李 麟 綜述，秦 波審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科 400016)

·綜 述·

USP18及其在病毒性肝炎等疾病中的研究進展

李 麟 綜述，秦 波△審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科 400016)

USP18；干擾素；病毒性肝炎；JAK-STAT

泛素特異性蛋白酶18(USP18)最初在1999年被克隆，其編碼的蛋白相對分子質(zhì)量為43×103，因此也被稱作泛素特異性蛋白酶43(UBP43)。USP18最初是Liu等[1]在分析AML1-ETO融合基因敲入小鼠的基因差異表達(dá)時被發(fā)現(xiàn)并克隆的。近年研究發(fā)現(xiàn)USP18在干擾素(IFN)治療多種疾病的應(yīng)答不佳組中高表達(dá)，USP18可能在其中扮演了重要角色。本文就近年來USP18的結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及在病毒性肝炎等疾病中的生物學(xué)功能等研究進展綜述如下。

1 USP18概述

1.1 USP18的結(jié)構(gòu) 人類USP18基因定位于22q11.2染色體上，屬于泛素特異性降解酶家族，在肝臟、胸腺和單核巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。USP18基因的轉(zhuǎn)錄啟動子位于干擾素刺激應(yīng)答反應(yīng)元件(ISRE)內(nèi)，故干擾素可以強烈誘發(fā)機體表達(dá)USP18。生物信息學(xué)分析顯示USP18編碼372個氨基酸，蛋白質(zhì)理論相對分子質(zhì)量為43 010.7，蛋白質(zhì)理論等電點(pI)為8.05。原子總數(shù)(total number of atoms)為6 015，分子式為C1900H3007N527O551S30。在哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞中預(yù)測半衰期為30 h；酵母體內(nèi)預(yù)測半衰期大于20 h；大腸桿菌體內(nèi)預(yù)測半衰期大于10 h。不穩(wěn)定系數(shù)(instability index)為57.20，是一個不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。USP18蛋白中相對含量比較多的氨基酸是Leu(45個，12.1%)、Ser(29個，7.8%)、Gln(25個，6.7%)、Lys(23個，6.2%)、Glu(22個，5.9%)、Arg(22個，5.9%)、Val(21個，5.6%)。酸性氨基酸殘基總數(shù)(total number of negatively charged residues,Asp+Glu)為42，堿性氨基酸殘基總數(shù)(total number of positively charged residues，Arg+Lys)為45，總平均疏水性(grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.288，是可溶性蛋白質(zhì)。USP18基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中有43.01%是α-螺旋，12.63%是β-折疊，41.94%為無規(guī)則卷曲，為混合蛋白質(zhì)。采用WoLFPSORT、NetPhos 2.0 Server等工具進行USP18亞細(xì)胞定位預(yù)測，分析結(jié)果顯示它位于細(xì)胞外或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，證明了其分泌蛋白的屬性。磷酸化位點預(yù)測結(jié)果顯示USP18有15個絲氨酸、2個蘇氨酸、2個酪氨酸，表明其參與了細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。USP18的活性中心含有高度保守短序列——半胱氨酸殘基(半胱氨酸盒)和組氨酸殘基(組氨酸盒)，該結(jié)構(gòu)是USP家族蛋白酶所特有的結(jié)構(gòu)[2]。

目前對全長的USP18研究較多，普遍認(rèn)為密碼子AUG可翻譯全長的USP18蛋白。Burkart等[3]研究發(fā)現(xiàn)了USP18的截短亞型USP18-sf，并證明它是由一種罕見的起始密碼子(CUG)編碼，這種非常規(guī)的起始部位具有較弱的轉(zhuǎn)錄起始效率，其可促進約70%的USP18-sf的表達(dá)。功能分析表明，USP18-sf與全長蛋白都表現(xiàn)出酶活性和干擾Ⅰ型干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用；與全長蛋白相比，USP18-sf表現(xiàn)出不同的亞細(xì)胞分布，并在細(xì)胞核內(nèi)表現(xiàn)出增強的去ISGylation活性，表明其可能具有更為特特殊的功能，但其發(fā)揮作用的機制尚不清楚。Tokarz等[4]發(fā)現(xiàn)在哺乳動物F-box蛋白skp2和異位USP18水平之間具有逆相關(guān)性，進一步研究發(fā)現(xiàn)skp2蛋白可結(jié)合USP18并啟動它的多泛素化作用，使得USP18通過蛋白酶體降解，從而調(diào)節(jié)USP18蛋白的水平，因此skp2可能在調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。

