王 杰，陳 婷，沈清武

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

KLF15基因表達(dá)特征及其腺病毒超表達(dá)載體的構(gòu)建

王 杰，陳 婷，沈清武

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 分析鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子15( KLF15)在小鼠各組織及C2C12細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況，構(gòu)建KLF15的腺病毒超表達(dá)載體?！痉椒ā?采集小鼠肝、脾、腎、脂肪、骨骼肌及培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞，提取不同分化時期(0，2，4 d)的C2C12細(xì)胞及不同組織的RNA，檢測KLF15的表達(dá)情況；過夜連接Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切后的pAdTrack-CMV與KLF15真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-KLF15)，獲得pAdTrack-KLF15質(zhì)粒。將該質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ線性化后轉(zhuǎn)入BJ5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組，構(gòu)建pAdEasy-KLF15腺病毒超表達(dá)載體。將pAdEasy-KLF15質(zhì)粒PacⅠ酶切線性化回收后，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞進(jìn)行包裝、擴(kuò)繁和純化。將獲得的KLF15重組腺病毒侵染C2C12細(xì)胞，實時熒光定量PCR檢測其對KLF15表達(dá)的影響。【結(jié)果】KLF15在C2C12成肌細(xì)胞分化過程中表達(dá)顯著升高，并在分化后期達(dá)最高值；KLF15在肝臟、腎臟和脂肪中的表達(dá)水平極顯著高于骨骼肌和脾臟。成功獲得了pAdEasy-KLF15腺病毒超表達(dá)載體，其侵染C2C12細(xì)胞后能顯著上調(diào)KLF15 mRNA的表達(dá)水平?！窘Y(jié)論】KLF15基因在C2C12成肌細(xì)胞中高表達(dá)，并成功構(gòu)建了KLF15重組腺病毒載體。

KLF15；重組腺病毒；C2C12成肌細(xì)胞

鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(Kruppel-like factors，KLFs)家族是鋅指蛋白超家族中的一員，其通過C端的鋅指結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，在心肌、平滑肌和骨骼肌對細(xì)胞的增殖、分化、遷移以及相關(guān)疾病的調(diào)控中具有重要的作用[1-4]。研究證明，KLFs因子的結(jié)構(gòu)主要分為3部分：其一，KLFs的C端包含3個Cysteine2/Histidine2位點(diǎn)[5-6]；其二，KLFs因子中包含了一個高度保守的區(qū)域TGEKP(Y/F)X，該區(qū)域也是鋅指蛋白所包含的區(qū)域[7]；其三，KLFs因子可以與CACCC或GT盒子等一些特定的DNA綁定位點(diǎn)結(jié)合來調(diào)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)錄[6-7]，對細(xì)胞的增殖、分化、遷移都具有重要的作用。1993年，紅細(xì)胞中第1個KLF因子被鑒定出來并被命名為EKLF/KLF1[8]，其對β-globin基因的活性和表達(dá)具有重要的作用[9]。此后，共有17種KLF家族成員被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)這些因子在染色體上的位置而依次命名為KLF1-KLF17，且在不同的細(xì)胞類型中會有不同的表達(dá)，對細(xì)胞的增殖和分化具有重要的作用[10]。

截至目前，已發(fā)現(xiàn)有10多種KLFs家族因子在肌肉中表達(dá)，但對其大部分的作用機(jī)理還不明確。KLF15屬于KLF超家族的一員，最早在腎臟中被發(fā)現(xiàn)并命名為Kidney-Enriched Kruppel-Like Factor[11]。在骨骼肌中的研究顯示，KLF15可通過調(diào)節(jié)GATA4以及acetylcoenzyme A2的活性來參與骨骼肌的能量代謝[12-13]；同時，KLF15可通過連接成肌因子和D4Z4的啟動子來調(diào)節(jié)面部肌肉萎縮(FSHD)，而超表達(dá)Myog可上調(diào)KLF15的表達(dá)[14]。KLF15可以通過調(diào)節(jié)mTOR信號通路的活性來影響糖皮質(zhì)激素受體(GR)的活性[15]，并且KLF15對骨骼肌脂質(zhì)的流動以及運(yùn)動后的適應(yīng)能力也有一定的作用[16]。但是到目前為止，有關(guān)KLF15對骨骼肌成肌細(xì)胞分化影響的研究還未見報道。

