陳淳陳啟紅孫毅高露娟曾同祥（．湖北省荊州市中心醫(yī)院皮膚病與性病科，荊州43400；．上海市復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科，上海0003）

低濃度他克莫司與抗真菌藥物聯(lián)合的體外抗真菌效應(yīng)

陳淳1陳啟紅1孫毅1高露娟2曾同祥1
（1．湖北省荊州市中心醫(yī)院皮膚病與性病科，荊州434100；2．上海市復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科，上海200032）

【摘要】目的 測定他克莫司（FK?5066）與抗真菌藥物對淺部致病真菌的聯(lián)合效應(yīng)。方法 參考CLSI的M27?A3和M38?A2方案分別測定酮康唑?qū)δ钪榫?、特比萘芬對皮膚癬菌的最低抑菌濃度（MIC）；利用棋盤法，測定他克莫司與酮康唑或特比萘芬的聯(lián)合抗真菌效果。結(jié)果 酮康唑單獨(dú)對念珠菌MIC50和MIC90分別為：4 μg／mL和8 μg／mL；與他克莫司聯(lián)合應(yīng)用時，對53．3%的菌株有聯(lián)合效應(yīng)（n＝15），對其余菌株無協(xié)同效應(yīng)。特比萘芬單獨(dú)對皮膚癬菌MIC50和MIC90分別為：0．06 μg／mL和0．125 μg／mL；與他克莫司聯(lián)合應(yīng)用時，對46．7%菌株（n＝15）有協(xié)同效應(yīng)，對其余菌株表現(xiàn)為無關(guān)。結(jié)論 低濃度他克莫司在體外與抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用時，能夠降低藥物對部分菌株的MIC，未發(fā)現(xiàn)拮抗效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】念珠菌；他克莫司；皮膚癬菌；抗真菌；體外藥敏試驗(yàn)

In vitro antifungal activity of tacrolimus combined with antifungals against Candida spp．a(chǎn)nd dermatophytes

CHEN Chun1，CHEN Qi?hong1，SUN Yi1，GAO Lu?juan2，ZENG Tong?xiang1

（1．Department of Dermatology and Venereology，Jingzhou Central Hospital，Jingzhou 434100，China；2．Department of Dermatology，Zhongshan Hospital Fudan University，Shanghai，200032，China）

【Abstract】Objectives To investigate the in vitro antifungal susceptibility of FK?506 combined with antifungals to Candida spp．a(chǎn)nd dermatophytes．Methods The minimal inhibitory concentrations（MICs）of Candida spp．a(chǎn)gainst ketoconazole and dermatophytes against terbinafine were assayed using CLSI M27?A3 and M38?A2 microdilution method，respectively．By using broth microdilution checkerboard technique system，we evaluated the combined antifungal activity of tacrolimus with ketoconazole or terbinafine against Candida spp．a(chǎn)nd dermatophytes，respectively．Results The MIC50and MIC90of ketoconazole against Candida spp．were 4 μg／mL and 8 μg／mL，respectively．The MIC50and MIC90of terbinafine against dermatophytes were 0．06 μg／mL and 0．125 μg／mL，respectively．The result showed that the combination of tacrolimus and Ketoconazole or Terbinafine had synergistic inhibitory activity against Can?dida spp．（53．5%，n＝15）and dermatophytes（46．7%，n＝15）．Conclusion The MICs of antifungals can be reduced partly when combined with low concentration of FK?506 against Candida spp．a(chǎn)nd dermatophytes，and no antagonism was found．

【Key word】 Candida spp．；Tacrolimus（FK?506）；dermatophytes；antifungl；in vitro susceptibility

