★　張偉　焦琳　李海瀾　(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院　南昌 330006)

懸灸“大椎”穴對(duì)哮喘神經(jīng)源性炎癥的影響*

★張偉*第一作者:張偉(1978—)，女，博士，副主任中醫(yī)師，講師。研究方向：腧穴敏化規(guī)律。焦琳李海瀾(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院南昌 330006)

摘要：目的:探討懸灸“大椎”穴對(duì)哮喘大鼠神經(jīng)源性炎癥相關(guān)因子的影響。方法:懸灸大鼠“大椎”穴，運(yùn)用ELISA雙抗體夾心法測(cè)定大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的NGF、pERK、NKA、NKB、SP、CGRP等神經(jīng)源性炎癥相關(guān)因子的含量。結(jié)果:模型組中NGF、pERK、NKA、NKB、SP、CGRP的含量較空白組有非常顯著性升高((P<0.01)，而治療組各因子的含量與模型組比較有非常顯著性降低(P<0.01)。結(jié)論:哮喘的發(fā)作可能與神經(jīng)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥有非常密切的相關(guān)性，而懸灸“大椎”穴可通過抑制其相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來降低神經(jīng)源性炎癥，從而降低哮喘的炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：懸灸；大椎；哮喘；神經(jīng)生長(zhǎng)因子

支氣管哮喘是一種以氣管高反應(yīng)性和氣管變態(tài)性炎癥為特征的慢性氣管炎癥。在以往的研究中，哮喘的免疫源性因素被研究頗多，但近年來神經(jīng)源性因素的影響漸漸成了研究的熱點(diǎn)，神經(jīng)-免疫的綜合作用可能為哮喘發(fā)作的重要途徑。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)在神經(jīng)源性哮喘的發(fā)作中起到核心的作用。它是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。它具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)發(fā)育的作用。NGF可通過與其高親和力受體TrkA結(jié)合，通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)途徑，參與合成某些促進(jìn)哮喘的神經(jīng)肽類物質(zhì)[1]，如神經(jīng)激肽A(NKA)、神經(jīng)激肽B、(NKB)P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)等神經(jīng)肽類物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)加重氣道炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)氣道高阻性。

本研究擬通過觀察懸灸法對(duì)哮喘大鼠的神經(jīng)源性炎癥相關(guān)因子的改善作用，探討艾灸治療哮喘的神經(jīng)源性炎癥相關(guān)機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與分組由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供的清潔級(jí)雄性SD大鼠36只，體重200～220g，許可證號(hào)：SCXK(湘)2013-0005。由江西中醫(yī)藥大學(xué)灸療研究實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，良好的通風(fēng)條件，室溫25℃，空氣濕度為50%。按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、治療組3組，每組12只。

1.2主要試劑和儀器大鼠NGF、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(pERK)、NKA、NKB和SP、CGRP酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海偉進(jìn)生物科技有限公司)，超聲霧化器(型號(hào)：402AI，上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)，酶標(biāo)儀(型號(hào)：Multiskan mk3，芬蘭雷勃公司)，艾條：4mm×10mm(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生產(chǎn))。

1.3造模方法[2]大鼠于第1d、第8d腹腔注射10%卵白蛋白(OVA)和氫氧化鋁(AL(OH)3)溶液0.2mL，2次致敏，于實(shí)驗(yàn)第15d起開始霧化吸入1%OVA溶液30min誘喘，霧化流量3mL/min。空白組用注射用水代替卵清白蛋白液進(jìn)行注射和霧化吸入。以大鼠出現(xiàn)煩躁、打噴嚏、嗆咳、呼吸幅度加大、頻率加快，腹式呼吸或點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)，甚者出現(xiàn)呼吸減慢或節(jié)律不整，行動(dòng)遲滯或俯伏不動(dòng)、四肢癱軟、反應(yīng)遲鈍等癥狀為激發(fā)成功。

1.4艾灸方法造模成功后，開始介入艾灸治療。用固定夾將大鼠固定后，選取大鼠大椎穴，定位取穴按照胡元亮所編《實(shí)用動(dòng)物針灸手冊(cè)》，取第七頸椎與第1胸椎之間背部正中。用1支艾條懸于大椎穴上約2cm處先回旋灸2min預(yù)熱局部皮膚，再固定于大椎穴施行溫和灸，于實(shí)施者將食指放于大椎穴處有溫?zé)岣袨橐恕Ｃ咳沼谠?0:00時(shí)起，對(duì)治療組懸灸30min，共治療7d。

1.5樣本采集及檢測(cè)各組大鼠在治療結(jié)束2h內(nèi)，用1%戊巴比妥鈉(90mg/kg)腹膜腔注射麻醉，暴露肺組織，分離氣管，結(jié)扎右主支氣管，向左肺勻速注入4mL無菌生理鹽水，反復(fù)回抽3次，回收BALF并計(jì)量，回收率大于80%，采集BALF后，離心10min(1 000r/min)，取其上清液。NGF、pERK、NKA、NKB和SP、CGRP采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠BALF中NGF、pERK含量的對(duì)比見表1、圖1。

組別NGF/pg·mL-1pERK/U·mL-1空白組37.63±8.1421.13±4.49模型組162.36±37.18●130.47±26.58●治療組83.02±17.69▲52.84±10.61▲

注：與空白組比較，●P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01。

結(jié)果表明：模型組BALF中NGF、pERK的含量明顯高于空白組(P<0.01)，說明哮喘的發(fā)作與NGF、pERK的含量有顯著相關(guān)性；治療組與模型組比較，BALF中NGF、pERK的含量有非常顯著性降低(P<0.01)，說明懸灸治療對(duì)降低NGF、pERK的含量具有顯著作用。

