王秀玲，李 敏，王僧虎，成麗萍

（邢臺(tái)學(xué)院化學(xué)工程與生物技術(shù)學(xué)院，河北邢臺(tái) 054001）

超聲輔助咪唑離子液提取酸棗仁中黃酮的探索

王秀玲，李 敏，王僧虎，成麗萍

（邢臺(tái)學(xué)院化學(xué)工程與生物技術(shù)學(xué)院，河北邢臺(tái) 054001）

以咪唑類離子液體的乙醇溶液為提取劑，利用超聲波輔助提取脫脂酸棗仁中的黃酮，并且用高效液相色譜儀測(cè)定。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，探討提取劑種類、提取劑濃度、超聲時(shí)間、固液比對(duì)提取率的影響。結(jié)果表明，最佳實(shí)驗(yàn)條件:提取劑為[Hmim]Br、提取劑體積濃度為[Hmim]Br與乙醇的體積比為1∶6、超聲時(shí)間30min、固液比為1∶50。在最優(yōu)條件下測(cè)定不同地區(qū)酸棗仁中的黃酮。該提取方法操作簡(jiǎn)單快速，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠且綠色環(huán)保。

酸棗仁；離子液體；超聲提取；黃酮

酸棗仁（Semen Zizyphi Spinosar，SZS）是鼠李料 （Phamnaceae） 植物棗酸 [zizyphus jujuba Mill.var spinosa(Bunge)HuexH.F.chou]的干燥成熟種子[1]。北方干旱的丘陵和山區(qū)等地種植的較多，是一種常用的安神藥。適用于經(jīng)常失眠、身體虛弱、驚悸多夢(mèng)、津少口渴的人群。研究表明，酸棗仁中含有多種物質(zhì)，比如脂肪油、皂苷、黃酮、蛋白質(zhì)等[2]，其中最主要的有效成分之一為黃酮類物質(zhì)[3]。提取黃酮的方法有超聲波輔助提取法、微波輔助法、溶劑提取法等。超聲提取以其溫度低、提取率高、提取時(shí)間短的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)被用來提取中藥材和各種動(dòng)、植物中的有效含量[4]，是替代傳統(tǒng)的工藝方法來實(shí)現(xiàn)節(jié)能高效、簡(jiǎn)便環(huán)保式提取的現(xiàn)代高新技術(shù)手段。常用提取劑為有機(jī)溶劑，會(huì)造成環(huán)境污染；雖然超聲波和微波輔助提取法優(yōu)于溶劑提取的速度，但提取率仍然不高。離子液體作為一種新型的綠色溶劑倍受研究者的關(guān)注。離子液體具有以下特性及應(yīng)用： (1)無味、不可燃、不揮發(fā)，對(duì)環(huán)境的污染小； (2)導(dǎo)電性強(qiáng)，可作為電解液應(yīng)用于電化學(xué)領(lǐng)域； (3)溶解能力強(qiáng)，可以用作提取劑或有機(jī)反應(yīng)的溶劑； (4)熱化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，納米材料領(lǐng)域也可被應(yīng)用[5]。本文研究了以咪唑類離子液體1-己基-3-甲基咪唑溴化鹽（[Hmim]Br）乙醇溶液為提取劑，結(jié)合超聲波輔助提取的新型提取體系，采用高效液相色譜法測(cè)定脫脂酸棗仁中的黃酮。該樣品的前處理方法操作簡(jiǎn)便快速，提取率高，而且對(duì)環(huán)境無污染。本研究也為酸棗仁的加工處理及綜合開發(fā)利用奠定了可靠穩(wěn)固的基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：脫脂裝置；FA2004電子天平（上海天平儀器技術(shù)有限公司）；TD-4臺(tái)式離心機(jī)（湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠）；KQ-50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；日本島津LC-20AT高效液相色譜儀（HPLC）。

實(shí)驗(yàn)試劑：1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽（[Bmim] Br），1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[Bmim] BF4），1-己基-3-甲基咪唑溴鹽（[Hmim]Br），1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[Hmim]BF4），以上試劑為實(shí)驗(yàn)室合成，經(jīng)檢測(cè)含量在98%以上；無水乙醇，磷酸（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；槲皮素（純度均≥98%）；甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；酸棗仁（市售）。

1.2 檢測(cè)條件

HPLC色譜條件為[6]：采用WondaSilTM－C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相A和流動(dòng)相B梯度洗脫，A為0.1%磷酸溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0~5.5min，45%~64%B；5.5~14min，64%B；14~18min，64%~45%B。流速：1.0mL· min-1；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：257nm；柱溫：34℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品0.100g，用少量離子液體溶解，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中稀釋定容，搖勻，得到濃度為1mg·mL-1槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液。再稀釋成 0.0025mg·mL-1、0.05mg·mL-1、0.01mg·mL-1、0.02mg·mL-1、0.03mg·mL-1槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用HPLC法測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，槲皮素濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示槲皮素在2.500~30.00μg·mL-1的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y=6×107x+ 29001，R2=0.9952，式中x為質(zhì)量濃度（mg·mL-1），y為峰面積。