本試驗前期研究發(fā)現(xiàn)，KLF15在骨骼肌快、慢肌中的表達(dá)差異顯著，在慢肌中的表達(dá)極顯著高于快肌，推測其可能在細(xì)胞分化過程中具有重要作用。為此，本試驗檢測了KLF15在小鼠不同組織及C2C12成肌細(xì)胞分化中的表達(dá)情況，并構(gòu)建了KLF15重組腺病毒超表達(dá)載體，旨在為進(jìn)一步研究KLF15對活體肌肉發(fā)育的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞、載體及試劑 C2C12細(xì)胞系、293A細(xì)胞系、DH5α感受態(tài)細(xì)胞及BJ5183感受態(tài)細(xì)胞由西北農(nóng)林科技大學(xué)脂肪沉積與肌肉發(fā)育實驗室保存；KLF15真核超表達(dá)載體(pcDNA3.1-KLF15，3′端帶Flag標(biāo)簽)由Susan J.Gray (University of Massachusetts Medical School)贈送；pAdTrack-CMV載體來自于西北農(nóng)林科技大學(xué)脂肪沉積與肌肉發(fā)育實驗室；胰酶購于美國GIbco公司；Lipofectamin 2000購于上海Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶(Hind Ⅲ和XbaⅠ)、Taq酶和T4連接酶、Real-time PCR試劑盒、RNAiso Plus均購于TaKaRa公司；內(nèi)切酶PmeⅠ和PacⅠ購于New England Biolabs公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、馬血清(HS)購自Hyclone 公司；質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒購于Omega公司。

1.1.2 試驗動物 2月齡小白鼠，購于第四軍醫(yī)大學(xué)。

1.2 KLF15在小鼠不同組織及C2C12成肌細(xì)胞分化中的表達(dá)檢測

1.2.1 C2C12成肌細(xì)胞的培養(yǎng)及小鼠組織的采集 用增殖培養(yǎng)基(GM，DMEM+體積分?jǐn)?shù) 10% FBS+100 U/mL青鏈霉素)培養(yǎng)C2C12成肌細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù) 5% CO2，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時更換為分化培養(yǎng)基(DM，DMEM+體積分?jǐn)?shù) 2% HS+100 U/mL青鏈霉素)， 進(jìn)行成肌誘導(dǎo)分化。將試驗小鼠脊椎脫臼法處死后，分別提取小鼠肝、脾、腎、脂肪、骨骼肌后放于超低溫冰箱中，待研磨后提取RNA進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測 以GAPDH為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR檢測KLF15基因的表達(dá)情況。根據(jù)GenBank中小鼠KLF15和GAPDH序列(GenBank的登錄號分別為:NM_023184和AY618199)，采用primer 5.0設(shè)計PCR引物，送華大基因公司合成。KLF15引物序列為： F 5′-ACCGAAATGCTCAGTGGGTTACCTA-3′，R 5′-GGAACAGAAGGCTTGCGAGTCA-3′;GA-PDH引物序列為:F 5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3′，R 5′-ATGCATTGCTGACAATCTTGAG-3′。

用RNAiso Plus法提取小鼠不同組織及分化0,2,4 d C2C12細(xì)胞總RNA，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)，合成cDNA第一鏈，然后采用IQ5(Bio-Rad公司)實時熒光定量PCR儀檢測KLF15基因的表達(dá)情況。反應(yīng)體系為25 μL：SYBR Premix ExTaq(2×)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。采用兩步法程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔct法計算。

1.3 pAdTrack-KLF15載體的構(gòu)建與鑒定

使用HindⅢ和XbaⅠ分別雙酶切pAdTrack-CMV載體和KLF15真核超表達(dá)載體pcDNA3.1-KLF15，酶切體系為：質(zhì)粒5 μL，Hind Ⅲ(10 U/μL)和XbaⅠ(10 U/μL)各0.75 μL，Buffer 2 μL，ddH2O 12.0 μL，37 ℃反應(yīng)6 h，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶。將回收的KLF15目的基因及雙酶切后的pAdTrack-CMV質(zhì)粒16 ℃連接過夜，連接體系為：pAdTrack-CMV質(zhì)粒、KLF15目的基因各2.0 μL，T4 連接酶 0.5 μL，10×Buffer 1.0 μL。取5 μL連接產(chǎn)物加入50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中靜置30 min，42 ℃熱激90 s，再在冰中放置1 min。加入800 μL的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，4 000 r/min離心4 min，取100 μL左右的菌液涂于含有50 μg/μL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上培養(yǎng)16 h，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，用Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pAdTrack-KLF15。

1.4 pAdEasy-KLF15腺病毒超表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

使用PmeⅠ酶切線性化陽性的pAdTrack-KLF15載體，反應(yīng)體系為：pAdTrack-KLF15質(zhì)粒10 μL，PmeⅠ(10 U/μL)1.0 μL，Buffer 2.0 μL，BSA 0.2 μL，ddH2O 6.8 μL，37 ℃反應(yīng)6 h。酶切產(chǎn)物采用乙醇沉淀法純化。取BJ5183感受態(tài)細(xì)胞冰上溶解，加入5 μL左右線性化的pAdTrack-KLF15載體，冰中靜置30 min，42 ℃熱激90 s，再在冰中放置1 min，加入800 μL左右的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃ 170 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，4 000 r/min離心4 min，取100 μL左右的菌液涂于含有50 μg/μL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上培養(yǎng)18 h，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PacⅠ酶切鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pAdEasy-KLF15。

