轉PeSOS1基因擬南芥種子直接播種在用液體1/2 MS培養(yǎng)基浸泡過夜的培養(yǎng)土中，用保鮮膜覆蓋保濕，2 d后照光，3 d后揭膜，每周澆1次1/2 MS液體培養(yǎng)基和2次水，生長4周后，用100 mmol/L NaCl處理3 d后采樣，將樣品立即置于液氮中保存。

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(Nitro Blue Tetrazolium chloride,NBT)比色法，參考Giannopolitis 等[8]和Wang等[9]的方法進行。谷胱甘肽還原酶(GR)活性根據(jù)NADPH的氧化反應來測定，具體參考Giannopolitis等[8]和Schaedle[10]的方法進行。過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸氧化酶(APX)活性測定參考Wang等[6,8]的方法進行。

1.2.9 H2O2對鹽誘導擬南芥根尖離子流的調控 用DPI (NADPH氧化酶的抑制劑)處理擬南芥，測定根尖K+、H+、Na+流的變化情況，研究H2O2對鹽誘導根尖離子流的調控作用。

取生長1周的擬南芥組培苗，其中野生型和轉PeSOS1基因擬南芥均設4個處理：第Ⅰ組為陰性對照，在測試液(含0.1 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L KCl和25 g/L蔗糖，用HCl和KOH調節(jié)pH至5.5)中適應0.5 h后，直接測定K+、Na+、H+流；第Ⅱ組為陽性對照，在含100 μmol/L DPI的1/2 MS液體培養(yǎng)基中處理2 h后，再在測試液中適應0.5 h，測定K+、Na+、H+流；第Ⅲ組：在含100 mmol/L NaCl的1/2 MS液體培養(yǎng)基中處理2 h后，再在測試液中適應 0.5 h，然后測定K+、Na+、H+流；第Ⅳ組：在含100 mmol/L NaCl和100 μmol/L DPI的1/2 MS液體培養(yǎng)基中處理2 h后，在測試液中適應0.5 h，測定K+、Na+、H+流。以上4個處理分別簡稱為CK、DPI、NaCl和NaCl+DPI。

2 結果與分析

2.1 胡楊RNA提取與cDNA一鏈的合成

由圖1可見，提取的胡楊RNA條帶清晰，且28S條帶的亮度約為18S的2倍，基本無蛋白、鹽離子和DNA等雜質污染， OD260/OD280約為2.0，OD260/OD230約為2.0，說明RNA質量和完整度好，純度高。cDNA 一鏈經電泳檢測發(fā)現(xiàn)，條帶呈彌散狀，分子質量在1～2 kb(圖2)，說明cDNA質量很好，完全能滿足下一步試驗需要。

2.2 胡楊PeSOS1的克隆

PeSOS1的PCR擴增結果見圖3。圖3顯示，克隆條帶單一清晰，無非特異性條帶，大小為3 000～4 000 bp，符合預期長度。經測序鑒定發(fā)現(xiàn),拼接序列與Wu等[1]克隆的PeSOS1(GenBank登錄號:DQ517530.1)的大小及序列完全一致。

圖2 胡楊cDNA一鏈的電泳結果
1．DNA Marker DL2000；2.cDNA一鏈產物；3.DNA Marker DL10000
Fig.2 Gel electrophoresis ofPopuluseuphraticacDNA
1.DNA Marker DL2000;2.cDNA;3.DNA Marker DL10000

圖3 胡楊PeSOS1的PCR擴增結果1～3.PeSOS1的擴增產物；4.DNA Marker DL10000；5.陰性對照
Fig.3 PCR amplification ofPopuluseuphraticaPeSOS1 gene1-3.PCR product ofPeSOS1;4.DNA Marker DL10000;5.Negative control

2.3 轉PeSOS1載體的構建

圖4-A顯示，構建的中間載體pENTR/D-TOPO-PeSOS1的大小為3 000 bp。對構建的中間載體pENTR/D-TOPO-PeSOS1進行PCR鑒定，結果(圖4-B)顯示，該載體構建成功。