1.3 供試品溶液的制備

將酸棗仁用小鋼磨打碎，取10g放250mL蒸餾燒瓶中，同時(shí)向蒸餾燒瓶中加入120mL石油醚，連接儀器，利用索氏提取器脫脂酸棗仁約4小時(shí)。

將脫脂的酸棗仁置于干燥箱中60℃條件下干燥，粉碎，過60目篩（0.25mm），干燥條件下保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取脫脂酸棗仁粉末0.1g，加3mL 1.0mol/L的 [Bmim]Br乙醇溶液，超聲提取45min，離心5min，取上層清液經(jīng)0.45μm有機(jī)膜過濾，進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子液體的合成

采用兩步法合成離子液體，先用1-甲基咪唑與鹵代烷反應(yīng)合成中間體溴鹽（溴化1-烷基-3-甲基咪唑，烷基=正丁基、正己基，分別簡(jiǎn)記為[Bmim]Br、 [Hmim]Br），第二步再將溴離子置換為目標(biāo)產(chǎn)物的陰離子，合成系列離子液1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（烷基=正丁基、正己基，分別簡(jiǎn)記為 [Bmim]BF4、 [Hmim]BF4）。

2.2 提取劑種類的選擇

提取劑的種類對(duì)提取率有很大的影響。本實(shí)驗(yàn)分別采用 [Bmim]Br、 [Bmim]BF4、 [Hmim] Br、 [Hmim]BF4的乙醇溶液為提取劑，在體積比V[Hmim]Br∶V乙醇為1∶6，固液比為1∶50，超聲時(shí)間為30min的條件下比較了不同提取劑對(duì)酸棗仁中黃酮的提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出 [Hmim]Br的乙醇溶液為提取劑時(shí)，提取率高于其他3種。具有相同陽(yáng)離子的 [Bmim] Br、 [Bmim]BF4和 [Hmim]Br、 [Hmim]BF4的提取率不同，是因?yàn)殛庪x子的種類對(duì)提取率有所影響。陽(yáng)離子相同、陰離子不同的咪唑類離子液體的表面張力變化范圍也較大，通常陰離子的質(zhì)量影響著表面張力，表面張力隨陰離子質(zhì)量的增加而增大[7]。此外，具有相同陰離子結(jié)構(gòu)的[Bmim] Br、 [Hmim]Br和 [Bmim]BF4、 [Hmim]BF4兩對(duì)離子液體對(duì)黃酮的提取率相差較多，這說明陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)對(duì)黃酮提取率的影響更大，這是因?yàn)閇Hmim]+比 [Bmim]+的碳鏈長(zhǎng)，碳鏈越長(zhǎng)非極性越強(qiáng)，根據(jù)“相似相溶”原理，對(duì)黃酮的溶解能力越強(qiáng)，從而提高黃酮的提取率。故本實(shí)驗(yàn)選擇[Hmim]Br為提取劑。

圖1 離子液種類對(duì)黃酮提取率的影響

2.3 提取試劑濃度的選擇

以 [Hmim]Br的乙醇溶液為提取劑后，考察了不同體積濃度的 [Hmim]Br的乙醇溶液（V[Hmim]Br∶V乙醇=1∶3，1∶6，1∶9，1∶15） 對(duì)提取率的影響，在固液比為1∶50，超聲時(shí)間為30min的條件下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。由圖可知，隨著 [Hmim]Br體積濃度的增大，提取率也相應(yīng)的增大，當(dāng)[Hmim]Br與乙醇的體積比為1∶6時(shí)，提取率達(dá)到最大。之后提取率卻不再增大反而減小，是因?yàn)殡S著 [Hmim]Br體積濃度的增大，提取劑的溶解能力和提取能力也在增強(qiáng)。當(dāng)達(dá)到1∶6后，[Hmim]Br的濃度比較大，溶液的黏度較大，擴(kuò)散能力差，提取率低。故本實(shí)驗(yàn)選擇 [Hmim]Br與乙醇體積比為1∶6的溶液作為提取劑。