1.5 重組腺病毒pAdEasy-KLF15的包裝、濃縮與滴度測定

用2.5 g/L的胰酶消化對數(shù)生長期的293A細(xì)胞，并接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時，將pAdEasy-KLF15經(jīng)PacⅠ 酶切線性化，乙醇沉淀后，用Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞進(jìn)行包裝，于轉(zhuǎn)染后2,3,6和7 d取樣，觀察細(xì)胞熒光及病變情況，并于轉(zhuǎn)染后7 d收集細(xì)胞毒液，然后再感染293A細(xì)胞。將反復(fù)擴(kuò)增后的毒液經(jīng)氯化銫密度梯度(1.4,1.2 g/mL)離心純化，即得pAdEasy-KLF15重組腺病毒，于-80 ℃保存。將重組腺病毒按照10倍倍比稀釋，即得10-10濃度梯度，分別感染293A細(xì)胞，3 d后觀察熒光表達(dá)情況，計算病毒滴度，病毒滴度=GFP陽性細(xì)胞數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/0.01 mL。

1.6 重組腺病毒pAdEasy-KLF15侵染C2C12細(xì)胞

培養(yǎng)C2C12成肌細(xì)胞，待融合度達(dá)到90%后換成分化培養(yǎng)基，并在分化培養(yǎng)基中加入50%的重組腺病毒pAdEasy-KLF15毒液，24 h后第1次觀察熒光情況，48 h后第2次觀察熒光情況，并收集細(xì)胞，鑒定KLF15的表達(dá)情況。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(mean±S.D.)表示，運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析，用t檢驗(t-test)對不同組之間的差異進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 KLF15在小鼠組織及C2C12成肌細(xì)胞分化過程中的表達(dá)

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨著C2C12成肌細(xì)胞分化時間的延長，KLF15表達(dá)量極顯著升高，并在分化的后期達(dá)到表達(dá)的最高值(圖1-A)。KLF15在2月齡左右小鼠各個組織中都有表達(dá)，在肝臟、腎臟和脂肪中的表達(dá)水平極顯著高于骨骼肌和脾臟(圖1-B)，這與相關(guān)報道[3]相一致。

2.2 pAdTrack-KLF15載體的構(gòu)建及鑒定

對pcDNA3.1-KLF15載體進(jìn)行HindⅢ和XbaⅠ雙酶切獲得KLF15片段，將該片段與同樣經(jīng)Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切的pAdTrack-CMV質(zhì)粒進(jìn)行同源重組，得到pAdTrack-KLF15重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切鑒定，電泳后可見2條片段，大片段為9.2 kb的 pAdTrack，小片段為1 300 bp的KLF15(圖2)。回收小片段測序后與GenBank中小鼠的KLF15基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，回收片段的序列與GenBank中小鼠的KLF15基因序列完全吻合，證明pAdTrack-KLF15重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 pAdEasy-KLF15腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

將線性化后的pAdTrack-KLF15質(zhì)粒與BJ5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行同源重組，挑選單克隆質(zhì)粒，經(jīng)PacⅠ酶切后，釋放1個大小為3 kb的片段(圖3)，表明pAdEasy-KLF15構(gòu)建成功。

2.4 pAdEasy-KLF15腺病毒載體的包裝及擴(kuò)繁

將PacⅠ酶切線性化后的pAdEasy-KLF15轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后2 d腺病毒開始擴(kuò)繁并表達(dá)GFP產(chǎn)生熒光(圖4-A)；3 d后病毒顆粒開始釋放，感染周圍的細(xì)胞(圖4-B)；6 d后出現(xiàn)病毒包裝過程中典型的“彗星尾”現(xiàn)象(圖4-C)；7 d后熒光表達(dá)增多，整個視野的熒光水平顯著升高(圖4-D)，有70%的細(xì)胞表達(dá)熒光。收集細(xì)胞毒液，反復(fù)擴(kuò)增和純化，滴度可達(dá)到7×10-10PFU/mL。

2.5 pAdEasy-KLF15感染C2C12細(xì)胞后對KLF15表達(dá)的影響

重組腺病毒感染C2C12細(xì)胞2 d后，約有60%的細(xì)胞被腺病毒感染并產(chǎn)生熒光 (圖5)。收集細(xì)胞，提取RNA，實時熒光定量PCR檢測KLF15 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果見圖6。