由圖5可知，表達載體pK7-PeSOS1的PCR產物大小為3 000 bp左右，符合預期的PCR產物(PeSOS1的全長)大小。

2.4 擬南芥的轉化

轉化擬南芥后，順利獲得了7個陽性株系，標記為S1～S7，從中選取PeSOS1表達量高的3個株系(S1、S2和S5)進行純合子篩選及耐鹽性試驗。轉PeSOS1擬南芥陽性植株的基因組DNA見圖6。

圖6 轉PeSOS1擬南芥陽性植株的基因組DNA
1.DNA Marker DL15000；2～6.不同轉基因株系
Fig.6 Gel electrophoresis of genetic DNA of transgenicArabidopsislines
1.DNA Marker DL15000;2-6.Different transgenic lines

由圖6可知，擬南芥T1代陽性株系的DNA提取結果完好，條帶單一，既沒有降解，也沒有RNA的污染，完全可以用作模板進行定性鑒定。圖7顯示，從擬南芥T1代陽性株系中全部成功鑒定出了目的條帶，且條帶大小與用質粒pK7作模板的陽性對照一致，野生型擬南芥和陰性對照中均沒有此條帶，說明卡那霉素篩選結果可靠，轉基因株系鑒定成功。

2.5 不同株系擬南芥PeSOS1表達量的實時熒光定量PCR分析

野生型和轉PeSOS1基因擬南芥的RNA及PCR擴增結果見圖8。

由圖8-A可知，野生型和轉PeSOS1基因擬南芥的RNA提取較為成功，沒有降解及基因組DNA的污染，條帶28S的亮度約為18S的2倍，說明RNA質量較高，其OD280/OD260、OD280/OD230值均為1.8～2.0，說明樣品RNA的質量完全滿足后續(xù)試驗要求。圖8-B顯示，轉PeSOS1基因擬南芥擴增條帶單一，亮度良好，沒有非特異性條帶及引物二聚體的污染。目的模板擴增片段清晰可見，陰性對照(VC)沒有目的條帶的痕跡，可以滿足實時熒光定量PCR的要求。

通過檢測不同株系擬南芥PeSOS1的表達量(圖9)發(fā)現(xiàn)，在野生型擬南芥和轉空載體pK7植株中均未檢測到PeSOS1基因，而轉基因擬南芥中均檢測到PeSOS1。當用0 mmol/L NaCl處理后，轉基因擬南芥中PeSOS1表達量均不高，而用100 mmol/L NaCl處理后轉基因株系PeSOS1表達量顯著提高。

2.6 轉基因擬南芥的耐鹽性

NaCl脅迫對野生型和轉PeSOS1基因擬南芥萌發(fā)率的影響見圖10。圖10表明，在無鹽(0 mmol/L NaCl)培養(yǎng)基上，野生型(WT)和轉PeSOS1基因擬南芥(S1、S2、S5)的萌發(fā)率較高，均在95%左右；當用100 mmol/L NaCl處理后，轉PeSOS1基因擬南芥的萌發(fā)率基本沒有明顯變化，為70%～90%，而野生型擬南芥萌發(fā)率卻降到了30%左右；在用150 mmol/L NaCl處理后，野生型擬南芥的萌發(fā)率降到了約10%，而轉PeSOS1基因擬南芥株系中的萌發(fā)率顯著高于野生型擬南芥。說明轉PeSOS1基因后植株的耐鹽性顯著提高。

觀察發(fā)現(xiàn)，處理7 d后，在無鹽(0 mmol/L NaCl)培養(yǎng)基上，野生型和轉PeSOS1基因擬南芥株系的根長沒有差異(圖11)，同時植株在葉片和根形態(tài)上也沒有差異；利用100 mmol/L NaCl處理后，轉基因株系的根長生長優(yōu)于野生型(圖11)，且轉基因株系葉片較大、綠色較深，根比較粗壯，說明鹽脅迫并沒有明顯抑制轉PeSOS1基因株系根長的生長，卻抑制了野生型擬南芥根長的生長。

監(jiān)測長期(6～12 d)鹽脅迫下野生型和轉PeSOS1基因擬南芥的根長生長，結果見圖12。由圖12可知，在無鹽(0 mmol/L NaCl)培養(yǎng)基上，野生型與轉PeSOS1基因株系擬南芥的根長在脅迫6～10 d時差異不顯著，但在12 d時差異顯著。用100 mmol/L NaCl處理后，其抑制了擬南芥的根長生長，且對野生型擬南芥的抑制作用更為明顯，轉PeSOS1基因株系擬南芥的根長生長顯著優(yōu)于野生型，