［Chin J Mycol，2015，10（4）：207?209］

淺部真菌病是指真菌感染皮膚角質(zhì)層、表皮及附屬器而引起的真菌病，主要由皮膚癬菌和念珠菌等感染引起，是十分常見的真菌感染性疾病［1?2］。近年來，其發(fā)病率不斷增多，嚴(yán)重影響人們的身心健康和生活質(zhì)量。手足癬及體癬主要由皮膚癬菌屬的須癬毛癬菌和紅色毛癬菌引起［2］，而間擦疹和黏膜部位的感染則多由念珠菌感染引起［3］。

淺部真菌病的外用藥物主要是含有抗真菌藥物的乳膏或者搽劑，如酮康唑、聯(lián)苯芐唑和特比萘芬等。聯(lián)合少量的糖皮質(zhì)激素如曲安奈德能夠較快改善患者癥狀，加快炎癥的消退而且不影響抗真菌藥物的療效［3］。然而由于激素色素沉著、皮下脂肪萎縮等的副作用，限制了其臨床的應(yīng)用［4］。他克莫司乳膏是近年來皮膚科臨床上使用較廣泛的一種非激素的外用抗炎藥，由于其具有良好的抗炎效果，被廣泛用于皮膚科炎癥性疾病的治療，包括特應(yīng)性皮炎、銀屑病和過敏性接觸性皮炎等。他克莫司對人體膠原合成無抑制作用，不會引起皮膚萎縮，局部外用安全性高、耐受性好，因而可用于面部、生殖器和間擦部等薄嫩部位皮膚［5］。

為開發(fā)新型淺部真菌感染的治療組合，以便為臨床療效提高提供理論基礎(chǔ)，我們參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical Laboratory Standard In?stitute，CLSI）頒布的M27?A3和M38?A2方案［6?7］，以微量液基稀釋法分別測定15株念珠菌臨床株對酮康唑和15株皮膚癬菌臨床株對特比萘芬的體外藥物敏感性；同時，我們嘗試聯(lián)合他克莫司與該兩種抗真菌藥物，觀察菌株MIC的變化。研究旨在為改善臨床淺部真菌病的治療提供一定的幫助，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)菌株

30株臨床分離株均保藏于荊州市中心醫(yī)院皮膚科真菌實(shí)驗(yàn)室。15株念珠菌均經(jīng)過CHROMagar顯示培養(yǎng)基和API?20C?AUX進(jìn)行鑒定，包括8株白念珠菌，4株熱帶念珠菌和3株近平滑念珠菌。皮膚癬菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子學(xué)鑒定，包括10株紅色毛癬菌和5株須癬毛癬菌。所有菌株試驗(yàn)前均在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）斜面上活化（30℃，7 d），以保證受試真菌的活力與純度。

1．2抗真菌藥物

酮康唑（Sigma Chemical Co，St．Louis，批號：456136），特比萘芬（Sigma Chemical Co，St．Louis，批號：T8826）和他克莫司（Sigma Chemical Co，St．Louis，批號：F4679）。將藥物以分析純度的DMSO溶解成儲存液，濃度均為1 600 μg／mL。

1．3微量液基稀釋法

參考CLSI M27?A3和M38?A2方案［6?7］，應(yīng)用經(jīng)三氮嗎啡啉丙磺酸鈉（MOPS）緩沖（pH＝7．0）的RPMI 1640液體培養(yǎng)基，過濾滅菌。用無菌生理鹽水收集孢子，以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子量均為（1～3）×106CFU／mL；然后以RPMI 1640液體培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋1 000倍，致接種終濃度為（1～3）× 103CFU／mL；特比萘芬的濃度為2～0．003 μg／mL，酮康唑?yàn)?6～0．03 μg／mL；他克莫司的濃度為16～0．03 μg／mL；同時設(shè)立生長對照（無藥物孔）和陰性對照（無菌孔）；分別于35℃孵育48 h（念珠菌）和4 d（皮膚癬菌）。肉眼觀察判讀結(jié)果，酮康唑?qū)δ钪榫淖畹鸵志鷿舛龋∕IC）定義為肉眼觀察到的與生長對照相比50%抑制的最低藥物濃度。特比萘芬對皮膚癬菌的MIC則定義為肉眼觀察到的與生長對照相比80%抑制的最低藥物濃度。所有藥敏試驗(yàn)均重復(fù)操作2遍。藥敏質(zhì)控菌株為ATCC22019。通過每種藥物對不同菌株的MIC值求出能夠抑制50%菌株的MIC值（MIC50）和抑制90%菌株的MIC值（MIC90）。

