利用16 Sr-DNA高通量測序技術(shù)對發(fā)酵床墊料微生物區(qū)系的分析

管業(yè)坤，楊　艷△，王榮民*，婁佑武，吳志勇，涂凌云( .江西省畜牧技術(shù)推廣站，江西 南昌 330046；.南昌市動物疫病預(yù)防控制中心，江西 南昌330008)

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利用16 Sr-DNA高通量測序技術(shù)對發(fā)酵床墊料微生物區(qū)系的分析

管業(yè)坤1，楊艷△1，王榮民1*，婁佑武1，吳志勇1，涂凌云2( 1.江西省畜牧技術(shù)推廣站，江西 南昌 330046；2.南昌市動物疫病預(yù)防控制中心，江西 南昌330008)

[摘要]本研究旨在了解發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料微生物菌群區(qū)系結(jié)構(gòu)，探索菌種及墊料對發(fā)酵床墊料微生物區(qū)系的影響。將商業(yè)菌、土著菌分別接種于含稻殼與鋸末成分比為1∶1和2∶1墊料中，制作成四個處理組的發(fā)酵床，經(jīng)154 d豬飼養(yǎng)試驗后，收集發(fā)酵床墊料，采用16Sr-DNA高通量測序技術(shù)對發(fā)酵床中微生物區(qū)系進行測定分析。結(jié)果表明：(1)豐富度方面，土著菌(Chao指數(shù)：10175～10754)豐富度高于商業(yè)菌(Chao指數(shù)：6720～7554)；(2)相似性方面，商業(yè)菌種處理的菌群結(jié)構(gòu)受墊料因素的影響較小，土著菌處理的菌群結(jié)構(gòu)受墊料因素的影響較大；(3)多樣性方面，墊料對菌群多樣性的影響較菌種對其的影響大，且稻殼與鋸末比值為2∶1的墊料微生物多樣性(shannon指數(shù)：6.64～6.91)高于稻殼與鋸末比值1∶1的墊料微生物多樣性(shannon指數(shù)：5.90～5.94)；(4)菌群組成方面，發(fā)酵床墊料菌群主要由4個門組成：擬桿菌門(27.66%～60.93%)、厚壁菌門(13.41%～34.21%)、變形菌門(10.28%～14.71%)和放線菌門(4.63%～26.24%)，并從屬水平上確定了Galbibacter為發(fā)酵床墊料微生物的優(yōu)勢菌屬。試驗發(fā)現(xiàn)菌種和墊料對發(fā)酵床墊料微生物區(qū)系的豐富度、相似性、多樣性均有不同程度的影響。

[關(guān)鍵詞]16Sr-DNA高通量測序；發(fā)酵床；微生物區(qū)系；菌種；墊料

發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)是通過發(fā)酵床墊料中有益微生物消納生豬的排泄物，有效解決生豬生產(chǎn)帶來的環(huán)境污染問題[1]。近年來，發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)在我國得到廣泛的推廣應(yīng)用。目前，國內(nèi)外對發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)的研究多在菌種的選擇、墊料組成、養(yǎng)豬效果及欄舍設(shè)計等方面，對發(fā)酵床墊料微生物區(qū)系研究報道較少，菌種、墊料組成對墊料微生物群落多樣性的研究更是未見報道，而發(fā)酵床養(yǎng)豬的核心是墊料中微生物菌落分布。因此，菌種與墊料的選擇及其相互作用研究是發(fā)酵床養(yǎng)殖模式在全國范圍內(nèi)推廣亟待解決的首要問題。

近年來，不依賴于微生物純培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法被廣泛地應(yīng)用于微生物多樣性研究中，這些技術(shù)主要包括：單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-Strand Conformation Poly-morphism SSCP)、熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、定量PCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction)等[2-7]。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，以454焦磷酸測序為代表的高通量測序技術(shù)憑借低成本、高通量、流程自動化的優(yōu)勢為研究微生物群落結(jié)構(gòu)提供了新的技術(shù)平臺[8-9]。Roche 454高通量測序技術(shù)能同時對樣品中的優(yōu)勢物種、稀有物種及一些未知的物種進行檢測，獲得樣品中的微生物群落組成，并將其含量進行數(shù)字化[10-11]。該技術(shù)適于對短序列的測序分析，在土壤、海洋、活性污泥、廢水、腸道、湖鹽等環(huán)境微生物多樣性研究中都有應(yīng)用[9,12]。