說明轉PeSOS1基因擬南芥生長受鹽脅迫的影響較小。

2.7 鹽脅迫下轉基因擬南芥生理指標的變化

2.7.1 鹽脅迫對干質量及K+、Na+、Ca2+含量的影響 圖13顯示，當NaCl濃度為0 mmol/L時，轉PeSOS1基因擬南芥與野生型擬南芥的干質量差異不顯著。用50～100 mmol/L NaCl處理后，野生型擬南芥的干質量顯著下降，且隨著NaCl濃度的增加，下降幅度更明顯；轉PeSOS1基因擬南芥干質量亦有所下降，但下降幅度低于野生型擬南芥，說明轉PeSOS1基因擬南芥的生物量受鹽脅迫的影響明顯小于野生型擬南芥。

圖14顯示，NaCl處理前野生型與轉PeSOS1基因擬南芥的K+含量沒有顯著差異，100 mmol/L NaCl處理后野生型植株的K+含量下降了約50%，而轉PeSOS1基因株系K+含量雖然也有所下降，但下降幅度較小，為NaCl處理前的80%～90%，說明轉PeSOS1基因擬南芥在鹽脅迫下能更好地抑制K+的流失。100 mmol/L NaCl處理后，野生型擬南芥比轉基因株系積累了更多的Na+，約為處理前的2倍；轉PeSOS1基因株系Na+含量也有所增加，但其增加幅度較小，約為NaCl處理前的10%。NaCl處理前后轉PeSOS1基因擬南芥Ca2+含量變化趨勢與K+相似，即NaCl處理前，野生型與轉PeSOS1基因擬南芥Ca2+含量無顯著差異；100 mmol/L NaCl處理后，野生型擬南芥Ca2+含量顯著下降，而轉PeSOS1基因擬南芥Ca2+含量基本上維持了原有的水平，與NaCl處理前差異不顯著。說明轉PeSOS1基因擬南芥在鹽脅迫下營養(yǎng)元素的流失減少。100 mmol/L NaCl處理后，野生型擬南芥的K+/Na+明顯下降，其K+/Na+失去平衡，對植株的生長造成較大影響，而轉PeSOS1基因擬南芥能有效減少K+和Ca2+的流失，因此受鹽脅迫的傷害較輕?？芍?00 mmol/L NaCl處理后轉PeSOS1基因擬南芥對K+/Na+平衡的維持能力比野生型擬南芥強。

2.7.2 鹽脅迫對根尖離子流的影響 圖15顯示，在非鹽脅迫下(用0 mmol/L NaCl處理1 d，CK，下同)，野生型和轉PeSOS1基因擬南芥K+流沒有顯著差異；100 mmol/L NaCl處理后野生型和轉PeSOS1基因株系K+內流均有所減少，短期(1 d)鹽處理后轉PeSOS1基因擬南芥的K+內流顯著大于野生型；在長期(7 d)鹽脅迫下，野生型擬南芥還出現(xiàn)了K+外流的情況，而轉PeSOS1基因擬南芥沒有出現(xiàn)K+外流的情況，說明轉PeSOS1基因擬南芥在鹽脅迫下仍能保持對K+的吸收，而野生型擬南芥在長期鹽脅迫下則出現(xiàn)了K+外流。

由圖15還可見，在非鹽脅迫下，轉PeSOS1基因擬南芥Na+外流高于野生型，但差異不顯著。100 mmol/L NaCl處理1 d后，不同株系擬南芥Na+外流均增加，但是轉PeSOS1基因擬南芥Na+的外流顯著高于野生型；處理7 d后，不同株系擬南芥Na+外流進一步增加，但轉PeSOS1基因擬南芥的Na+外流仍顯著高于野生型擬南芥。

由圖15可以看出，在非鹽脅迫下，轉PeSOS1基因擬南芥H+外流與野生型差異不顯著，但用100 mmol/L NaCl處理后，無論是短期(1 d)還是長期(7 d)鹽脅迫，均能導致擬南芥出現(xiàn)H+內流，且野生型擬南芥的H+內流顯著小于轉基因株系，說明轉PeSOS1基因擬南芥能及時對鹽處理作出響應，激活SOS1蛋白，外排Na+的同時將H+轉運到胞內，使得H+呈內流的趨勢。

