豬干擾素基因的克隆與原核表達(dá)載體的構(gòu)建

牛偉濤

（邢臺(tái)學(xué)院化學(xué)工程與生物技術(shù)學(xué)院，河北邢臺(tái) 054001）

豬干擾素基因的克隆與原核表達(dá)載體的構(gòu)建

牛偉濤

（邢臺(tái)學(xué)院化學(xué)工程與生物技術(shù)學(xué)院，河北邢臺(tái) 054001）

干擾素(Interferon)是一種廣譜抗病毒劑，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種作用而被廣泛應(yīng)用于病毒性疾病的預(yù)防和治療。本實(shí)驗(yàn)以豬肝臟組織為材料，提取豬肝臟組織DNA，根據(jù)GenBank收錄的豬干擾素基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以豬肝臟DNA為模板進(jìn)行高保真擴(kuò)增得到IFN基因的ORF片段，然后進(jìn)行了T載體克隆。再利用引入EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物對(duì)IFN成熟肽段的基因進(jìn)行亞克隆，經(jīng)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化后，成功構(gòu)建了pET28a-ifn原核表達(dá)重組質(zhì)粒，為干擾素基因的原核表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

豬干擾素基因；基因克隆；表達(dá)載體構(gòu)建

干擾素是一種細(xì)胞因子，具備免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤等作用，它是科學(xué)家在1957年研究流感病毒干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)的[1]。干擾素是一類分泌型糖蛋白，它主要通過(guò)與細(xì)胞表面受體相互作用從而使細(xì)胞、組織或器官產(chǎn)生一種或幾種抗病毒的蛋白，這樣便可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答[2]。干擾素主要由激活的胸腺細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生，病毒入侵時(shí)，干擾素在短時(shí)間內(nèi)就能讓機(jī)體處于抗病毒形態(tài)，并使機(jī)體在1～3周時(shí)間內(nèi)抵制病毒反復(fù)感染[3]。生物體中廣泛存在干擾素，人、豬、羊等哺乳動(dòng)物都產(chǎn)生干擾素。我國(guó)豬場(chǎng)眾多，大小豬病毒性傳染病隨季節(jié)變化危害較大，種類繁多，給很多養(yǎng)殖戶造成巨大損失，干擾素就成為醫(yī)藥、獸藥市場(chǎng)最具發(fā)展前景的一類生物制劑[4]。如果利用基因工程的方法將豬干擾素基因進(jìn)行原核表達(dá)，可以為豬干擾素的應(yīng)用研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)器材、試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

TC-96/G/HLife Express基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司），BD-1000超微量核酸蛋白分析儀（北京五州東方科技發(fā)展有限公司），ZX-2020D凝膠成像分析系統(tǒng)等。

1.2 藥品試劑

2×pfu高保真Taq Mix（上海捷瑞生物工程公司）；T4 DNA連接酶、DNA Marker（TaKaRa大連公司）；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程公司）；卡納青霉素、氨芐青霉素（索萊寶生物科技有限公司）等藥品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 基因組DNA的提取

取20 mg豬肝臟組織，用冰冷生理鹽水洗3次，置于液氮中充分研磨，然后參考DNA提取試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行操作，然后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 干擾素基因的PCR擴(kuò)增

2.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank中的豬干擾素基因序列，利用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)所需特異性引物。豬干擾素基因ORF序列擴(kuò)增上游引物為5’ATGGCCCCAACCTCAGCCTTC3’；下游引物為5’TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTC3’。豬干擾素基因成熟肽序列擴(kuò)增上游引物為5’CGGAATTCTGCGACCTGCCTCAGAC3’，含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物為5’GCGTCGACTCACTCCTTCTTCCTGAGTC3’，含SalⅠ酶切位點(diǎn)。

2.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為：2×PfuTaq Mix，25μl；上下游引物各2μl，模板為1μl，加dd H2O補(bǔ)齊至50μl；

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5min；94℃ 30sec，52℃30sec，72℃45sec，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

2.3 PCR產(chǎn)物的純化

PCR產(chǎn)物參照PCR產(chǎn)物回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行回收，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.4 連接與轉(zhuǎn)化

連接反應(yīng)體系：DNA片段3μl；載體1μl；T4 DNA連接酶0.5μl；10×Buffer 0.5μl；dd H2O，1 μl。16℃連接過(guò)夜。用CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2.5 酶切鑒定

反應(yīng)體系：重組質(zhì)粒12μl；重組質(zhì)粒12μl；EcoRⅠ1μl；SalⅠ1μl；10×Buffer 2μl；dd H2O2μl。37℃，30min。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 干擾素基因的PCR擴(kuò)增

利用設(shè)計(jì)的特異性引物，以豬肝臟基因組DNA為模板，對(duì)豬干擾素基因的ORF進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并，如圖1所示，在約570bp的位置出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增帶。

圖1 干擾素基因ORF的PCR擴(kuò)增M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：PCR產(chǎn)物