試驗選擇商業(yè)菌洛東酵素及自制土著菌接種不同原料比例的墊料，采用16Sr-DNA測序技術(shù)對不同發(fā)酵墊料微生物群落多樣性進行研究，旨在分析不同墊料及菌種來源的微生物菌群結(jié)構(gòu)差別，為后續(xù)優(yōu)化發(fā)酵床墊料微生物菌群結(jié)構(gòu)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種洛東酵素由日本洛東化成工業(yè)株式會社、福建洛東生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。其主要成分為枯草芽孢桿菌1.0×106菌數(shù)/g、淀粉酶≥2 000 U/g、蛋白酶≥500 U/g、粗蛋白質(zhì)≥10%和水份≤10%。土著菌由南昌地區(qū)附近選擇落葉或腐殖土較多的小山丘(高出平地100～200 m)采集原種，擴繁培養(yǎng)。

1.1.2試驗動物每組試驗動物由20頭35日齡、體重8 kg的杜×長×大三元雜交豬組成。

1.1.3樣本的制備及采集墊料中鋸末、稻殼共占95%，麥麩占2%，新鮮泥土占2.87%，粗鹽占0.1%，另添加菌種，約占墊料重量的0.03%。充分混勻后，灑水?dāng)嚢柽_到握緊成團、松開即散的狀態(tài)后堆積在濕度45%～55%的舍內(nèi)環(huán)境。7 d后鋪平發(fā)酵墊料(墊料厚度70～80 cm)，再過7 d開展豬的飼養(yǎng)試驗。經(jīng)過31 d的保育期、123 d的育肥期后，采集各組發(fā)酵床墊料，置于-80 ℃保存。

表1　發(fā)酵墊料試驗分組

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA的提取及檢測參照OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提細(xì)菌基因組DNA并進行1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2細(xì)菌16S rDNA PCR擴增、建庫及測序使用細(xì)菌16S rDNA V1-V3區(qū)通用引物(27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，533R： 5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)，拼接上adapter和barcode序列。

PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系：5 ×擴增緩沖液4 μL，2.5 mM 的dNTPs混合物2 μL，5 μM的上下游引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，加雙蒸水至20 μL。

PCR儀：ABI GeneAmp○R9700型

PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；25個循環(huán)：72 ℃ 5 min；10 ℃至反應(yīng)結(jié)束。

每個樣本3個重復(fù)，將同一樣本混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳，使用AXYGEN 公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCL洗脫；2% 瓊脂糖電泳檢測。將構(gòu)建好的PCR產(chǎn)物文庫參照電泳初步定量結(jié)果，使用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行定量，按每個樣本的測序量比例混合。

使用Roche指定的GS FLX Titanium emPCR Kits (Lib-L)制備EmPCR產(chǎn)物，在Roche 454 GS FLX平臺上進行測序。

1.3數(shù)據(jù)分析

1.3.1有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計及優(yōu)化454測序數(shù)據(jù)根據(jù)barcode標(biāo)簽區(qū)分識別樣本，提出每個樣本序列數(shù)據(jù)，使用seqcln檢測接頭并修剪末端，使用mothur篩選序列。

1.3.2OTU分析優(yōu)化后的序列與silva庫中的aligned核糖體序列數(shù)據(jù)庫進行比對，對序列進行聚類分析，序列歸類操作單位OTU (reads相似度達 97% 以上)。利用Mothur(version 1.5.0)根據(jù)OTU計算樣本菌群的多樣性指數(shù)(Shannon)、豐富度指數(shù)(Chao)、測序深度及Shannon曲線。

1.3.3分類分析將每一條優(yōu)質(zhì)序列都與SILVA(SSU11版)的SSU rRNA數(shù)據(jù)庫進行比對，找出最相近且可信度達80%以上的種屬信息。為獲得每個OUT的分類信息，將97% 相似水平下每一個OUT中的所有序列進行一致性分析，找出同一OUT中不同序列的最近祖先的種屬信息作為該OUT的種屬信息。

1.3.4多樣品相似樹狀圖使用軟件mothur相似樹分析得到樹狀關(guān)系數(shù)據(jù)，計算距離矩陣的算法為jes(tJaccard coefficient using richness estimators)，最后用 R 語言作圖畫樹。 jest 算法采用傳統(tǒng)的 Jaccard 指數(shù)，其中每個樣本的 OTU(97%相似性)及共有的 OTU 是用 Chao1豐富度估計指數(shù)計算。

