陳知己 蔡婷 宋銳 顧翔 周小清 袁偉

?

·基礎研究·

腫瘤抑制因子p96蛋白在小鼠內(nèi)耳毛細胞的表達△

陳知己 蔡婷 宋銳 顧翔 周小清 袁偉

目的 研究腫瘤抑制因子p96蛋白在昆明小鼠內(nèi)耳毛細胞的定位表達特點。方法 采用間接免疫熒光法標記耳蝸基底膜并鋪片，激光共聚焦顯微鏡分層掃描觀察p96蛋白的表達定位。結果 內(nèi)、外毛細胞中均可觀察到p96蛋白熒光標記，且該蛋白在毛細胞胞質中的表達并不均勻。在內(nèi)毛細胞胞質中，細胞頂部表皮板及附近胞質區(qū)有類圓形的P96蛋白高表達區(qū)。結論 腫瘤抑制因子p96蛋白表達于內(nèi)、外毛細胞，在內(nèi)毛細胞頂區(qū)有著顯著的局部高表達特征。結合該蛋白的生理功能，推測內(nèi)毛細胞頂區(qū)可能是囊泡內(nèi)吞、物質交換的一個重要亞細胞部位。(中國眼耳鼻喉科雜志，2015，15：315-317)

抑癌基因；毛細胞；聽力；p96蛋白；表達

抑癌基因的研究已有眾多體系，這類基因的表達強弱直接控制細胞的增殖過程?；蚪Y構突變或者異常表達甚至可導致腫瘤發(fā)生。在正常細胞中，它們轉錄表達各種因子，調控細胞的生長分化、物質交換和信號轉導等生命活動[1]。內(nèi)毛細胞的信號轉導異常直接影響帶狀突觸的功能，改變穩(wěn)定高效的聽信號“機械-電”傳導活動。然而受到內(nèi)毛細胞本身特點的限制，關乎其信號轉導與功能學關系的研究甚少。p96蛋白為具有信號轉導功能的磷蛋白之一，其基因Dab2/DOC-2(disable2/deletion in ovarian carcinoma-2)為腫瘤抑制基因。p96蛋白為該基因家族成員之一，據(jù)報道其和卵巢癌的發(fā)生有重要聯(lián)系；近來的分子拓展研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白還參與細胞內(nèi)多條信號通路、囊泡內(nèi)吞、蛋白及受體轉運等過程，進而調控細胞分化發(fā)育及功能代謝[2]。本課題組擬從生理狀態(tài)下成年小鼠p96表達定位及分布規(guī)律展開初步研究，為日后病理模型下蛋白分布研究及信號通路與內(nèi)毛細胞功能相關性的探究作一個鋪墊。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用9周齡SPF(無特定病原體級)昆明小鼠，購買于第三軍醫(yī)大學動物中心，雌雄不限，耳廓反射靈敏，排除中耳及內(nèi)耳疾病。

1.2 實驗試劑 p96抗體(抗Dab2蛋白661-770氨基酸區(qū)段制成，H-110，兔抗鼠，Santa Cruz公司)，毛細胞特異性分子肌球蛋白6(Myosin 6)抗體(K-20，羊抗鼠，Santa Cruz公司),一抗1∶50磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)稀釋，Green-conjugated IgG(驢抗羊，Abbkine公司)1∶250稀釋，Red-conjugated IgG(驢抗兔，Abbkine公司)1∶500稀釋，Dapi染料(4′6-二脒基-2-苯基吲哚，Sigma公司)1∶200稀釋，0.3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)溶液，0.01 mmol/L PBS，0.3% Triton溶液，4%多聚甲醛溶液，抗熒光淬滅封片液(重慶博培公司)，指甲油。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備耳蝸基底膜 用頸椎脫臼法處死小鼠，剪刀斷頭后，從枕骨大孔處開始沿正中線剪開顱骨。去除腦組織后，暴露耳蝸及顳骨聽泡，用剪刀分離耳蝸，去除周圍的肌肉與筋膜，置于培養(yǎng)皿中。用鑷子輕輕在蝸頂處挑出一小孔，并同時開放圓窗及卵圓窗，用1 mL注射器分別經(jīng)圓窗、卵圓窗及蝸頂小孔灌注4%多聚甲醛溶液，反復3次后，將耳蝸置于盛有4%多聚甲醛溶液的EP管中，4 ℃固定過夜。然后取出耳蝸置于0.01 mmol/L PBS中，從底回開始用顯微鑷逐步剝除蝸殼骨質，暴露并分離耳蝸基底膜中間回，清除前庭膜、蓋膜及血管紋。