1．4聯(lián)合體外藥物敏感性

藥物聯(lián)合采用棋盤法，即在96孔板中分別加入不同濃度的兩種藥物，同時設(shè)立生長對照和空白對照。特比萘芬的濃度為2～0．003 μg／mL，酮康唑?yàn)?6～0．03 μg／mL，他克莫司的濃度為16～0．03 μg／mL。接種時除陰性對照外其余各孔均加入100 μL的2倍終濃度的菌懸液，35℃孵育48～96 h后觀察結(jié)果。所有藥敏試驗(yàn)均重復(fù)操作2次。分?jǐn)?shù)抑菌濃度（FIC）的判定：與生長對照孔相比，生長100%抑制所對應(yīng)的最低藥物濃度，包括各藥物單獨(dú)和聯(lián)合時的MIC值。聯(lián)合用藥時各藥物的MIC值分別除以單獨(dú)用藥時MIC值的商的和，即分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration in?dex，F(xiàn)ICI）＝MIC A聯(lián)合／MIC A單獨(dú)＋MIC B聯(lián)合／MIC B單獨(dú)。相互作用解釋為：FICI＜0．5為協(xié)同作用，0．5＜FICI≤4為無關(guān)，F(xiàn)ICI＞4為拮抗。

2　結(jié) 果

酮康唑?qū)δ钪榫鶰IC范圍為2～8 μg／mL；特比萘芬對皮膚癬菌的MIC范圍為0．06～0．5 μg／mL；酮康唑單獨(dú)對念珠菌MIC50和MIC90分別為4 μg／mL和8 μg／mL；特比萘芬單獨(dú)對皮膚癬菌MIC50和MIC90分別為0．06 μg／mL和0．125 μg／mL。酮康唑與他克莫司聯(lián)合應(yīng)用時，對53．3%菌株（8／15）有聯(lián)合效應(yīng)，對其余菌株無協(xié)同效應(yīng)（見表1）。特比萘芬與他克莫司聯(lián)合應(yīng)用時，對46．7%菌株（7／15）由協(xié)同效應(yīng)，對其余菌株表現(xiàn)為無關(guān)（見表2）。

3　討 論

他克莫司（FK?506），是1984年從非致病真菌中提取的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑。他克莫司和環(huán)孢素A相比，其分子量較小，但免疫活性是環(huán)孢素A的10～100倍，該藥最早用于器官移植后的免疫抑制治療。他克莫司軟膏是首個開發(fā)成功的外用免疫調(diào)節(jié)劑，有效且安全，在皮膚科的應(yīng)用越來越廣泛［5］。酮康唑作為作為常用的唑類抗真菌藥物，廣泛用于念珠菌病的治療。特比萘芬通過抑制真菌細(xì)胞膜的合成發(fā)揮殺真菌的作用，體內(nèi)、外都有非常好的抗皮膚癬菌作用［3］。通過微量液基稀釋法，我們觀察到酮康唑?qū)δ钪榫鶰IC范圍為2～8 μg／mL；特比萘芬對皮膚癬菌的MIC范圍為0．06～0．5 μg／mL，他克莫司對所有菌株的MIC均≥16 μg／mL。

表1　酮康唑單獨(dú)和聯(lián)合他克莫司對念珠菌體外抗真菌藥物敏感性Tab．1 In vitro antifungal susceptibility of FK?506 combined with ke?toconazole to Candida spp．