1.3.5群落結(jié)構(gòu)分析在分類研究的基礎(chǔ)上，使用統(tǒng)計學(xué)分析方法，觀測樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)。本研究分別于門、屬水平做多樣本的柱狀圖。分析使用基本分析生成的 taxlevel 文件夾中數(shù)據(jù)表，通過 R 語言作圖。

1.3.6樣本菌群群落差異顯著性利用matastats在屬水平進行兩組樣本的顯著性差異分析。

2結(jié)果與分析

2.1測序序列統(tǒng)計及優(yōu)化

對4個樣本進行454測序，共得到64 651條有效序列，每個樣本測序量高于10 000條以上，每條序列平均長度413 bp。按照優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)，對結(jié)果進行去雜，共得到49 053條優(yōu)質(zhì)16S rDNA基因序列，序列平均長度468 bp，平均每個樣本12 263條序列，最少7 431條，最多19 600條，優(yōu)化效率均在70%以上，見表2。優(yōu)化序列用于樣本間微生物豐富度和多樣性的評估。

各樣本序列長度分布如圖1所示，80%的序列長度都在401 bp～540 bp之間，因此認(rèn)為此次測序覆蓋了16Sr-DNA V1-V3區(qū)的全部序列。

2.2樣本菌群豐富度和多樣性指數(shù)

樣本菌群豐富度和多樣性指數(shù)、測序深度見表3，OUT相似性水平選取97%(0.03)。Shannon曲線見圖2，Shannon曲線是反映各樣本在不同的測序數(shù)量時對應(yīng)的微生物多樣性。當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。

表2　各樣本序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計

圖1　序列長度分布

圖2　Shannon曲線評估樣本菌群豐富度

樣本SampleOUT(0.03)ChaoShannonCoverage1222367205.940.782250275546.640.7233791101755.900.8443647107546.910.76

4個樣本的測序深度Coverage指數(shù)具有較高的值，均大于0.70，Shannon曲線趨于平坦，說明此次測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息，表示此次測序的結(jié)果可以代表樣本的真實情況。

比較4個樣本的豐富度指數(shù)，結(jié)果顯示，土著菌處理樣本的豐富度高于商業(yè)菌處理樣本，相同菌種中稻殼與鋸末比值2∶1墊料樣本豐富度略高于稻殼與鋸末比值1∶1墊料樣本。

2.3全樣本相似度對比

用Jaccard指數(shù)算法比較多個樣本的OTU(0.03相似水平)差異及各OTU中含有的序列多少，得到多樣本相似度樹狀圖。

由圖3可以看出，樣本1和樣本2的相似度為0.431，樣本3與樣本1和樣本2的相似度差0.008，與樣本4的相似度差0.006，樣本4與樣本1和2的相似度差0.014。

圖3　多樣本相似樹狀圖

樣本間相似性呈現(xiàn)一定規(guī)律，表現(xiàn)為：商業(yè)菌的2個處理樣本相似性最高，土著菌的2個處理樣本相似性次之，土著菌處理中稻殼與鋸末比值2∶1的墊料樣本與商業(yè)菌的兩個處理樣本間相似性最低。

由此看出，菌種與墊料均可以使得墊料菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，商業(yè)菌種處理樣本的菌群結(jié)構(gòu)受墊料因素的影響較小，土著菌處理樣本的菌群結(jié)構(gòu)受墊料因素的影響較大；稻殼與鋸末比值1∶1墊料樣本的菌群相似度差(0.008)低于稻殼與鋸末比值2∶1墊料樣本的相似度差(0.014)，即說明稻殼與鋸末比值1∶1的墊料樣本相似度要高于稻殼與鋸末比值2∶1墊料樣本的相似度。

2.4樣本門水平菌群結(jié)構(gòu)分析

對4個樣本的序列進行門水平的分析，結(jié)果見圖4。各樣本間具有相似的門分類概況，墊料細(xì)菌群落主要由4個門組成：擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)。

樣本中占菌群比例大于1%的菌門具體見表4。

圖4　樣本菌群結(jié)構(gòu)比例柱狀圖(門水平)

