N-乙酰半胱氨酸對犬細小病毒誘導的MDCK細胞凋亡及活性氧的影響

邱先帥，張　浩，肖熹玉，任常寶，唐兆新，＊（.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州5064；.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東肇慶5638）

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N-乙酰半胱氨酸對犬細小病毒誘導的MDCK細胞凋亡及活性氧的影響

邱先帥1，張浩1，肖熹玉1，任常寶2，唐兆新1，2＊
（1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州510642；2.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東肇慶526238）

摘 要：為探討N-乙酰半胱氨酸（25μg/mL）對犬細小病毒侵染MDCK細胞的保護作用，采用噻唑蘭比色法來檢測NAC對染毒MDCK細胞增殖率的影響，流式細胞術檢測NAC對染毒MDCK細胞凋亡率及活性氧ROS水平。結果表明，與對照組相比，染毒組細胞增殖顯著下降（P＜0.05），而NAC組細胞增殖顯著高于攻毒組（P＜0.05）；染毒組細胞凋亡率顯著上升，胞內ROS水平顯著升高（P＜0.05），呈時間-效應關系，但NAC組明顯減輕上述情況。NAC可通過降低ROS的產(chǎn)生從而改善染毒的MDCK細胞凋亡，對細胞起到保護作用。

關鍵詞：犬細小病毒；N-乙酰半胱氨酸；增殖率；細胞凋亡；活性氧

近年來，寵物犬的數(shù)量逐年遞增，對犬細小病毒的防治還是以弱毒苗免疫為主，但其效果越來越差，給犬細小病毒的防治帶來一定壓力［1］。犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）是細小病毒科，細小病毒屬的單鏈DNA病毒，以出血性腸炎、脫水和心肌炎等為主要癥狀，該病首次在美國發(fā)現(xiàn)，是目前影響?zhàn)B犬業(yè)和寵物業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一，發(fā)病率高達100%［2-4］。體外研究表明，CPV 能在體外培養(yǎng)的犬細胞和貓細胞中感染，如犬腎細胞（MDCK）。犬細小病毒侵入細胞后，利用細胞內物質進行自身復制，刺激宿主細胞，使細胞內活性氧含量增加，過量的活性氧對細胞內線粒體造成結構和功能性的氧化損傷，激發(fā)細胞凋亡程序，從而引起細胞凋亡［5］。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一種抗氧化劑，作為半胱氨酸的衍生物，具有較強的抗氧化功能、干擾自由基生成、抗細胞凋亡等作用［6-7］，從而起到保護細胞作用。本研究通過建立犬細小病毒侵染MDCK細胞模型，觀察NAC對病毒引起的細胞凋亡的抑制作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞和病毒 犬細小病毒由肇慶大華農(nóng)生物藥業(yè)有限公司保存，MDCK細胞為肇慶大華農(nóng)生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2試劑及相關材料 DMEM培養(yǎng)基、2.5g/L胰酶-EDTA溶液為GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；噻唑蘭、維生素C、N-乙酰半胱氨酸為Sigma公司產(chǎn)品；活性氧試劑盒為凱基生物公司產(chǎn)品；Annexin V-FITC/PI試劑盒為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及攻毒 用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、體積分數(shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MDCK細胞，待細胞長滿單層后，用2.5g/L胰蛋白酶進行消化，鏡下觀察，細胞收縮變圓后棄去胰酶，加入培養(yǎng)液輕輕吹打細胞，1∶6進行傳代，傳3代穩(wěn)定后進行試驗。試驗分組：正常對照組，以DMEM+100mL/L FBS完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；病毒組，按培養(yǎng)液量的100g/L將犬細小病毒接種于細胞；試驗組，以10%接毒量培養(yǎng)24h后換2%維持液事先配好的25μg/mL NAC繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2細胞增殖測定 常規(guī)消化MDCK細胞，通過細胞計數(shù)調至細胞數(shù)為1×106個/mL，同步接毒接入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μL，24h長滿單層后，棄去孔內培養(yǎng)液，細胞對照組和病毒組加100μL 2%維持液、試驗組加100μL NAC，每個組重復4孔，分別培養(yǎng)24、48h后，加入20μL/孔MTT試劑，孵育4h后棄去，加入150μL/孔二甲基亞砜充分溶解，于490nm波長處測定OD值。