1.2 USP18與信號轉(zhuǎn)導(dǎo) USP18有兩個主要功能，即其酶活性和下調(diào)下游Ⅰ型干擾素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。IFN-α/β的刺激可上調(diào)干擾素刺激基因15(ISG15)的表達(dá)，USP18能夠特異性的從ISGlation的蛋白結(jié)合物中移出ISG15，并進一步水解ISG15從而阻礙其發(fā)揮生物效應(yīng)。因此，通過抑制USP18的蛋白酶活性從而提高ISG15的修飾作用，可能成為增強干擾素干擾病毒復(fù)制的一種新手段。

干擾素通過激活JAK-STAT信號通路調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能。缺乏USP18可導(dǎo)致USP18-/-小鼠對干擾素高度敏感，對淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、水泡性口炎病毒(VSV)、辛德畢斯病毒(SNV)等多種病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)具有高度的抵抗力，并對多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有較強的抑制作用[5]。應(yīng)用RNAi沉默USP18后的細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的ISG15修飾蛋白，并出現(xiàn)放大和延長的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子1(STAT1)磷酸化、DNA結(jié)合以及多種干擾素刺激基因(ISGs)誘導(dǎo)增加，表明USP18在下調(diào)干擾素反應(yīng)性中具有重要作用,因此認(rèn)為USP18最主要的作用是負(fù)性調(diào)節(jié)干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但USP18阻斷干擾素介導(dǎo)的JAK-STAT信號通路的分子機制尚不十分明確。目前認(rèn)為USP18特異性地連接于干擾素受體2(IFNAR2)亞單位的近膜區(qū)域，覆蓋受體的Box1-Box2模體，而該區(qū)域是干擾素與酪氨酸蛋白激酶1(JAK1)相互作用的關(guān)鍵部位，因此USP18可以與JAK1競爭受體，從而阻斷JAK1的活化以及下游的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。USP18阻礙JAK1-IFNAR2受體復(fù)合物的形成呈劑量依賴性，并呈經(jīng)典的負(fù)反饋方式。更為重要的是，不同于其他磷酸酶如細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)、PIAS(protein inhibitor of activated STAT)等發(fā)揮效應(yīng)時會影響許多細(xì)胞因子，USP18介導(dǎo)的阻斷效應(yīng)特異性地作用于Ⅰ型干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，表明USP18是由Ⅰ型干擾素特異性觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中新型的體內(nèi)抑制劑。鑒于這種特異性，USP18可能成為治療慢性病毒感染和惡性腫瘤的潛在靶點[6]。此外，USP18和ISG15-/-以及USP18和E1樣泛素激活酶(Ube1L)-/-小鼠與親代USP18-/-小鼠有完整的干擾素作用系統(tǒng)，并對病毒的反應(yīng)正常，ISG15的siRNA并不能改變干擾素的抗丙型肝炎病毒(HCV)活性[7]，表明USP18阻斷JAK-STAT信號通路可能并不依賴于它的酶活性。

2 USP18在病毒性肝炎中的表達(dá)和意義

病毒性肝炎中HBV和HCV感染后多呈隱匿性感染狀態(tài)，而持續(xù)性的HBV、HCV感染可能會導(dǎo)致肝硬化和原發(fā)性肝癌等后果。

IFN-α是目前治療乙型、丙型肝炎的首選藥物之一。薈萃分析表明，慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎患者的IFN-α治療持續(xù)應(yīng)答率分別僅為30%和50%左右。因此，研究IFN-α抑制肝炎病毒復(fù)制的機制，提高患者對IFN-α的應(yīng)答率顯得尤為重要。IFN-α發(fā)揮作用的經(jīng)典途徑為IFN與其受體結(jié)合并使之二聚化從而改變其構(gòu)象，進一步激活下游的JAK，STAT被JAK磷酸化后發(fā)生二聚化，然后穿過核膜進入核內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)抗病毒蛋白的基因如MxA、2′,5′寡腺苷酸合成酶、IRF7等的表達(dá)，繼而抑制病毒的復(fù)制。

