程 躍，梅 清，劉艷艷，程 君，熊自忠，李家斌，2

臨床分離志賀菌中質(zhì)粒介導(dǎo)磷霉素耐藥基因的檢測

程 躍1，梅 清1，劉艷艷1，程 君1，熊自忠1，李家斌1，2

摘要目的 在磷霉素耐藥志賀菌中檢測質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因fosA、fosA3和fosC2，并分析其傳播方式。方法瓊脂倍比稀釋法測定志賀菌對抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）。在磷霉素耐藥菌株中利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測其質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因fosA、fosA3和fosC2。對陽性擴增產(chǎn)物進行測序分析并對陽性菌株進行接合試驗，采用瓊脂倍比稀釋法測定接合子對12種抗菌藥物的MIC值，PCR法檢測接合子質(zhì)粒介導(dǎo)磷霉素耐藥基因，腸桿菌科基因間的重復(fù)序列PCR（ERIC-PCR）法對陽性菌株進行同源性分析。結(jié)果 263株志賀菌中磷霉素耐藥25株、中介7株，耐藥率為9.5%。PCR結(jié)果顯示18株磷霉素耐藥志賀菌fosA3陽性（基因登錄號為KJ716852），陽性率為6．8%，未檢出fosA和fosC2。18株fosA3陽性株中，13株結(jié)合成功，與受體菌相比，結(jié)合子對磷霉素的MIC值明顯提高，ERIC-PCR法證實部分fosA3陽性志賀菌具有同源性。結(jié)論 首次在臨床分離的志賀菌中檢測到質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因fosA3，雖然目前檢出率不高，但其傳播可造成磷霉素耐藥性的擴散，需要加強監(jiān)測。

關(guān)鍵詞志賀菌；磷霉素；質(zhì)粒；基因

2014－12－10接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染病科，合肥 230022

2安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測中心，合肥 230022

磷霉素是一種廣譜殺菌藥，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的第一步而起到殺菌作用。國外磷霉素主要用于治療非復(fù)雜性下尿路感染，而在我國磷霉素還被用于治療腸道感染［1－2］。目前志賀菌對磷霉素保持著極高的敏感率，但已有少量對磷霉素耐藥的志賀菌在多地區(qū)出現(xiàn)［3－4］，闡明這些細(xì)菌對磷霉素的耐藥機制并及時采取有效措施對保護磷霉素的敏感性和預(yù)防耐藥菌傳播都具有重要意義。目前國內(nèi)外均未見關(guān)于志賀菌對磷霉素耐藥機制的研究報道，志賀菌中由染色體介導(dǎo)的磷霉素耐藥機制尚不明確，但由于質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因可在不同細(xì)菌間相互轉(zhuǎn)移［5］，因此，同為腸桿菌科細(xì)菌的志賀菌可能從其他類型腸桿菌科細(xì)菌中（如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等）獲得質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因。該研究對臨床分離的263株志賀菌進行耐藥性分析，在磷霉素耐藥的志賀菌中檢測質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因，明確耐藥基因的種類以及分析其傳播方式。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株來源 收集安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測中心2011年9月～2012年10月臨床標(biāo)本中分離的非重復(fù)志賀菌263株。所有菌株由全自動微生物分析儀（MicroScan Walk A Way-40）和血清玻片凝集試驗鑒定。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922，轉(zhuǎn)移接合試驗受體菌大腸埃希菌J53AZR以及fosA、fosA3和fosC2基因陽性標(biāo)準(zhǔn)株均為安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控中心保存菌株。

1．1．2 儀器 PCR儀（德國Biometra公司）；細(xì)菌比濁儀（英國Oxiod公司）；多點接種儀（英國AQSManufacturing公司）；小型離心機（美國Thermo公司）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；電泳儀和電泳槽（北京市六一儀器廠）。