菌種及墊料組成均對擬桿菌門比例有不同程度的影響，且受墊料因素影響較大。從墊料組成因素分析，擬桿菌門所占菌群比例在稻殼與鋸末比值1∶1墊料樣本中為57.47%～60.93%，在稻殼與鋸末比值2∶1墊料樣本中為27.66%～38.93%，下降了56.5%～107.7%；從菌種因素分析，擬桿菌門所占菌群比例在商業(yè)菌種接種的墊料樣本中為27.66%～57.47%，在自制土著菌中為38.93%～60.93%，增加了6.02%～40.74%。

菌種及墊料組成均對厚壁菌門比例有不同程度的影響，且受墊料因素影響較大。從墊料組成因素分析，厚壁菌門所占菌群比例在稻殼與鋸末比值1∶1墊料樣本中為13.41%～18.57%，在稻殼與鋸末比值2∶1墊料樣本中為28.60%～34.21%，增加了84.22%～113.3%；從菌種因素分析，厚壁菌門所占比例在商業(yè)菌種接種的墊料樣本中為13.41%～28.60%，在自制土著菌中為18.57%～34.21%，增加了19.62%～38.48%。

土著菌處理的稻殼與鋸末比值2∶1墊料樣本的變形菌門所占比例在4個樣本中最高，為14.71%，其他3個樣本值在10.28%～11.19%之間。

放線菌所占比例在商業(yè)菌處理的墊料樣本中較高，為10.61%～26.24%，在土著菌處理樣本中較低，為4.63%～6.25% 。

2.5樣本屬水平菌群結(jié)構(gòu)分析

圖5樣本菌群結(jié)構(gòu)柱狀對比圖(屬水平)

Fig. 5 The column graph of micro-flora structural proportion of samples (genus level)

對4個樣本的序列進行屬水平分析，低于0.05水平歸為其他，各菌種所占比例如圖5所示。由圖5可以看出，發(fā)酵床細(xì)菌呈現(xiàn)較高的多樣性，分布在至少41個屬中，但優(yōu)勢菌相對不明顯。

對樣本1～4兩兩之間進行顯著性差異分析，發(fā)現(xiàn)不同菌種及墊料組成對墊料菌群結(jié)構(gòu)均有影響。將樣本中占菌群比例差異顯著的菌種整理(P<0.05)，具體見表5。

由表5可知，相同墊料不同菌種處理組間進行比較，樣本1中的Luteibacter、Brachybacterium、Microbacterium、Corynebacterium等23個菌屬含量比例與樣本3中的含量差異顯著(P<0.05)；樣本2與樣本4相比，其中Luteibacter、Brachybacterium、Peptostreptococcaceae-incertae-sedis、Microbacterium、Corynebacterium等32個菌屬含量比例差異顯著(P<0.05)。

相同菌種不同墊料處理組間進行比較，樣本1中Galbibacter、Saprospiraceae-uncultured、Brachybacterium、Luteimonas等19個菌屬含量比例與樣本2的差異顯著(P<0.05)，樣本3的Galbibacter、Weeksella、Saprospiraceae-uncultured、Luteimonas等30個菌屬含量比例與樣本4的差異顯著(P<0.05)。

四個處理組中的菌群結(jié)構(gòu)中，樣本1相對于其他3個樣本，Saprospiraceae-uncultured、Luteimonas2個菌屬含量較為豐富；樣本2相對其他3個樣本，Luteibacter、Brachybacterium、Peptostre-ptococcaceae-incertae-sedis、Plantibacter、Clostridium、Luteipulveratus、Streptococcus、Ornithinicoccus、Rhodococcus9個菌屬含量較為豐富；樣本3相對其他3個樣本，Weeksella、Lysobacter、Galbibacter3個菌屬含量較為豐富；樣本4相對其他3個樣本，F(xiàn)lavobacterium、Alcaligenaceae-uncultured、Kurthia、Brumimicrobium、Halocella、Christensenellaceae_uncultured、Bacillus、Persicitalea、Olivibacter、Methylococcaceae_uncultured、Tepidimicrobium、Solibacillus、Sphingobacterium、Niabella、Haloplasma15個菌屬含量較為豐富。