HBV可通過多種途徑影響IFN-α的抗病毒活性，從而影響其治療效果。HBV病毒可通過下調(diào)STAT1等的表達(dá)抑制IFN-α JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)分子和抗病毒蛋白的表達(dá)，但其影響IFN-α抗病毒活性的機制目前尚無一致的結(jié)論。Xiao等[8]利用基因芯片技術(shù)對13例慢性乙型肝炎患者IFN-α治療前的肝組織進行了基因譜的差異研究，發(fā)現(xiàn)應(yīng)答組和無應(yīng)答組肝細(xì)胞有3 592個基因有明顯差異表達(dá)，且這些差異基因主要集中在ISGs和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因；在無應(yīng)答組中，位于同一信號傳導(dǎo)途徑的USP18和CEB1在治療前高表達(dá)，提示USP18可通過抑制JAK-STAT信號通路明顯影響IFN-α的治療乙型肝炎的效果。Kim等[9]發(fā)現(xiàn)在USP18-/-小鼠中HBV DNA的穩(wěn)態(tài)水平顯著降低，肝組織中CXC19、GBP1、IRF1、IRF7等干擾素誘導(dǎo)基因顯著上調(diào)，并通過研究只表達(dá)無抑肽酶活性USP18的小鼠發(fā)現(xiàn)，USP18下調(diào)JAK-STAT信號通路并不依賴于它的抑肽酶活性。應(yīng)用RNAi沉默USP18后ISG15蛋白的表達(dá)增加，HBV DNA的復(fù)制減少甚至陰轉(zhuǎn)，推測沉默USP18的表達(dá)能增強IFN-α抗病毒活性。因此USP18不僅可用于預(yù)測IFN-α治療效果，并且可能是一個提高IFN-α治療病毒性感染療效的關(guān)鍵基因。

Chen等[10]應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)檢測了干擾素治療HCV應(yīng)答組和無應(yīng)答組肝組織中基因水平的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)USP18在無應(yīng)答組中顯著上調(diào)，這與其他研究者在HBV中的研究結(jié)果相似，而且在基因1型患者的肝組織中USP18的表達(dá)水平明顯高于基因3型患者，因此USP18可作為預(yù)測IFN-α治療慢性丙型肝炎療效的指標(biāo)。Murray等[11]應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默USP18后干擾素信號通路中的ISRE的活性和其下游的2′,5′寡腺苷酸合成酶(2′,5′ Oligoadenylate synthetase,2-5OAS)的表達(dá)明顯增強，細(xì)胞對干擾素的敏感性增強，STAT1的酪氨酸磷酸化作用延長，ISGs表達(dá)亦明顯增強。Sarasin-Filipowicz等[12]發(fā)現(xiàn)USP18是導(dǎo)致IFN-α再次刺激時應(yīng)答效率越來越低的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此，抑制USP18的表達(dá)可能成為提高IFN-α療效的新手段。此外，F(xiàn)rancois-Newton等[13]發(fā)現(xiàn)使用IFN-α?xí)r，USP18通過阻礙IFN-α2功能結(jié)合位點的形成來抑制干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而使用IFN-λ后仍可檢測到干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)產(chǎn)物的表達(dá)，表明IFN-λ可能作為IFN-α應(yīng)答不佳的替代治療。Dill等[14]利用基因芯片技術(shù)研究IFN-α治療急性和慢性丙型肝炎不同反應(yīng)性的機制，在慢性丙型肝炎無應(yīng)答患者的肝臟標(biāo)本中觀察到USP18的表達(dá)上調(diào)，而在急性丙型肝炎患者中沒有觀察到這種現(xiàn)象，其具體機制有待進一步深入研究。