1.2.3MDCK細胞凋亡率的測定 將MDCK細胞常規(guī)消化接種于6孔板（1×106個/mL），同步接毒培養(yǎng)24h后，進行試驗分組，分別于24h、48h消化收集細胞于離心管中，4℃、1 500r/min離心5min，用4℃PBS洗兩次后，按Annexin V-FITC/ PI試劑盒說明書，將細胞重懸于500μL 1×Binding buffer，加入5μL的FITC和5μL的PI輕輕混勻，于室溫避光孵育15min，經(jīng)流式細胞儀進行檢測。1.2.4 MDCK細胞活性氧含量的測定 常規(guī)方法消化收集細胞于離心管內，4℃、1 500r/min離心5min。按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。去除離心管內細胞培養(yǎng)液，加入1mL稀釋好的DCFH-DA，37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFHDA，流式細胞儀檢測。

1.2.5統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)用-x±SD表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析。

2　結果

2.1NAC對攻毒的MDCK細胞增殖的影響

如圖1所示，犬細小病毒分別染毒24h、48h后，病毒組細胞的OD值顯著小于對照組細胞（P＜0.05），且呈時間-效應關系，說明染毒后病毒明顯抑制MDCK細胞增殖，而添加NAC組的細胞與染毒組相比，OD值顯著增高（P＜0.05），抑制作用明顯改善。

圖1　不同試驗組對MDCK細胞增殖的影響Fig.1 The effects of different level groups on MDCK cell proliferation

2.2NAC對攻毒的MDCK細胞凋亡率測定

如表1所示，24h后，與對照組相比，病毒組凋亡率明顯高于對照組（P＜0.05），說明犬細小病毒引起MDCK細胞凋亡，而NAC試驗組明顯低于病毒組（P＜0.05），顯著抑制了細胞的凋亡，從而起到保護細胞作用；同樣，48h也是如此。各處理組細胞隨著時間的延長，凋亡率均明顯增加，且呈一定時間-效應關系。

表1　不同試驗組對MDCK細胞凋亡測定的影響Table 1 The effects of different level groups on MDCK cell apoptosis assay　%

2.3NAC對攻毒的MDCK細胞內ROS水平影響

如表2所示，各處理組的MDCK細胞均隨著時間的延長，胞內活性氧水平均逐漸升高，呈一定時間—效應關系。各時間段內，病毒組MDCK細胞內ROS水平明顯高于對照組（P＜0.05），而NAC試驗組細胞內ROS水平和病毒組相比，細胞ROS水平明顯降低（P＜0.05），說明NAC抑制病毒引起的細胞內活性氧升高。

表2　不同試驗組對MDCK細胞內ROS測定的影響Table 2 The effects of different level groups on MDCK cell ROS assay　%

3　討論

細胞凋亡是細胞本身自我調節(jié)的、由基因控制、自發(fā)性的一種程序性死亡，它可以由自身產(chǎn)生，也可以由一系列生理或病理的刺激誘導產(chǎn)生［8］，其中病毒感染是誘導因素之一。它和壞死性死亡是截然不同的兩種死亡形式。本試驗用MTT對病毒組細胞進行存活率測定發(fā)現(xiàn)，攻毒細胞的OD值顯著小于對照組，存活率明顯下降，此時細胞損傷包括細胞凋亡、細胞死亡、自噬式死亡等，細胞凋亡只是其中一種形式，而NAC試驗組的OD值明顯比攻毒組高，說明NAC對病毒組細胞的死亡有一定改善。研究表明，越來越多的病毒感染可以使宿主細胞產(chǎn)生凋亡［9］。杜林林等［10］發(fā)現(xiàn)，犬細小病毒能誘導腸黏膜細胞凋亡及復方苦芩對其抑制作用。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，病毒組細胞隨著時間的延長，凋亡率逐漸升高，與對照組相比呈顯著性差異（P＜0.05），說明犬細小病毒能夠明顯誘導MDCK細胞凋亡，而25μg/mL NAC試驗組的細胞凋亡率明顯比病毒組高（P＜0.05），提示一定濃度的NAC具有拮抗病毒誘導細胞凋亡的作用。