1．1．3 實驗藥物 哌拉西林／他唑巴坦（惠氏制藥有限公司）；頭孢哌酮／舒巴坦（輝瑞制藥有限公司）；頭孢噻肟、頭孢他啶（華北制藥河北華民藥業(yè)有限公司）；頭孢曲松（上海羅氏制藥有限公司）；慶大霉素、阿米卡星（上海中西制藥有限公司）；環(huán)丙沙星（廣州南新制藥有限公司）；左氧氟沙星（揚子江藥業(yè)集團有限公司）；磷霉素鈉（哈藥集團三精制藥股份有限公司）；氯霉素（上?，F(xiàn)代哈森商丘藥業(yè)有限公司）；亞胺培南（默沙東制藥有限公司）。

1．1．4 試劑 Taq酶、10×緩沖液、三磷酸脫氧核糖核苷、DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；M-H瓊脂購自英國Oxoid公司；6-磷酸葡萄糖購自美國Sigma公司；麥康凱瓊脂購自杭州天和微生物試劑有限公司；志賀菌鑒定多價血清購自蘭州生物制品研究所。

1．2 方法

1．2．1 藥敏試驗 采用瓊脂倍比稀釋法測定263

株受試菌對上述12種抗菌藥物的最低抑菌濃度（the minimal inhibitory concentration，MIC），測定磷霉素MIC時，瓊脂平板中加入25 μg／ml的6-磷酸葡萄糖，操作方法及藥敏結(jié)果判讀參照2012年CLSI標(biāo)準(zhǔn)［6］。質(zhì)控菌為ATCC25922。

1．2．2 細(xì)菌DNA模板制備 挑取純培養(yǎng)菌落于內(nèi)置雙蒸水800 μl的1．5 ml離心管中，100℃水浴12 min，離心（12 000 r／min）8 min，取上清液，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 PCR檢測耐藥基因 參照文獻［7］設(shè)計fosA、fosA3和fosC2的引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。利用文獻［7］報道的引物與反應(yīng)條件在磷霉素耐藥志賀菌中檢測fosA、fosA3和fosC2。PCR陽性產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行DNA雙向測序并拼接測序結(jié)果，測序結(jié)果在GenBank中經(jīng)BLAST程序分析比對。見表1。

表1　PCR擴增引物序列

1．2．4 接合試驗 以fosA3陽性志賀菌為供體菌，大腸埃希菌J53AZR為受體菌。用含磷霉素（100 μg／ml）和疊氮鈉（200 μg／ml）的麥康凱瓊脂平板為選擇平板進行接合試驗，選擇平板上長出的紅色細(xì)小菌落即為接合子。接合子在選擇平板上傳代3次后，瓊脂倍比稀釋法測定結(jié)合子的MIC，PCR法檢測質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因。

1．2．5 同源性分析 參照文獻［8］，采用腸桿菌科基因間的重復(fù)序列PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，ERIC-PCR）法對質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因陽性志賀菌進行同源性分析，利用軟件Quantity One 4．5進行相似性分析得出菌株間相似性聚類圖，凡相似度值＞85%者為同一亞型［9］，代表同一克隆株；＜85%者為不同的基因型，代表不同的克隆株。

2 結(jié)果

2．1 藥敏分析 263株志賀菌對磷霉素的耐藥率為9.5%，中介率為2.7%。在12種受試藥物中氯霉素的耐藥率最高達到87.8%，亞胺培南的敏感率最高達到100%，哌拉西林／他唑巴坦和頭孢哌酮／舒巴坦的敏感率分別為99.2%和97.0%，僅次于亞胺培南。頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星的敏感率分別為72.2%、50.6%、52.5%、60.5%和64.3%，氨基糖苷類抗菌藥物中的阿米卡星和慶大霉素的敏感率較高分別是95.0%和61.6%。見表2。

表2　263株臨床分離志賀菌屬對12種抗菌藥物的耐藥率

2．2 磷霉素耐藥基因檢測 25株磷霉素耐藥志賀菌中的18株P(guān)CR擴增出大小為282 bp的基因片段。見圖1。經(jīng)測序比對確定為fosA3（基因注冊號為KJ716852）。fosA3在263株臨床分離志賀菌的檢出率為6．8%（18／263），磷霉素耐藥菌株中fosA3檢出率為72%（18／25）。未檢出fosA和fosC2基因。