3 USP18在其他相關(guān)疾病中的表達(dá)和意義

USP18在立克次體感染的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMECs)內(nèi)的表達(dá)增加，USP18敲除的HMECs內(nèi)STAT1磷酸化的增加使ISGs如OAS1、MX1和GBP1轉(zhuǎn)錄激活，證明USP18可通過下調(diào)STAT1的活性發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用[15]。此外，敲除USP18的小鼠對傷寒沙門氏菌、LCMV和VSV感染的細(xì)胞病變效應(yīng)的抵抗能力比野生型小鼠更強。

USP18在許多自身免疫性疾病的發(fā)病中也扮演了重要角色，在皮肌炎(DM)、多發(fā)性硬化(MS)患者中均檢測到USP18的差異表達(dá)[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制USP18可通過增加STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和線粒體途徑的細(xì)胞凋亡而促進干擾素誘導(dǎo)的胰腺β細(xì)胞的炎癥和凋亡。USP18的去泛素化活性也可廣泛影響自身免疫性疾病的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，USP18能通過對TGF-β激活激酶1(TAK1)-TAK1結(jié)合蛋白1(TAB1)復(fù)合物的去泛素化調(diào)節(jié)來調(diào)控T細(xì)胞的活化和T輔助細(xì)胞17(Th17)的分化[18]，故USP18可能成為治療自身免疫性疾病的重要靶點。

不僅如此，USP18還可能是一個具有廣泛前景的治療多種實體腫瘤的藥物靶點，急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)、惡性肺部腫瘤、乳腺腫瘤中USP18的表達(dá)亦顯著增加，干擾USP18表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞對治療藥物的反應(yīng)性[19-21]。Shahidul等[22]在腎母細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，USP18可以通過上調(diào)EGFR的表達(dá)從而促進腎細(xì)胞的增殖，miR-7可參與抑制EGFR的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的致瘤活性；Duex等[23]研究發(fā)現(xiàn)USP18敲除可促進miR-7的上調(diào)，因此抑制USP18可治療EGFR失調(diào)的腫瘤。

4 結(jié) 語

USP18在很大程度上能影響干擾素治療病毒性感染的效果，可作為預(yù)測其療效的關(guān)鍵基因；同時，隨著新的分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，USP18的生物學(xué)功能及其介導(dǎo)的信號通路必將更加清楚，USP18極有可能成為病毒性肝炎、自身免疫性疾病和腫瘤性疾病具有廣泛應(yīng)用前景的新的藥物治療靶點，值得進一步深入研究。

[1]Liu LQ,Ilaria R Jr,Kingsley PD,et al.A novel ubiquitin-specific protease,UBP43,cloned from leukemia fusion protein AML1-ETO-expressing mice,functions in hematopoietic cell differentiation[J].Mol Cell Biol,1999,19(4):3029-3038.

[2]Amerik AY,Hochstrasser M.Mechanism and function of deubiquitinating enzymes[J].Biochim Biophys Acta,2004,1695(1/3):189-207.

[3]Burkart C,Fan JB,Zhang DE.Two independent mechanisms promote expression of an N-terminal truncated USP18 isoform with higher DeISGylation activity in the nucleus[J].J Biol Chem,2012,287(7):4883-4893.

[4]Tokarz S,Berset C,La Rue J,et al.The ISG15 isopeptidase UBP43 is regulated by proteolysis via the SCFSkp2 ubiquitin ligase[J].J Biol Chem,2004,279(45):46424-46430.

[5]Kim KI,Malakhova OA,Hoebe K,et al.Enhanced antibacterial potential in UBP43-deficient mice against Salmonella typhimurium infection by up-regulating type I IFN signaling[J].J Immunol,2005,175(2):847-854.

[6]Burkart C,Fan JB,Zhang DE.Two independent mechanisms promote expression of an N-terminal truncated USP18 isoform with higher DeISGylation activity in the nucleus[J].J Biol Chem,2012,287(7):4883-4893.

[7]Chen L,Li S,McGilvray I.The ISG15/USP18 ubiquitin-like pathway (ISGylation system) in hepatitis C virus infection and resistance to interferon therapy[J].Int J Biochem Cell Biol,2011,43(10):1427-1431.