3討論

試驗采用了高通量技術(shù)對發(fā)酵床墊料中微生物菌群進行了研究。16Sr-rDNA是細(xì)菌的系統(tǒng)分類研究中有價值的分子，其可變區(qū)序列因細(xì)菌不同而異。利用可變區(qū)V3序列的差異可對不同屬、種的細(xì)菌進行分類鑒定，進行種屬分類，同時該方法具有速度快、通量高、成本低的優(yōu)點[13-14]。測序結(jié)果顯示，樣本間檢測出的序列數(shù)相差較大，由7 431～19 600條不等，平均每例樣本序列數(shù)量約12263條，這可能與樣本間細(xì)菌的種類及墊料中營養(yǎng)成分的差異有關(guān)。規(guī)避了發(fā)酵床微生物區(qū)系中由于細(xì)菌的種類、墊料中營養(yǎng)成分以及其它不確定因素而導(dǎo)致同一菌群中分布的差異。

表5　各菌種在菌群中的比例(菌種水平大于0.5%)

注：同行數(shù)據(jù)后所標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note: Different superscripts in the same row mean significant difference between treatments(P<0.05), same superscripts mean insignificant difference between treatments(P>0.05).The same below.

發(fā)酵床中菌群結(jié)構(gòu)及墊料的成分等因素與發(fā)酵床養(yǎng)豬效果密切相關(guān)。研究通過 454 測序方法分析菌群結(jié)構(gòu)，從微生物豐富度、相似性、多樣性等的評估分析，最終有效選擇出優(yōu)勢菌群。測序結(jié)果顯示，在微生物豐富度中，土著菌接種的樣品3、4的豐富度指數(shù)(chao分別為10 175、10 754)高于商業(yè)菌接種的樣品1、2豐富度指數(shù)(chao分別為6 720、7 554)，說明土著菌的菌種豐富度比商業(yè)菌高，土著菌為當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境微生物，菌群復(fù)雜，包括固定碳素的光合細(xì)菌、抑制病害的放線菌、分解糖類的酵母菌等多種微生物組菌群，以及更好在厭氧狀態(tài)下能夠有效分解有機物[15]。研究發(fā)現(xiàn)，墊料組成對菌群結(jié)構(gòu)多樣性也有較大影響，稻殼與鋸末比例2∶1樣本的微生物多樣性(shannon指數(shù)6.64～6.91)高于稻殼與鋸末比例1∶1樣本(shannon指數(shù)5.90～5.94)。鋸末中碳/氮值為491，稻殼碳/氮值為75，故鋸末比例高的樣本1、3的碳/氮比值較樣本2、4高。鋸末含有豐富的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等，木質(zhì)素可保護纖維素不被降解，且與NH3形成穩(wěn)定的化合物，使得鋸末發(fā)酵較慢[16]，因此鋸末比例高的墊料微生物發(fā)酵速度較鋸末比例低的緩慢。另外，微生物在分解豬糞尿中氮時，需不斷消耗墊料中碳素，分解剩余碳素作為有機酸的合成原料，因而碳素比值高的樣本1、3易生成酸性環(huán)境，可能會抑制某些微生物的生長。而稻殼比例大的樣本2、4的通透性好于樣本1、3，易形成好氧環(huán)境，同時吸收NH3使其構(gòu)成堿性環(huán)境。有研究報道微生物對碳素物質(zhì)的利用具有選擇性，碳/氮源的種類對微生物發(fā)酵產(chǎn)生木聚糖酶的產(chǎn)量和類型具有重要的影響[17-18]。木聚糖是植物半纖維素的主要成分之一[19]。而稻殼作為碳源時產(chǎn)生木聚糖酶水平極高，利于細(xì)菌生長[20]。

商業(yè)菌的兩個處理樣本相似性最高，土著菌的2個處理樣本相似性次之，土著菌處理的稻殼與鋸末比例2∶1樣本與商業(yè)菌的2個處理樣本相比較相似性最低。由此看出，墊料與菌種對微生物相似性均有影響，其中商業(yè)菌種處理樣本的菌群結(jié)構(gòu)受墊料因素的影響小，而土著菌處理樣本的菌群結(jié)構(gòu)受墊料因素的影響較大。可能是商業(yè)菌經(jīng)過純化，菌種結(jié)構(gòu)較為單一，發(fā)酵效果相對土著菌更穩(wěn)定，而土著菌菌種較雜，發(fā)酵效果較易受外界營養(yǎng)基質(zhì)的影響[21]。

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵床墊料優(yōu)勢菌門為擬桿菌門(27.66%～60.93%)、厚壁菌門(13.41%～34.21%)、變形菌門(10.28%～14.71%)、放線菌門(4.63%～26.24%)。其中樣本4的變形菌門(Proteobacteria)含量最高，為14.71%。變形菌門(Proteobacteria)包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等，推測樣本4飼養(yǎng)生豬的效果可能較差。