2．3 接合實驗 18株fosA3陽性志賀菌中13株與J53AZR接合成功，接合子鑒定為大腸埃希菌，經(jīng)PCR擴增及測序證實13株接合子均攜帶fosA3基因。見圖2。接合子的磷霉素MIC值與受體菌

J53AZR相比均有數(shù)千倍的提高，接合子的MIC均＞1 024 μg／ml。臨床株、接合子和受體菌的MIC值。見表3、4。

表3　fosA3陽性志賀菌對12種藥物的MIC值（μg／ml）

表4　接合子和受體菌對11種藥物的MIC值（μg／ml）

2．4 ERIC-PCR分析 18株fosA3陽性志賀菌經(jīng)ERIC-PCR反應(yīng)，得到清晰指紋圖譜，其條帶數(shù)最多為12條。見圖3。利用Quantity One 4．5進行相似性分析得到相似性類聚圖。見圖4?？梢?8株fosA3陽性志賀菌中相似度值＞85%的有2164與22106、152與1175、1171與1117以及1120、1139與1189，所以2164和22106為同一克隆株、152和1175為同一克隆株、1171和1117為同一克隆株以及1120、1139和1189三者為同一克隆株，18株fosA3陽性志賀菌可被分為13個克隆株。

3 討論

志賀菌引起的細(xì)菌性痢疾嚴(yán)重影響著人類的健康，有效的抗菌藥物治療是治療的關(guān)鍵。喹諾酮類藥物和三代頭孢是治療細(xì)菌性痢疾的首選，本組志賀菌對喹諾酮類藥物和三代頭孢的敏感率為45.5%～72.2%，與安徽省2005年志賀菌耐藥性監(jiān)測［5］結(jié)果相似，可見喹諾酮類藥物和三代頭孢作為治療志賀菌感染的首選藥物正在逐漸失去優(yōu)勢；氨基糖苷類藥物由于體內(nèi)對志賀菌無效和較強的毒副作用，故并不適用于臨床治療細(xì)菌性痢疾；亞胺培南、頭孢哌酮／舒巴坦和哌拉西林／他唑巴坦雖然對志賀菌敏感率極高，但昂貴的價格限制了這些藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用。本研究藥敏結(jié)果顯示本組細(xì)菌對磷霉素的敏感率為87.5%，高于三代頭孢和喹諾酮類藥物的敏感率。磷霉素還是一種價格低廉、毒副作用低的藥物，因此磷霉素適合被廣泛用于治療細(xì)菌性痢疾，尤其是兒童痢疾患者。

本研究首次嘗試在25株對磷霉素耐藥志賀菌中檢測其他腸桿菌科細(xì)菌中報道較多的質(zhì)粒介導(dǎo)磷霉素耐藥基因fosA、fosA3和fosC2［7，10］。結(jié)果顯示25株磷霉素耐藥志賀菌中的18株檢測到fosA3，未檢測到fosA和fosC2。fosA3基因是2009年由日本學(xué)者Wachino et al［11］首次在產(chǎn)CTX-M酶的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)。fosA3編碼的磷霉素修飾酶FosA3是一種Mn2＋和K＋依賴的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，通過催化谷胱甘肽與磷霉素形成復(fù)合物導(dǎo)致磷霉素失效，引起耐藥［12］。目前fosA3僅在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中被發(fā)現(xiàn)［10］。本研究首次在志賀菌中檢測到fosA3基因，表明fosA3同樣流行于志賀菌中，其流行范圍在擴大，需要引起足夠關(guān)注。本研究在磷霉素耐藥志賀菌中僅檢測到fosA3，其陽性率達到72%，提示fosA3可能是引起志賀菌對磷霉素耐藥的主要機制。fosA3陽性志賀菌的MIC值介于256 ～2 048 μg／ml，而攜帶fosA3的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的MIC值也＞256 μg／ml［10］，表明fosA3可以導(dǎo)致細(xì)菌對磷霉素高度耐藥。