1.3.2 間接法免疫熒光標記基底膜 PBS漂洗2遍→0.3% Triton×100通透15 min→PBS漂洗3遍→0.3%BSA室溫封閉2 h→吸干后分別加入一抗，4 ℃過夜→PBS漂洗3次→分別加入相應的熒光二抗，37 ℃孵育40 min→PBS漂洗3次→抗熒光淬滅劑封片→壓片→蓋玻片周圍涂以指甲油→4 ℃冰箱濕潤片盒中保存(PBS漂洗每遍5 min)。

1.3.3 激光共聚焦顯微鏡分層掃描 在激光共聚焦顯微鏡(40倍油浸物鏡，AxioObserver LSM780，ZEISS)下觀察及拍照。激發(fā)光波長：二抗驢抗羊488 nm，驢抗兔591 nm。Dapi定位內(nèi)毛細胞核之后，分層掃描、連續(xù)觀察各層圖像。掃描層厚為2 μm。

2 結果

在耳蝸基底膜上，3排外毛細胞排列在靠血管紋一側，而1排內(nèi)毛細胞排列在靠蝸軸一側。為了顯示出耳蝸毛細胞形態(tài)及大小，從而確定p96蛋白在基底膜上的大致表達部位，另外對Myosin6做了免疫熒光染色。染色發(fā)現(xiàn)，Myosin6僅表達于內(nèi)、外毛細胞區(qū)域，內(nèi)、外毛細胞胞質及外毛細胞纖毛等部位都被免疫熒光著色(綠色)。與此同時，通過對比發(fā)現(xiàn)，p96蛋白也表達于內(nèi)、外毛細胞區(qū)域，并且毛細胞胞質中，p96蛋白表達并不均勻，尤其在內(nèi)毛細胞頂部(apical area)存在著強表達區(qū)域(圖1中粗箭頭所示圓形區(qū)域)。對比圖2中Myosin6的表達圖像，認為這一高表達區(qū)域可能是表皮板及靠近其的細胞頂區(qū)胞質。

圖1. p96蛋白在內(nèi)毛細胞的表達(紅色示該蛋白免疫熒光，粗箭頭示圓形強表達區(qū)) 圖2. 毛細胞特異性分子Myosin6的表達(綠色示該蛋白免疫熒光) 藍色為Dapi標記細胞核，OHC為外毛細胞，IHC為內(nèi)毛細胞，標尺20 μm

3 討論

Dab2基因為果蠅屬Disabled之一，因其在卵巢癌細胞株中發(fā)生表達缺失，1994年被Mok等命名為卵巢缺失基因(DOC-2)[3]。人Dab2/DOC-2基因定位于染色體5p13.1，編碼p96、p67蛋白亞型。鼠的Dab2基因表達于15號染色體上，編碼p96、p93和p67剪接體亞型[4]。本文一抗由來源于抗Dab2蛋白661-770氨基酸區(qū)段的抗體制成，氨基酸序列分析表明其來源于p96蛋白部分區(qū)段。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，人與鼠之間該亞型具有81%的同源性，故研究鼠p96蛋白功能對研究該蛋白在人體疾病中的分子機制有著一定的現(xiàn)實意義。