2.7.3 抑制劑Amiloride對NaCl脅迫下根尖離子流的影響 圖16顯示，抑制劑Amiloride處理與否，對照組(CK)中不同株系擬南芥的K+內流差異不顯著；但在100 mmol/L NaCl脅迫組中，添加Amiloride后，其明顯抑制了轉PeSOS1基因株系的K+內流，轉PeSOS1基因株系K+內流與野生型擬南芥沒有顯著差異。這說明鹽脅迫下轉PeSOS1基因擬南芥與野生型擬南芥的K+流與SOS1活性的關系密切。

圖16表明，添加Amiloride與否，對照組(CK)中轉PeSOS1基因擬南芥的Na+外流與野生型擬南芥無顯著差異。用NaCl處理后，轉PeSOS1基因擬南芥的Na+外流高于野生型擬南芥，且差異顯著；用NaCl+Amiloride處理后，轉PeSOS1基因擬南芥和野生型擬南芥Na+外流均大幅減小，且轉基因擬南芥與野生型沒有顯著差異。說明抑制劑Amiloride處理后消除了PeSOS1對Na+外流的促進作用。

由圖16還可知，添加Amiloride與否，對照組中不同株系擬南芥H+外流差異不顯著。NaCl處理后，使H+流向發(fā)生變化，由外流轉變?yōu)閮攘?，這與Na+的外流相對應，表明為Na+/H+逆向轉運。NaCl+Amiloride處理后，不同株系的H+內流均大幅度降低，且野生型和轉PeSOS1基因株系間的差異消失，說明SOS1被抑制后，Na+/H+逆向轉運受到明顯影響。

2.8 鹽脅迫下轉基因擬南芥根中H2O2的產生和抗氧化酶活性的變化

圖17顯示，擬南芥根細胞產生的H2O2隨著NaCl脅迫時間的延長而增加，但變化趨勢有所不同。野生型擬南芥的H2O2隨著鹽脅迫時間的延長而逐漸增加，至第7天H2O2水平達到最高；而轉PeSOS1基因擬南芥根細胞中H2O2水平在24 h內呈增加的趨勢，之后到第7天并未繼續(xù)增加，與NaCl處理24 h的水平基本一致。說明轉PeSOS1基因擬南芥能及時抑制H2O2的過量產生，避免過多的活性氧帶來的氧化脅迫，而野生型擬南芥并不能抑制鹽誘導的H2O2過量產生。

圖18表明，在轉PeSOS1基因擬南芥和野生型擬南芥中，抗氧化物酶SOD和GR活性在NaCl脅迫前后的變化趨勢基本相同，即NaCl處理前轉PeSOS1基因擬南芥與野生型擬南芥SOD和GR活性無顯著差異，NaCl脅迫后SOD和GR活性均增加，但是轉PeSOS1基因擬南芥SOD和GR活性增加的幅度顯著大于野生型擬南芥。野生型擬南芥的CAT和APX活性受NaCl脅迫的影響小，而轉PeSOS1基因擬南芥在NaCl脅迫后CAT和APX活性均顯著提高，且APX活性平均提高幅度(100%)高于CAT(30%)。

2.9 H2O2對鹽誘導轉基因擬南芥根尖離子流的調控

圖19顯示，與CK相比，NaCl處理后擬南芥根尖的K+內流減弱，Na+外流和H+內流增強，表明Na+/H+逆向轉運能力提高。與野生型擬南芥相比，轉PeSOS1基因擬南芥K+內流減弱的幅度較小，Na+外流和H+內流的增強幅度均較大，Na+/H+逆向轉運能力較高，且野生型與轉PeSOS1基因型擬南芥差異顯著。與CK相比，加入NADPH氧化酶抑制劑DPI后，不同株系擬南芥根尖的離子流未受影響，但卻進一步降低了NaCl處理擬南芥根尖的K+和H+的內流。與CK相比，NaCl和DPI共同處理后野生型和轉PeSOS1基因擬南芥Na+外流均有所增加，但是野生型擬南芥增幅較少，說明DPI對NaCl處理后野生型擬南芥的影響比轉PeSOS1基因擬南芥大，可能是由于野生型擬南芥在NaCl處理后產生了較多H2O2所致；說明添加DPI抑制了H2O2的產生后，影響了離子的平衡，降低了轉PeSOS1基因擬南芥Na+外流與野生型擬南芥的差異，即減小了轉PeSOS1基因造成的差異。與NaCl處理相比，NaCl和DPI共同處理后，轉PeSOS1基因擬南芥和野生型擬南芥H+內流均減小，而野生型擬南芥減少幅度較轉PeSOS1基因擬南芥小。可知NaCl與DPI共同處理后，轉PeSOS1基因擬南芥與野生型擬南芥根尖離子流之間的差異比NaCl單獨處理造成的差異有所降低。以上結果表明，H2O2調節(jié)了SOS1的活性，參與鹽誘導離子流的調控。