然而，我們發(fā)現(xiàn)部分菌株在他克莫司存在的情況下，對抗真菌藥敏的敏感性有一定的增加。他克莫司發(fā)揮作用于鈣離子依賴的信號傳導(dǎo)途徑，使鈣調(diào)磷酸酶失活，從而抑制依賴活化T細(xì)胞核因子的細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄［5］。而鈣調(diào)磷酸酶對于真菌胞壁的完整性、毒力及真菌對抗真菌藥物耐受都具有重要作用。文獻(xiàn)報道他克莫司與卡泊芬凈、伊曲康唑、伏立康唑在體外有聯(lián)合抗白念珠菌作用［8?9］。此外，當(dāng)他克莫司與伊曲康唑、泊沙康唑聯(lián)合抗米根霉時，其對唑類藥物的敏感性明顯增高，并且從抑菌作用變?yōu)闅⒕饔茫@種機(jī)制可能與他克莫司誘導(dǎo)凋亡有關(guān)［10］。然而，他克莫司對真菌藥物MIC的影響還有待于更進(jìn)一步的研究。

本研究中他克莫司能夠降低抗真菌藥物對部分菌株的MIC，并且沒有發(fā)現(xiàn)任何拮抗作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步豐富了他克莫司在抗真菌治療中的研究，能夠更好地為臨床治療提供一定的參考，但體外藥敏結(jié)果與臨床藥物治療效果之間的一致性有待進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)踐來證實(shí)。

表2　特比萘芬單獨(dú)和聯(lián)合他克莫司對毛癬菌體外抗真菌藥物敏感性Tab．2 In vitro antifungal susceptibility of FK?506 combined with ter?binafine to Trichophyton

參考文獻(xiàn)

［1］ Havlickova B，Czaika VA，F(xiàn)riedrich M．Epidemiological trends in skin mycoses worldwide［J］．Mycoses，2008，51（Suppl 4）：2?15．［2］ Claus S，Jean?Philippe B，Bernard M．Updates on the Epidemiolo?gy of Dermatophyte Infections［J］．Mycopathologia，2008，166（5?6）：335?352．

［3］ Larry EM．Current concepts in systemic and topical therapy for superficial mycoses［J］．Clinics in Dermatology，2010，28（2）：212?216．

［4］ 張建中．幾種新的外用糖皮質(zhì)激素［J］．中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2005，2（5）：30?33．

［5］ Lauermua AL，Surber C，Maibach HI．Absorption of topical ta?crolimus ointment for atopic dermatitis（FK506）in vitro through human skin：comparisnon with cyclosporin A［J］．Skin Pharma?col，1997，10（5?6）：230?234．

［6］ Clinical and Laboratory Standards Institute．Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fun?gi；Approved standard．Document M38?A2［S］．CLSI，Wayne，PA，USA，2008．

［7］ Clinical and Laboratory Standards Institute．Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts；Approved standard．M27?A3［S］．CLSI，Wayne，PA，USA，2008．

［8］ Zhang J，Silao FG，Bigol UG，et al．Calcineurin is required for pseudohyphal growth，virulence，and drug resistance in Candida lusitaniae［J］．PLoS One，2012，7：e44192．

［9］ Sun S，Li Y，Guo Q，et al．In vitro interactions between tacrolimus and azoles against Candida albicans determined by different methods［J］．Antimicrob Agents Chemother，2008，52（2）：409?417．

［10］ Shirazi F，Kontoyiannis DP．The calcineurin pathway inhibitor ta?crolimus enhances the in vitro activity of azoles against Mucor?ales via apoptosis［J］．Eukaryot Cell，2013，12（9）：1225?1234．

［本文編輯］ 施 慧

·論著·

［收稿日期］2015?04?11

通訊作者：孫毅，E?mail：710514760＠qq．com；高露娟，E?mail：gao＿lujuan＠163．com

作者簡介：陳淳，女（漢族），本科，主管護(hù)師．E?mail：64414730＠qq．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81401677，31400131）

【中圖分類號】R 978．5

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1673?3827（2015）10?0207?03