圖1　BALF中NGF、pERK含量比較

2.2各組大鼠BALF中SP、CGRP、NKA、NKB含量的對(duì)比見表2、圖2。

表2　各組大鼠BALF中

注：與空白組比較，●P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01。

結(jié)果表明，模型組大鼠BALF中SP、CGRP、NKA、NKB含量明顯高于空白組(P<0.01)，說明SP、CGRP、NKA、NKB參與了哮喘的發(fā)作；治療組BALF中SP、CGRP、NKA、NKB的含量與模型組比較亦有非常顯著性差異(P<0.01)，說明懸灸大椎穴可降低此類神經(jīng)肽類物質(zhì)的含量，從而減輕哮喘的發(fā)作。

圖2　BALF中SP、CGRP、NKA、NKB含量對(duì)比

3討論

哮喘氣道的炎性反應(yīng)，以往對(duì)其免疫源性因素研究頗多，近年來神經(jīng)源性因素的作用越來越被重視。NGF是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族成員，它不僅調(diào)控神經(jīng)發(fā)育、存活及維護(hù)其功能，也參與免疫炎癥調(diào)控，以及復(fù)雜的神經(jīng)-免疫相互作用[3]。如它可促使大鼠皮膚血管通透性增強(qiáng)，使肥大細(xì)胞數(shù)量增多并促其快速脫顆粒等。所以當(dāng)病毒、細(xì)菌或其他變應(yīng)原刺激氣道的炎癥細(xì)胞時(shí)，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞釋放NGF，這些NGF可通過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，釋放其下游活性物質(zhì)-神經(jīng)肽類物質(zhì)，如NKA、NKB、SP、CGRP等，此類神經(jīng)肽類物質(zhì)可以促進(jìn)氣道黏液高分泌、促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放、收縮氣道平滑肌及增加氣道高反應(yīng)性等作用，因而認(rèn)為它們可能參與哮喘的生理病理過程[4-7]。

目前認(rèn)為，NGF最可能通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來誘發(fā)哮喘。NGF與其高新和力受體TrkA結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過Ras-Raf-MEK一系列級(jí)連反應(yīng)導(dǎo)致ERK磷酸化，激活的ERK進(jìn)入細(xì)胞核，將細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)，參與轉(zhuǎn)錄。有研究[1]初步證實(shí)了哮喘豚鼠初級(jí)傳入神經(jīng)元(C7-T5脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元)的NGF被過度激活，NGF可上調(diào)其活化ERK的表達(dá)，而應(yīng)用anti-NGF后，活化ERK的表達(dá)下調(diào)。過度激活的ERK進(jìn)入細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子，參與合成促進(jìn)哮喘發(fā)作的某些神經(jīng)肽類物質(zhì)。

支氣管哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“哮病”“喘證”范疇，中醫(yī)認(rèn)為哮喘為外因或外邪引觸宿痰，以致肺失肅降，痰阻氣道，氣道攣急所致。其病因主要是由于肺、脾、腎三臟不能布散、運(yùn)化、蒸騰氣化津液，以致聚濕成痰，伏藏于肺，成為發(fā)病的潛在夙根，因各種誘因而引發(fā)，故其病位雖在肺，但與腎、脾關(guān)系密切。督脈為陽脈之海，總督一身之陽，為機(jī)體的動(dòng)力之源，而大椎穴位于督脈第七頸椎棘突下，手足三陽的陽熱之氣由此匯入本穴并與督脈的陽氣上行頭頸，有溫陽補(bǔ)虛、宣肺平喘之功，多治療肺之疾病，如感冒、咳喘、寒熱不調(diào)等。艾灸大椎是臨床治療哮喘的常用方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組的大鼠BALF中NGF、pERK、NKA、NK、BSP、CGRP含量較空白組有非常顯著性升高(P<0.01)，說明哮喘的發(fā)生可能與NGF引起的神經(jīng)源性炎癥有密切相關(guān)，且NGF可能與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(ERK途徑)有關(guān)，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶被磷酸化(pERK)后進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)哮喘發(fā)作的神經(jīng)肽類物質(zhì)(NKA、NKB、SP、CGRP)的釋放；治療組與模型組比較，大鼠BALF中神經(jīng)源性炎癥相關(guān)因子含量皆有非常顯著性降低(P<0.01)，說明懸灸大椎穴可以通過降低哮喘大鼠的神經(jīng)源性炎癥來改善氣道的炎性反應(yīng)和氣道高阻性。

參考文獻(xiàn)

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The Influence of Suspended Moxibustion "Da-zhui" Point on Neurogenic Inflammation of Asthma

ZHANG Wei, JIAO Lin, LI Hai-lan

TheAffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTCM，Nanchang330006,China.

Abstract:Objective：To explore the effect of suspended moxibustion "Da-zhui" point on neurogenic inflammation mechanism of asthma rats. Method：Suspend "Da-zhui" point of the rats,then use the method of ELISA(enzyme-linked immuno sorbent assay) assaying the levels of related factors to neurogenic inflammation such as NGF、pERK、NKA、NKB、SP、CGRP in bronchoalveolar lavage(BALF). Results：The levels of NGF、pERK、NKA、NKB、SP、CGRP of model group were much higher than blank control group (P<0.01),while the levels of correlated factors of treatment group were much lower than model group(P<0.01). Conclusion：The attack of asthma may have close correlation with neurogenic inflammation mediated by nerve growth factor,while moxibustion can reduce neurogenic inflammation by restraining related cascade reaction.

Key words:Suspended Moxibustion；"Da-zhui" Point；Asthma；Nerve Growth Factor

收稿日期：(2015-04-27)編輯：秦小瓏

中圖分類號(hào)：R245.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

基金項(xiàng)目：*江西省自然科學(xué) (20122BAB205092)。