Dab基因家族表達為2類，分別是Dab1和Dab2。哺乳動物中Dab1主要表達于神經(jīng)系統(tǒng)中，對神經(jīng)元的定位、分化、遷移有著重要的作用。Dab2為一種新型的抑癌基因，正常表達于脾、卵巢上皮細胞、前列腺、胸腺、乳腺、小腸絨毛等組織細胞中[6]。有關Dab2基因生理功能的研究發(fā)現(xiàn)，其涉及調控胞內(nèi)Ras/MAPK、轉化生長因子-β(TGF-β)、Wnt通路的信號級聯(lián)轉導、蛋白受體向胞內(nèi)的轉運以及細胞內(nèi)吞等過程[2]。p96蛋白為Dab2基因表達的亞型之一，在耳蝸中的功能表達并不清楚，但通過生理作用分析，發(fā)現(xiàn)其很有可能與內(nèi)毛細胞的功能有關。我們通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)該蛋白在內(nèi)耳毛細胞中存在極性表達特征，并且與內(nèi)吞較活躍的腎小管上皮細胞及腸上皮細胞中該蛋白的表達特征相似。這也說明內(nèi)耳毛細胞可能存在與內(nèi)環(huán)境進行高效物質交換的分子機制。

表達定位研究是本課題組后期針對毛細胞功能調控研究的一個基礎。內(nèi)毛細胞擔負著聽信號“機械-電”傳導活動，功能十分活躍，故內(nèi)毛細胞囊泡內(nèi)吞、蛋白轉運、受體調節(jié)機制至關重要。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，該蛋白通過募集Myosin6，調控著網(wǎng)格蛋白介導內(nèi)吞(clathrin mediated endocytosis,CME)過程。內(nèi)毛細胞囊泡存在CME過程。通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)毛細胞頂部表皮板及附近胞質區(qū)有著類圓形的p96蛋白高表達區(qū)，這與內(nèi)毛細胞CME內(nèi)吞部位密切相關。對于內(nèi)毛細胞功能來講，CME不僅關乎囊泡回收、膜穩(wěn)定，同時也是胞外物質入胞、質膜受體內(nèi)化的重要機制之一。對內(nèi)毛細胞CME過程進行實驗干預，探討其對內(nèi)毛細胞形態(tài)功能的影響也是本課題組后續(xù)研究方向。

除了作為調控信號通路的磷蛋白，p96蛋白本質上也是一種銜接蛋白，它與質膜低密度脂蛋白受體(LDLR)銜接可以介導蛋白和類脂吸收入細胞。兆蛋白(megalin)就是p96蛋白所銜接的其中一種質膜受體。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，megalin基因的多態(tài)性與個體對順鉑耳毒性的敏感性有關[9]。因此，明確p96蛋白這一銜接蛋白在耳蝸毛細胞表達定位具有意義，說明內(nèi)毛細胞頂部可能是物質交換甚至各種藥物入胞的重要部位。

此外，近年來Wnt信號通路在內(nèi)耳發(fā)育功能調控方面的研究成為一項熱點，其決定了聽基板、聽囊、內(nèi)耳上皮細胞等內(nèi)耳重要結構的發(fā)育和形成。該通路異常將導致內(nèi)耳結構發(fā)育異常，影響功能成熟[10-11]。p96蛋白處于Wnt通路的關鍵位置，可以通過多個環(huán)節(jié)對該通路的效應產(chǎn)生抑制[2]。本實驗通過與毛細胞標記分子myosin6熒光圖像對比分析，初步證實p96蛋白表達于耳蝸毛細胞，且在內(nèi)毛細胞頂區(qū)存在局部高表達區(qū)域，但這一結論僅僅處于表達層面，尚不能證實p96蛋白在內(nèi)毛細胞中發(fā)揮功能，更不能簡單地將其他細胞中該蛋白的功能研究套用至毛細胞研究中。在后續(xù)研究中，我們將優(yōu)化實驗條件，完成蛋白雙標圖片及耳蝸免疫共沉淀實驗，從而明確蛋白在毛細胞的相互作用關系，深入探討年齡相關性蛋白表達變化及通過功能調控實驗分析該蛋白在毛細胞的功能。我們推測囊泡內(nèi)吞、物質交換、發(fā)育再生等3個方面可能成為未來研究內(nèi)毛細胞中該蛋白功能的新方向。

p96蛋白表達于多種細胞，內(nèi)毛細胞中該蛋白極性表達特征與小腸微絨毛區(qū)及腎小管上皮細胞中的表達特征相似，這也印證了毛細胞功能十分活躍。結合其在細胞分化、信號轉導、物質運輸、囊泡內(nèi)吞中的重要作用，圍繞內(nèi)毛細胞p96蛋白功能的研究存在眾多不同的方向。研究者可能從中發(fā)現(xiàn)毛細胞再生、分化、功能維持及物質交換新的機制，這些機制或許會為感音神經(jīng)性聾的治療提供新的參考。