圖6顯示，與對照相比，KLF15 mRNA的表達(dá)水平增加了約100倍。說明KLF15的重組腺病毒表達(dá)載體可以顯著提高KLF15基因mRNA的表達(dá)水平。

3 討 論

KLF15作為KLF家族的一員，在心肌中可以抑制心肌肥大，在平滑肌中可以抑制平滑肌細(xì)胞的遷移。在心肌中，KLF15可以通過抑制GATA4和MEF2A的活性來調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的增殖和分化，超表達(dá)KLF15的小鼠患心肌肥大的可能性會顯著下降[17]。相關(guān)報道稱，KLF15對平滑肌的分化有抑制作用，在正常的血管平滑肌中KLF15的表達(dá)量很高，但是當(dāng)血管內(nèi)皮破損后，KLF15的表達(dá)量會顯著下降，而超表達(dá)KLF15的平滑肌細(xì)胞的再生能力會有所下降，并且向受傷部位遷移的能力也明顯降低[18]。KLF15對骨骼肌的能量代謝也起到重要的調(diào)節(jié)作用[16]。上述結(jié)果表明，KLF15在肌肉的發(fā)育過程中具有重要的作用。

本試驗研究顯示，KLF15在C2C12成肌細(xì)胞分化過程中表達(dá)顯著升高，并在分化的后期達(dá)到最高值，而且在肌肉組織中的表達(dá)水平也較高，這與相關(guān)報道[15]相一致。同時，前期研究發(fā)現(xiàn)KLF15在慢肌肌肉中的表達(dá)量極顯著高于快肌，推測其可能對骨骼肌的形成，特別是對快慢肌的形成具有重要的作用。

腺病毒具有包裝簡單，可反復(fù)擴(kuò)繁以及毒力穩(wěn)定等優(yōu)勢，為了進(jìn)一步驗證KLF15在原代細(xì)胞系和活體中對成肌過程的作用機(jī)理，同時為了避免真核表達(dá)質(zhì)粒對原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染率低的局限性[19]，本試驗通過酶切已知載體得到了外源目的基因，成功構(gòu)建了穿梭載體pAdTrack-KLF15，通過同源重組，將外源目的基因KLF15整合到腺病毒骨架載體中，得到了pAdEasy-KLF15，并于包裝后感染C2C12細(xì)胞；實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，pAdEasy-KLF15可以極顯著上調(diào)KLF15 mRNA的表達(dá)水平，為后續(xù)研究KLF15在原代成肌細(xì)胞和活體中的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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Expression characteristics ofKLF15 gene and construction of its adenovirus vector

WANG Jie,CHEN Ting,SHEN Qing-wu

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The aims of this study were to explore the expression ofKLF15 gene in tissues and differentiation of C2C12 cell of mice and conduct its adenovirus vector.【Method】 Firstly,tissues of mice and C2C12 cells in different differentiation phases were collected to extract RNA for detecting expression ofKLF15 gene.Secondly,the target fragment obtained from pcDNA3.1-KLF15 vector was connected to pAdTrack-CMV after being digested byHindⅢ andXbaⅠto obtain pAdTrack-KLF15 vector.The pAdTrack-KLF15 vector was linearized byPmeⅠ and transformed into BJ5183 competent cells with pAdEasy to construct pAdEasy-KLF15.After the pAdEasy-KLF15 vector was digested byPacⅠ,the purified product was transfected into 293A cells using lip for viral packaging.Finally,q-PCR was used to detect the expression ofKLF15 mRNA after pAdEasy-KLF15 vector was injected into C2C12 cells for 48 h.【Result】KLF15 showed significantly increasing expression during differentiation of C2C12 myoblasts andKLF15 expression levels in liver,kidney and fat were significantly higher than in the skeletal muscle and spleen.The recombinant adenovirus vector pAdEasy-KLF15 was successfully obtained,and the mRNA expression ofKLF15 gene indicated an observably up-regulated trend after it was transfected C2C12 cells.【Conclusion】KLF15 gene showed high expression in C2C12 cells.The recombinant adenovirus vector expressing mouseKLF15 gene was successfully constructed.

KLF15；recombinant adenovirus；C2C12 myoblasts

2014-01-10

西北農(nóng)林科技大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動經(jīng)費(fèi)項目(Z111021006)

王 杰(1988-)，男，河南信陽人，在讀碩士，主要從事動物骨骼肌發(fā)育研究。

沈清武(1973-)，男，湖南沅陵人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肌肉干細(xì)胞生物學(xué)研究。

時間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.029

Q782

A

1671-9387(2015)07-0035-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.029.html