3 討 論

SOS1在提高植物抗鹽性中有著非常重要的作用。質膜SOS1外排Na+的作用降低了植物因鹽處理導致的體內Na+積累，因此減少了Na+積累帶來的離子滲透和氧化脅迫作用[11-12]，進而保證了K+、Ca2+等重要離子所占的比例，維持了K+/Na+平衡[12-14]，這為植物細胞內的正常代謝等生命活動提供了必要條件。SOS1在作為離子轉運體的同時還兼顧了信號信使的重要使命[15-18]。鹽脅迫產生的H2O2也起著信號信使的作用[2,19]。NaCl處理植物后，SOS1和H2O2信號系統(tǒng)共同作用，調控著植物體對NaCl脅迫的適應性[8,20]。對胡楊根組織分離原生質體的研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽性的胡楊在鹽處理后維持了K+/Na+平衡，且在此過程中，SOS1保持著對Na+的外排活性[20]。與對鹽敏感的楊樹相比，胡楊的葉片組織在鹽處理或正常生長狀態(tài)下均可保持較高的SOS1轉錄水平[2]。本研究克隆并表達了PeSOS1，發(fā)現(xiàn)PeSOS1可顯著增強轉基因擬南芥植株的耐鹽性和K+/Na+平衡。

前人在多種植物中均發(fā)現(xiàn)，鹽和H2O2均對SOS1 mRNA的穩(wěn)定性起著重要作用[3,21]。本研究發(fā)現(xiàn)，短期(10 min～24 h)NaCl脅迫下轉PeSOS1基因的擬南芥根細胞中 H2O2水平顯著高于野生型擬南芥，而且H2O2在多種類型細胞中均對刺激生長起到重要作用[6,21-24]，這可能是轉PeSOS1基因擬南芥在鹽脅迫下根系快速生長的原因。

Amiloride和DPI分別是SOS1和質膜NADPH氧化酶的抑制劑，在轉基因植株中Na+外流和K+內流受Amiloride和DPI的影響。說明擬南芥可能通過H2O2來調控SOS1，以達到維持胞內K+/Na+平衡的作用[25]。很多研究已經證明，H2O2對SOS1的活性有調節(jié)作用[3,25]。Sun等[26]研究表明，在胡楊細胞中，NaCl誘導產生的H+內流有助于產生過量的H2O2[26]。因此可以推測，由于H+內流的加強，導致質外體瞬時堿化，可激活質膜NADPH氧化酶并導致轉基因擬南芥根細胞中H2O2的積累[27]。這可能是因為NaCl處理后PeSOS1表達上調，使植物在外排Na+的同時將大量H+轉入胞內，這有助于激活質膜NADPH氧化酶，從而調節(jié)H2O2的產生。