3.2 測(cè)序結(jié)果

將陽(yáng)性T載克隆進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示，成功克隆得到長(zhǎng)為570bp的豬干擾素基因的ORF片段，序列如下：

ATGGCCCCATCCTCAACTCTCCTCACGGTCCT GGTGCTGCTCAGCTGCAATGCCATCTGCTGTCTGG GCTGCAACCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGCTCAT ACCAGGGCCCTGAGGCTCCTGGCACAAATGAGGA GAATCTCCCCCTTCTCCTGCCTGGACCACAGAAGG GACTTTGGATTCCCCCAAGAGGCCTTGGGGGGCA ACCAGGTCCAGAAGGCTCAAGCCATGGCTCTGGT GCATGAGATGCTCCAGCAGACCTTCCAGCTCTTCA GCACAGAGGGCTCGGCTGCTGCCTGGGATGAGAG CCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGC AGCTCAGGGACCTGGAAGCCTGTGTCATGCAGGA GGCGGGGCTGGAAGGGACCCCCCTGCTGGAGGAG GACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAG ACTCACCCTCTATCTGCAAGAGAAGAGCTACAGC CCCTGTGCCTGGGAGATCGTCAGGGCAGAAGTCA TGAGAGTCTTCTCTTCCTCCACAAACCTGCAAGAC AGACTCAGGAAGAAGGAGTGA

3.3 干擾素成熟肽段基因序列的PCR擴(kuò)增

利用特異性引物成功擴(kuò)增到了干擾素成熟肽段基因序列片段，如圖2所示。

圖2 干擾素成熟肽段基因序列的PCR擴(kuò)增M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：PCR產(chǎn)物

3.4 重組質(zhì)粒的鑒定

利用 EcoRⅠ與 SalⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)pET28a-inf重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切實(shí)驗(yàn)，如圖3電泳檢測(cè)結(jié)果顯示pET28a-inf重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 pET28a-inf重組質(zhì)粒的鑒定M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET28a-inf質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物

4 討論

實(shí)驗(yàn)成功克隆得到豬干擾素基因ORF片段，序列長(zhǎng)度為570bp。豬干擾素基因ORF中含有信號(hào)肽序列，實(shí)驗(yàn)中利用特異性引物擴(kuò)增得到成熟肽的編碼序列，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為490bp。限制性雙酶切鑒定表明豬干擾素基因已成功插入pET28a載體，成功構(gòu)建了pET28a-inf表達(dá)載體，這為下一步豬干擾素基因能在原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高效表達(dá)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1]Isaacs A, Lindenmann J. Virus interference I. The interferon [J].Proc R SocLond B BiolSci,1957,147(927):258-267.

[2]MinagawaT,Ishiwata K, Kajimoto T. Feline interferonomega treatment on canine parvovirus infection[J]. Vet Microbiol, 1999,69(122):51-53.

[3]劉運(yùn)龍,程遠(yuǎn)國(guó),劉學(xué)龍.干擾素研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2008,29(2):85-89.

[4]梁斌.國(guó)內(nèi)動(dòng)物干擾素的研究進(jìn)展[J].甘肅畜牧獸醫(yī),2005 , 35(2):39-42.

圖4 CPU SFR Memory

圖5 Internel Memory

[1]賀敬凱.單片機(jī)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、仿真與應(yīng)用——基于Keil和Proteus仿真平臺(tái) [M].西安:西安電子科技大學(xué)出版社, 2011.2

[2]李全利.單片機(jī)原理及接口技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2013.12

[3]余成波.傳感器與自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2009.7

[4]丁向榮.C語(yǔ)言程序設(shè)計(jì)與Keil C [M].廣東:廣東高等教育出版社,2013.9

[5]徐愛鈞.Keil C51單片機(jī)高級(jí)語(yǔ)言應(yīng)用編程與實(shí)踐[M].北京:電子工業(yè)出版社,2013.12

[6]耿肇英.C#應(yīng)用程序設(shè)計(jì)教程[M].北京:人民郵電出版社, 2010.11

[7]張毅剛.單片機(jī)原理及應(yīng)用——C51編程+Proteus仿真[M].北京:高等教育出版社,2012.11

[8]周潤(rùn)景，蔡雨恬.PROTEUS 入門使用教程[M].北京:機(jī)械工業(yè)出版社,2011.10

[9]杜樹青.基于Proteus和Keil C51的單片機(jī)設(shè)計(jì)與仿真[M].北京:電子工業(yè)出版社,2012.2

[10]朱清慧.Proteus教程——電子線路設(shè)計(jì)、制板與仿真[M].北京:清華大學(xué)出版社,2011.6

Q78

A

1672-4658(2015)04-0175-03

2015-6-29

邢臺(tái)市科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目（2014ZC019）；邢臺(tái)學(xué)院科學(xué)研究項(xiàng)目（2014）

牛偉濤(1982-)，男，講師，博士在讀，主要從事分子生物學(xué)與基因工程研究.