有關病毒引起細胞凋亡機制的觀點很多，而且在不同的細胞中，引起的細胞凋亡不完全一致［11］。線粒體途徑是細胞凋亡的一個重要途徑，線粒體是細胞活動最為重要的一個細胞器，它包含了一些與細胞凋亡密切相關的物質，如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）、細胞色素C等。過多的ROS會導致細胞DNA損傷、線粒體廣泛性氧化損傷及影響信號轉導，從而引起細胞凋亡［12］。本試驗結果表明，24h和48h時，各病毒組與對照組相比，細胞內ROS水平顯著升高（P＜0.05），且呈現(xiàn)時間-效應關系，而NAC試驗組則有明顯的抑制ROS升高作用。試驗結果發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率與細胞內ROS水平呈正相關，提示犬細小病毒導致MDCK細胞凋亡過程中ROS發(fā)揮了一定作用。

NAC是一種合成抗氧化劑，它是細胞內還原性谷胱甘肽的前體，促進谷胱甘肽的合成。NAC具有抗凋亡作用，能夠清除細胞內活性氧自由基，從而干擾凋亡的信號轉導［13］，越來越多研究［14-16］表明，NAC可抑制多種因素導致的細胞凋亡，如NAC可明顯抑制由過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞凋亡，減弱由鎘導致大鼠大腦皮質神經(jīng)細胞凋亡及ROS水平，對活性氧誘導的耳蝸毛細胞凋亡也有明顯的抑制作用。本試驗研究表明，NAC可使犬細小病毒致MDCK細胞存活率有升高趨勢，且差異性顯著，也能夠明顯降低細胞凋亡率及ROS水平，說明NAC可以有效清除犬細小病毒導致的細胞內過多的ROS，從一定程度上可以阻止細胞凋亡的發(fā)生，但其分子機制有待進一步研究。

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Effects of N-acetylcysteine on Canine Parvovirus Induced Apoptosis and Reactive Oxygen Species of MDCK Cells

QIU Xian-shuai1，ZHANG Hao1，XIAO Xi-yu1，REN Chang-bao2，TANG Zhao-xin1，2
（1.College of Veterinary Medicine，South China Agriculture University，Guangzhou，Guangdong，510642，China；2.Zhaoqing Dahuanong Biology Medcine Co.，Ltd，Zhaoqing，Guangdong，526238，China）

Abstract：To explore the protective effect of N-acetylcysteine（25μg/mL）on canine parvovirus infection in MDCK cells，the proliferation rate of NAC on the infected MDCK cells was measured by MTT assay.The apoptosis rate and reactive oxygen species were detected by flow cytometry.The results showed that the cell proliferation rate of infected group decreased significantly（P＜0.05），compared with the control group，but the rate of NAC group was significantly higher than that of the infected group（P＜0.05）；The apoptotic rate and intracellular ROS levels of infected group was significantly increased（P＜0.05）with a certain time-effect relationship，but the NAC group significantly reduced this situation.Conclusion：NAC obviously protects MDCK cells against canine parvovirus induced apoptosis by reducing ROS.

Key words：Canine parvovirus；N-acetylcysteine；viability；apoptosis；reactive oxygen species

作者簡介：邱先帥（1988-），女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)內科學研究。＊通訊作者

收稿日期：2014-12-24

中圖分類號：S852.3

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）07-0018-04