在本研究中，轉PeSOS1基因擬南芥在NaCl處理下快速產生H2O2，且脅迫早期(10 min～24 h)H2O2的爆發(fā)可引起抗氧化防御[20,28]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉PeSOS1基因擬南芥在有或無NaCl處理的條件下均可保持較高的抗氧化酶活性，這使得H2O2水平得到了控制。研究表明，鹽脅迫下胡楊能調控活性氧平衡主要通過2條途徑：一是控制胞內離子平衡來減少長期鹽脅迫下誘導的活性氧產生，二是迅速上調氧化防御機制來阻止活性氧的損傷[20,29]。胡楊在鹽脅迫前后其PeSOS1均有較高的表達量[2]。本試驗結果表明，NaCl脅迫后，轉PeSOS1基因擬南芥中H2O2迅速產生，從而有助于通過調控Na+/H+逆向轉運系統(tǒng)的活性以維持K+/Na+平衡；此外，H2O2還能上調氧化防御機制從而防止長期NaCl脅迫下的氧化損傷發(fā)生。另外，鹽誘導H2O2提高胞內Ca2+濃度，胞內Ca2+信號通過SOS信號通路激活SOS1[30]。在擬南芥中，H2O2對維持SOS1 mRNA的穩(wěn)定性還有重要作用[3]。因此可以推斷，在擬南芥和胡楊中SOS1的高量表達促進了鹽脅迫下H2O2的產生，H2O2信號網絡進一步調控胞內的離子平衡。

綜上所述，在擬南芥中異源表達PeSOS1后，轉基因植株的耐鹽性提高，其機制為通過上調Na+/H+逆向轉運蛋白活性及外排Na+維持了K+/Na+平衡；同時轉PeSOS1基因擬南芥通過促進H2O2的產生，又進一步維持了SOS1 mRNA的穩(wěn)定性，使之在長期鹽脅迫中保持活性，從而對植物的生長起著重要的作用。

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Modulation of H2O2signaling in salt-stressedArabidopsisbyPeSOS1

WANG Mei-juan1,WANG Yang1,SHEN Ze-dan1,MA Xu-jun1,SA Gang1,DENG Shu-rong1,LIU Dan-dan2,ZHANG Yu-hong1,SHEN Xin1,CHEN Shao-liang1

(1CollegeofBiologicalSciencesandTechnology,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China;2DataoVillageofColouredGlazeRiverTown,FangshanDistrict,Beijing102403,China)

【Objective】 This study aimed to investigate the role ofPeSOS1 in salt sensing and adaption through H2O2signaling.【Method】 Plasma Membrane (PM) Na+/H+antiporter genePeSOS1 ofPopuluseuphraticawas cloned and introduced toArabidopsisthaliana.Then differences in salt tolerance between wild-type andPeSOS1-transgenicArabidopsisplants were illustrated by comparing germination,root length,biomass,contents of K+,Na+and Ca2+,fluxes of root K+,Na+and H+,H2O2production,antioxidant enzyme activity and effects of inhibitor on ion fluxes of homozygous seedlings under 100 mmol/L NaCl salt stress.【Result】 Compared to wild-type,PeSOS1-transgenicArabidopsisplants had higher germination rate,root length,and biomass under NaCl stress.PeSOS1-transgenicArabidopsisplants also had higher contents of K+and Ca2+but lower content of Na+.Transgenic plants exhibited lower ratio of Na+/H+antiport compared to wild-type.In roots of transgenicArabidopsis,H2O2production was more rapidly than wild-type when plants were subjected to NaCl stress and the activities of the antioxidant enzymes were higher.Transgenic plants were unable to remain K+/Na+homeostasis when salt-induced H2O2production was inhibited by diphenylene iodonium (DPI),an inhibitor of NADPH oxidase.【Conclusion】PeSOS1 increased salt tolerance through rapid H2O2production,which maintained the stability of SOS1 mRNA,controlled K+/Na+homeostasis and triggered antioxidant defense inArabidopsis.

Populuseuphratica;salt stress;transgenicArabidopsis;PM Na+/H+antiporter (SOS1);H2O2signaling;K+/Na+homeostasis;ion flux

2013-10-25

國家自然科學基金項目(31270654，31170570)；教育部科學技術研究項目(113013A)；北京市自然科學基金項目(6112017)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項(JC2011-2，TD-2012-04)；北京市優(yōu)秀博士學位論文指導教師專項(YB20081002201)；高等學校學科創(chuàng)新引智計劃項目(111 Project，B13007)

王美娟(1983-)，女，山東濟寧人，博士，主要從事樹木抗逆生理與分子生物學研究。E-mail：colorhail@sina.com

陳少良(1969-)，男，河北霸州人，教授，博士生導師，主要從事林木抗逆生理與分子生物學研究。 E-mail：Lschen@bjfu.edu.cn

時間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.009

S792.119;Q785

A

1671-9387(2015)02-0079-13

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.009.html