[8]Xiao C,Qin B,Chen L,et al.Preactivation of the interferon signaling in liver is correlated with non-response to interferon alpha therapy in patients chronically infected with hepatitis B virus[J].J Viral Hepatitis,2012,19(2):e1-e10.

[9]Kim JH,Luo JK,Zhang DE.The level of hepatitis B virus replication is not affected by protein ISG15 modification but is reduced by inhibition of UBP43 (USP18) expression[J].J Immunol，2008，181(9):6467-6472.

[10]Chen L,Borozan I,Feld J，et al．Hepatic gene expression discriminates responders and nonresponders in treatment of chronic hepatitis C viral infection[J]．Gastroenterology，2005，128(5)：1437-1444．

[11]Murray EJ,Burden F,Horscroft N,et al.Knockdown of USP18 increases α 2a interferon signaling and induction of interferon-stimulating genes but does not increase antiviral activity in Huh7 cells[J].Antimicrob Agents Chemother,2011,55(9):4311-4319.

[12]Sarasin-Filipowicz M,Wang X,Yan M,et al.Alpha interferon induces long-lasting refractoriness of JAK-STAT signaling in the mouse liver through induction of USP18/UBP43[J].Mol Cell Biol,2009,29(17):4841-4851.

[13]Francois-Newton V,Magno de Freitas，Almeida G,et al.USP18-based negative feedback control is induced by type Ⅰ and type Ⅲ interferons and specifically inactivates interferon α response[J].PLoS One,2011,6(7):e22200.

[14]Dill MT,Makowska Z,Duong FH,et al.Interferon-γ-stimulated genes,but not USP18,are expressed in livers of patients with acute hepatitis C [J].Gastroenterology,2012,143(3):777-786.

[15]Colonne PM,Sahni A,Sahni SK.Rickettsia conorii infection stimulates the expression of ISG15 and ISG15 protease UBP43 in human microvascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,416(1/2):153-158.

[16]Salajegheh M,Kong SW,Pinkus JL,et al.Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) conjugates proteins in dermatomyositis muscle with perifascicular atrophy[J].Ann Neurol,2010,67(1):53-63.

[17]Malhotra S,Morcillo-Suárez C,Nurtdinov R,et al.Roles of the ubiquitin peptidase USP18 in multiple sclerosis and the response to interferon-β treatment[J].Eur J Neurol,2013,20(10):1390-1397.

[18]Liu X,Li H,Zhong B,et al.USP18 inhibits NF-κB and NFAT activation during Th17 differentiation by deubiquitinating the TAK1-TAB1 complex[J].J Exp Med,2013,210(8):1575-1590.

[19]Guo Y,Dolinko AV,Chinyengetere F,et al.Blockade of the ubiquitin protease UBP43 destabilizes transcription factor PML/RARα and inhibits the growth of acute promyelocytic leukemia[J].Cancer Res,2010,70(23):9875-9885.

[20]Guo Y,Chinyengetere F,Dolinko AV,et al.Evidence for the ubiquitin protease UBP43 as an antineoplastic target[J].Mol Cancer Ther,2012,11(9):1968-1977.

[21]Burkart C,Arimoto K,Tang T,et al.USP18 deficient mammary epithelial cells create an antitumour environment driven by hypersensitivity to IFN-γ and elevated secretion of Cxcl10[J].EMBO Mol Med,2013,5(7):967-982.

[22]Shahidul Makki M,Cristy Ruteshouser E,Huff V.Ubiquitin specific protease 18 (USP18) is a WT1 transcriptional target[J].Exp Cell Res,2013,319(5):612-622.

[23]Duex JE,Comeau L,Sorkin A,et al.USP18 regulates epidermal growth factor (EGF) receptor expression and cancer cell survival via MicroRNA-7[J].J Biol Chem,2011,286(28):25377-25386.

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.13.045

國家自然科學(xué)基金資助項目(81271838)。

李麟(1988-)，博士研究生，主要從事病毒性肝炎研究。

△通訊作者，E-mail：cqqinbo@126.com。

R512.6

A

1671-8348(2015)13-1851-03

2014-12-28

2015-02-28)