圖2 不同離子液體濃度對(duì)黃酮提取率的影響

2.4 超聲提取時(shí)間的選擇

為了取得最佳提取效果，本實(shí)驗(yàn)還考察了超聲提取時(shí)間（15min，30min，45min，60min） 對(duì)提取率的影響。在 [Hmim]Br與乙醇體積比為1∶6的溶液作為提取劑，固液比1∶50的條件下，不同提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響結(jié)果如圖3。其提取率先上升后下降，在30min時(shí)達(dá)到最大，30min之后提取率明顯降低。其原因是，隨著提取時(shí)間的不斷增加，提取體系的溫度也隨之升高，從而影響提取效果。超聲波提取是利用輻射產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)、擾動(dòng)效應(yīng)、擊碎和攪拌作用等多級(jí)效應(yīng)，加速有效成分的溶解。在此過程中，首先，隨著提取時(shí)間的增加，酸棗仁中黃酮溶解，使提取率增加；其次，隨著提取時(shí)間繼續(xù)增加，空化效應(yīng)、擊碎效應(yīng)會(huì)增大黃酮的分解速率，因此測(cè)定的黃酮含量減少[8]。所以本實(shí)驗(yàn)最終選擇的超聲提取時(shí)間為30min。

2.5 固液比的選擇

圖3 不同超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

固液比的選擇對(duì)提取率有著重要的影響。本實(shí)驗(yàn)考察了不同的固液比對(duì)提取率的影響，在超聲提取時(shí)間為30min， [Hmim]Br的乙醇溶液為提取劑且V[Hmim]Br∶V乙醇=1∶6的條件下，不同固液比對(duì)黃酮的提取率的影響如圖4。由圖可以看出當(dāng)固液比分別為從1∶10增加到1∶50時(shí)，提取率逐漸升高。一般情況下，樣品用量一定時(shí)，所用溶劑越多，酸棗仁顆粒周圍的濃度越低，細(xì)胞壁內(nèi)外兩側(cè)的濃度差越大，黃酮物質(zhì)的擴(kuò)散速度越快，加快了黃酮物質(zhì)的溶出速度[9]。因此，在1∶10~1∶50g/mL范圍內(nèi)，提取率增加。當(dāng)固液比在1∶50~1∶60g/mL酸棗仁中黃酮的提取率反而降低。原因是由于增大的溶劑用量對(duì)超聲波能量的吸收增加，從而使植物細(xì)胞吸收超聲波能量的能力減弱，細(xì)胞壁不能完全破裂，黃酮類化合物不從能酸棗仁中很好的溶解出來，導(dǎo)致黃酮的提取率降低[10-12]。

圖4 不同液固比對(duì)黃酮提取率的影響

2.6 無水乙醇與離子液提取黃酮的對(duì)比

稱取相同質(zhì)量的酸棗仁，超聲時(shí)間為30min、固液比為1∶50的條件下，以乙醇為提取劑與以[Hmim]Br的乙醇溶液為提取劑進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，如圖5。用離子液提取酸棗仁的提取效果明顯比只用乙醇提取的效果好，原因是離子液自身獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使黃酮從酸棗仁中更好的提取出來，因此離子液更有優(yōu)勢(shì)。

2.7 不同產(chǎn)地酸棗仁中黃酮的提取

圖5 無水乙醇與離子液對(duì)黃酮提取率的影響

圖6 不同產(chǎn)地的酸棗仁黃酮提取率的對(duì)比

在提取劑為 [Hmim]Br、提取劑體積濃度為[Hmim]Br與乙醇的體積比為1∶6、超聲時(shí)間為30min、固液比為1∶50的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下考察不同產(chǎn)地的酸棗仁中所含的黃酮。結(jié)果如圖6，產(chǎn)地為邢臺(tái)的酸棗仁提取出的黃酮較多。原因可能為酸棗適宜生長(zhǎng)在溫暖干燥的環(huán)境，耐寒、耐堿，不耐澇。邢臺(tái)屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候，適宜酸棗的生長(zhǎng)。山東與邢臺(tái)的地理位置接近，因此黃酮的提取率相近。東南亞終年高溫多雨，不適宜酸棗生長(zhǎng)，所以提取率不太高。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以咪唑類離子液體1-己基-3-甲基-咪唑溴化鹽（[Hmim]Br）的乙醇溶液為提取劑，采用超聲波輔助提取，利用高效液相色譜法測(cè)定脫脂酸棗仁中的黃酮。結(jié)合單因素變化法探索出最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件：提取劑為 [Hmim]Br、提取劑濃度為V[Hmim]Br∶V乙醇=1∶6、超聲時(shí)間為30min、固液比1∶50。該方法操作簡(jiǎn)單易行、適用性廣，耗能小且提取率高，對(duì)環(huán)境無害，為酸棗仁中黃酮的提取研究提供參考。

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O62

A

1672-4658(2015)04-0183-04

2015-07-19

河北省科技廳科技支撐項(xiàng)目.課題編號(hào)：2014ZC104；邢臺(tái)學(xué)院專項(xiàng)課題.課題編號(hào)：XTXY13ZX21

王秀玲（1961-），女，河北巨鹿縣人，畢業(yè)于河北師范大學(xué)，教授，研究方向：中草藥提取與分析.