對18株fosA3陽性志賀菌進行了接合實驗，其中的13株接合成功，接合成功率為72.2%，提示fosA3極易隨著質(zhì)粒在細(xì)菌間傳播。有報道［13－14］顯示fosA3常與其他耐藥基因（如blaCTX-M、rmtB、blaTEM等）位于同一質(zhì)粒上共同傳播引起細(xì)菌多重耐藥。接合試驗結(jié)果顯示12株志賀菌同時將頭孢噻肟、頭孢曲松的耐藥性水平轉(zhuǎn)移給受體菌，提示志賀菌中CTX-M與fosA3可能位于一個質(zhì)粒上共同傳播；1株志賀菌同時將氯霉素、磷霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松、阿米卡星和慶大霉素的耐藥性轉(zhuǎn)移給受體菌，這些藥物的耐藥基因是否位于一個質(zhì)粒上共同傳播有待進一步研究。ERIC-PCR法結(jié)果顯示18 株fosA3陽性志賀菌可被分成13個克隆株，部分菌株屬于同一克隆株，提示在本地區(qū)可能存在fosA3陽性志賀菌克隆傳播，因此加強傳播源和傳播途徑的控制尤為重要。

本研究首次在志賀菌中檢測到質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因fosA3，并證明其有水平傳播和克隆傳播的特性，需加強監(jiān)測。本研究中7株志賀菌雖然對磷霉素耐藥但其質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因檢測陰性，推測可能存在染色體介導(dǎo)的磷霉素耐藥機制，對其耐藥機制的研究將是下一步工作的重點。

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Detection plasmid-mediated fosfomycin resistance genes in clinical isolated shigella

Cheng Yue，Mei Qing，Liu Yanyan，et al
（Dept of Infectious Disease，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To investigate plasmid-mediated fosfomycin resistance genes fosA，fosA3 and fosC2 in fosfomycin resistance shigella and analyze its mode of transmission．Methods Antimicrobial susceptibility testing was performed by agar dilution method．Using polymerase chain reaction（PCR）to detect the plasmid-mediated fosfomycin resistance genes fosA，fosA3 and fosC2 in fosfomycin resistance strains．DNA sequencing of gene-positive strains were analyzed and the conjugation experiment was performed．The minimal inhibitory concentration（MIC）of recipient strains and transconjugants were tested by agar dilution method for fosfomycin and other antimicrobial agents．Plasmid-mediated fosfomycin resistance genes in transconjugants were determined by PCR，enterobacterial intergenic consensus PCR（ERIC-PCR）was employed to understand the molecular homology of the fosA3-positive isolates．Results In 263 strains of shigella，resistanc to fosfomycin was 25，intermediate resistance to fosfomycin was 7，resistant rate was 9.5%．PCR results showed that 18 drug-resistant strains fosA3 positive（GenBank accession numbers of fosA3 is KJ716852），positive rate was 6．8%，no fosA and fosC2 gene was detected．The conjugation experiments were successfully carried out in 13 PCR-positive isolates．The MIC of transconjugants against fosfomycin increased differently compared to recipient strains．The homology of partly fosA3-positive isolates was comfirmed by ERICPCR．Conclusion The plasmid-mediated fosfomycin resistance gene fosA3 is first detected in clinical isolates of shigella，although the plasmid-mediated fosfomycin resistance genes are lowly prevalent in clinical isolates of shigella，but these resistance genes can lead to the characteristic fosfomycin resistence transfer，which indicates that more attention should be paid to this phenomenon．

Key wordsshigella；fosfomycin；plasmid；genes

作者簡介：程 躍，男，碩士研究生；李家斌，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lijiabin948＠vip．sohu．com

基金項目：安徽省教育廳自然科學(xué)基金（編號：KJ2011A180）；安徽省教育廳自然科學(xué)基金（編號：KJ2012A177）

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0441－05

中圖分類號R 378．2＋5