研究發(fā)現(xiàn)商業(yè)菌發(fā)酵床墊料優(yōu)勢菌為Galbibacter、Luteibacter，土著菌優(yōu)勢菌為Galbibacter、Weeksella、Flavobacterium、Ruminococcaceae-uncultured；墊料中稻殼與鋸末比例1∶1墊料優(yōu)勢菌為Galbibacter、Saprospiraceae-uncultured，而稻殼與鋸末比例2∶1墊料優(yōu)勢菌為Galbibacter(占菌群比例 ≥ 大于2% 定義為該環(huán)境的優(yōu)勢菌)。不同樣本的優(yōu)勢菌存在著差異，推測與發(fā)酵原料中碳/氮源有著密切的關(guān)系[22]。

4結(jié)論

(1)土著菌樣本菌群豐富度高于商業(yè)菌，高稻殼比例樣本豐富度、多樣性高于低稻殼比例樣本。

(2)商業(yè)菌發(fā)酵后樣本菌群結(jié)構(gòu)較土著菌的穩(wěn)定，受墊料營養(yǎng)基質(zhì)影響較土著菌樣本小。

(3)發(fā)酵床墊料細(xì)菌群落主要由4個門組成：擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門，在屬水平上Galbibacter為發(fā)酵床墊料微生物的優(yōu)勢菌屬。

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Study on the Bacterial Communities in Fermentation Bedding by Using

16Sr-DNA High-throughput Sequencing Technology

GUANG Ye-kun1, YANG Yan1, WANG Rong-min1*, LOU You-wu1, WU Zhi-yong1, TU Ling-yun2

( 1.AnimalHusbandryTechniquePromotionStationofJiangxiProvince，Nanchang330077,China；

2.NanchangCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention，Nanchang, 330008,China)

Abstract:The experiment was conducted to find the bacterial communities in fermentation bedding, and explore the different effects of strains and bedding material on bacterial communities. The bedding includes rice hull and sawdust with a ratio of 1∶1, 2∶1 by inoculation commercial bacteria, indigenous bacteria in packing respectively, a total of four treatment groups. After 154 days' feeding experiment, fermentation mattress material was collected to analyze the bacterial communities in fermentation bedding by using 16S rDNA high-throughput sequencing technology. The results showed that 1) The richness index, the treatment of indigenous strain group (chao: 10175～10754) exceeded the commercial strain group (chao: 6720～7554); 2) The similarity index, the bacterial community structural of the commercial strains groups were less affected by bedding factors, but that of the indigenous strains were greatly influenced by the bedding factor; 3) As for diversity, the bedding greatly influenced bacteria diversity than strain diversity. Compared the bedding microbial diversity, the treatment of rice hull and sawdust ratio of 2∶1 (shannon index: 6.64～6.91) was higher than that of rice husk and sawdust ratio of 1∶1 (shannon index: 5.90～5.94); 4) Micro-flora composition of the fermentation bedding was mainly composed of four phylum: Bacteroidetes (27.66%～60.93%), Firmicutes(13.41%～34.21%), Proteobacteria(10.28%～14.71%) and actinobacteria (4.63%～26.24%). On the level of genus, Galbibacter was determined the dominant genus on fermentation bedding bacterial communities. These results indicated that the richness, similarity and diversity of fermentation bedding bacterial were influenced by the factor of strains and bedding material ratio in varying degrees.

Key words:16Sr-DNA high-throughput sequencing；fermentation bed；bacterial communities；strain；bedding

[文章編號]1005-5228(2015)12-0072-08

[中圖分類號]S811.5

[文獻標(biāo)識碼]A

*[通訊作者]王榮民(1963-)，江西南昌人，高級畜牧獸醫(yī)師，研究方向：畜牧養(yǎng)殖。E-mail：jxmuyeke@126.com

[作者簡介]管業(yè)坤(1964-)，男，湖北省黃梅縣人，高級畜牧獸醫(yī)師，本科，主要從事畜禽健康養(yǎng)殖研究。E-mail：guanyekun@126.com；△并列第一作者

[基金項目]江西省科技支撐項目(2010BNB00302)，江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)專項(jXars-03)

*[收稿日期]2015-05-22修回日期：2015-07-01