[ 1 ] Lobry C,Oh P,Mansour MR,et al.Notch signaling:switching an oncogene to a tumor suppressor[J].Blood,2014,123(16):2451-2459.

[ 2 ] 曾浪，孫雪.Dab2/DOC-2基因的研究進展[J].當代醫(yī)學，2011,17(24):19-21.

[ 3 ] Mok SC,Wong KK,Chan RK,et al.Molecular cloning of differentially expressed genes in human epithelial ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,1994, 52(2):247-252.

[ 4 ] 邵淑麗，蔡昱.Disabled-2基因與腫瘤的相關研究[J].中國癌癥雜志，2005,15(3):302-305.

[ 5 ] Mok SC,Chan WY,Wong KK,et al.DOC-2, a candidate tumor suppressor gene in human epithelial ovarian cancer[J].Oncogene,1998,16(18):2381-2387.

[ 6 ] Martin JC,Herbert BS,Hocevar BA,et al.Disabled-2 downregulation promotes epithelial-to-mesenchymal transition[J].Br J Cancer,2010,103(11):1716-1723.

[ 7 ] Tumbarello DA,Kendrick-Jones J,Buss F.Myosin VI and its cargoadaptors-linking endocytosis and autophagy[J].J Cell Sci,2013,126(Pt 12):2561-2570.

[ 8 ] Riedemann L,Lanvers C,Deuster D,et al.Megalin genetic polymorphisms and individual sensitivity to the ototoxic effect of cisplatin[J]. Pharmacogenomics J,2008,8(1):23-28.

[ 9 ] Schacht J,Talaska AE,Rybak LP.Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: hearing loss and its prevention[J].Anat Rec(Hoboken),2012,295(11):1837-1850.

[10] Munnamalai V,Fekete DM.Wnt signaling during cochlear development[J].Semin Cell Dev Biol,2013,24(5):480-489.

[11] 陳志婷，張小兵.Wnt信號通路與內(nèi)耳發(fā)育調控[J].聽力學與言語疾病雜志,2012,20(1):56-59.

(本文編輯 楊美琴)

Expression of p96 in the inner ear hair cells in mice

CHENZhi-ji,CAITing,SONGRui,GUXiang,ZHOUXiao-qing,YUANWei.
DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,SouthwestHospitaloftheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China

YUAN Wei, Email: weiyuan175@sina.com

Objective To investigate the expression of tumour suppressor, p96, in the cochlear hair cells in Kunming mice. Methods The basilar membrane of mice cochlea was immuno-double labeled with antibody and Dapi. The distribution of p96 was detected by immunofluorescence staining and laser scanning confocal microscope. Results P96 was expressed in the inner and outer hair cells of cochlea and was especially strong in the inner hair cells at the apical area. This area ought to be the cuticular plate and the nearby cytoplasma. Conclusions The expression of tumor suppressor, p96, displayed a prominent polarised characteristics which may be similar to the expression of polarised epithelial cells. The cuticular plate and the nearby cytoplasma of inner hair cells maybe a key subcellular site related to the differentiation and metabolism of cells.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:315-317)

Genes, tumor suppressor; Hair cells; Auditory; p96; Expression

國家自然科學基金(81470694;81271080;30973301)；重慶市自然基金(CSTC2009BB5170);第三軍醫(yī)大學基金(2010XLC06)

第三軍醫(yī)大學附屬西南醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 重慶 400038

袁偉(Email：weiyuan175@sina.com )

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.05.004

2015-01-22)