李　程　陳　波　胡鐵漢　陳　磊(貴陽中醫(yī)學院針灸推拿學院，貴州　貴陽　550025)

毫針針刺對腧穴筋膜結締組織細胞整合素β1、β3亞基和PCNA表達的影響

李程1陳波胡鐵漢陳磊
(貴陽中醫(yī)學院針灸推拿學院，貴州貴陽550025)

〔摘要〕目的探討毫針針刺對SD大鼠腧穴穴區(qū)筋膜結締組織細胞2種整合素β亞基和增殖細胞核抗原(PCNA)表達的影響。方法將32只SD大鼠隨機分為空白對照組、細針刺激組、中針刺激組(中等粗細毫針刺激組)和粗針刺激組，每組8只，除空白組外，針刺各組在大鼠中脘穴沿任脈循行方向平刺施以捻轉平補平瀉刺激，治療1次/d，治療3 d后，切取穴區(qū)筋膜結締組織，采用免疫組化染色法，鏡下觀察腧穴穴區(qū)筋膜結締組織整合素β1亞基(integrinβ1)、integrinβ3及PCNA蛋白表達。結果毫針針刺作用后，腧穴筋膜結締組織integrinβ亞基的表達變化情況不同:細針刺激組和中針刺激組筋膜結締組織中integrinβ1的表達比空白對照組均有增強，其中細針刺激組integrinβ1的表達統(tǒng)計無顯著差異(P=0.314)，中針刺激組integrinβ1的表達有極顯著差異(P = 0.000)，然而，粗針刺激組integrinβ1的表達較空白組明顯下降，呈翻轉趨勢，差異顯著(P = 0.001) ; integrinβ3除部分大小血管可見少量表達外，在腧穴筋膜結締組織中始終為陰性表達;筋膜結締組織中PCNA蛋白的表達均明顯增強(P = 0.002，0.005，0.039)，其中細針刺激組最強。結論毫針針刺能夠激發(fā)受治腧穴穴區(qū)細胞活性變化，其中β1類integrin是腧穴筋膜結締組織中主要的力學信號蛋白，β3類integrin不是腧穴筋膜結締組織中主要的力學信號蛋白，這可能進一步揭示了腧穴感受針刺治療信號的非神經生物學細胞力學基本原理之一。

〔關鍵詞〕毫針針刺;筋膜結締組織;力感受分子;整合素β亞基;增殖細胞核抗原

1貴州省第二人民醫(yī)院康復科

第一作者:李程(1988-)，女，住院醫(yī)師，主要從事針灸推拿的基礎與康復運用研究。

現代研究認為，毫針針刺實質上是一種復合機械刺激〔1〕，機械力刺激貫穿毫針針刺的整個過程。課題組前期引入離體細胞學實驗初步驗證了腧穴或經絡區(qū)域筋膜結締組織中未分化的潛能細胞——成纖維細胞〔2〕，能將力學刺激進行生物轉換，合成和釋放多種生化活性物質。本課題繼續(xù)以腧穴筋膜結締組織為研究對象，以免疫組化技術探討針刺基本力學作用于腧穴力學信號傳導通路中力感受器分子整合素(integrin)β1亞基和integrinβ3亞基的表達變化，以及受力穴區(qū)細胞增殖細胞核抗原(PCNA)情況的影響，為毫針針刺治療作用的現代生物學原理提供進一步的實驗證據。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組體重為180～220 g的雄性SD大鼠(SPF清潔級) 32只，購自湖南省長沙市天勤生物技術有限公司，動物許可證號: SCXK(湘) 2009-0012。隨機分為空白對照組、細針刺激組(36號毫針)、中針刺激組(30號毫針)、粗針刺激組(26號毫針)，每組8只。

1.2主要實驗器材與試劑1寸毫針(蘇州針灸用品有限公司)、半自動脫水機(Leica，德國)、全自動石蠟包埋機(Leica，德國)、全自動石蠟切片機(Leica，德國)、顯微鏡(Nikon，日本)、數碼相機(Nikon，日本)、IGTB1(瑞博奧，中國北京，批號: 130705w)、IGTB3(Epitomics，美國，YI121306DS)、PCNA一抗(Abcam，英國，批號: YJ020304cs)、EnVision抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(Dako，丹麥)。

1.3方法

1.3.1動物實驗的方法(1)刺激方法:針刺組大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉固定后，在大鼠腹部中脘穴處(參考《實驗針灸學》〔3〕附錄四，大鼠中脘穴定位臍上約20 mm)備皮，消毒沿任脈循行方向平刺刺入0.5 cm，按照平補平瀉手法捻轉5 min，捻轉針體頻率60 r/min(誤差控制±2 r/min)，捻轉幅度180°～360°，留針10 min，再捻轉5 min，捻轉完畢后以針尾為參照物順時針捻轉針體5圈，滯針10 min，10 min后逆時針回轉針體5圈，出針，以消毒干棉球按壓5～10 s。治療1次/d，共治療3 d。相同刺激參數下，各刺激組用相應型號的毫針，空白組做相同的麻醉、抓取、固定。(2)動物手術和取材方法:末次刺激后，將大鼠仰臥位固定，腹部中脘穴區(qū)進一步備皮、消毒，連皮取以大鼠的穴點為中心，邊長約為2 cm正方形的皮下筋膜組織塊，用生理鹽水沖洗并立即放入10％中性緩沖甲醛溶液中固定，組織和固定液的比例為1∶10～1∶20。

1.3.2組織石蠟塊制作組織塊固定2～3 h，取出修剪組織成厚度在2 mm左右，邊長＜7 mm的小塊后，進一步經固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后制成組織石蠟塊，并作后期實驗備用。

1.3.3指標檢測腧穴筋膜結締組織細胞integrinβ1、integrinβ3、PCNA表達測定，均采用免疫組化法，均按試劑盒要求操作。

1.3.4結果觀察及處理免疫組化實驗圖片應用軟件Image pro plus6.0進行分析，在同等參數設置下測定integrinβ1、integrinβ3、PCNA的積分光密度值(IOD)和陽性區(qū)域面積(area)，通過計算平均光密度(MD)反映目標物質的單位面積含量。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2　結果

2.1腧穴筋膜結締組織細胞integrinβ1表達檢測細針刺激組和中針刺激組筋膜結締組織中integrinβ1表達(0.010 288±0.004 779 8，0.016 088±0.003 415 3)較空白對照組(0.008 550±0.003 228 0)均有增強，其中細針刺激組integrinβ1的表達與空白對照組無顯著差異(P = 0.314)，中針刺激組integrinβ1的表達與空白對照組有極顯著差異(P= 0.000)。相反，粗針刺激組integrinβ1的表達(0.002 000±0.001 043 3)明顯下降，呈翻轉趨勢，與空白對照組有極顯著性差異(P = 0.001)。見圖1。

圖1　各組“中脘”穴區(qū)筋膜組織細胞integrinβ1免疫組化的表達(×400)

2.2腧穴筋膜結締組織細胞integrinβ3表達檢測腧穴筋膜結締組織中integrinβ3的表達呈陰性結果，部分大小血管有少量表達。見圖2。

圖2　各組“中脘”穴區(qū)筋膜結締組織integrinβ3免疫組化的表達(×200)

2.3腧穴筋膜結締組織細胞PCNA表達檢測針刺治療組腧穴筋膜組織中PCNA的釋放均比較空白對照組(0.001 525± 0.000 399 1)明顯增強，其中細針刺激組(0.006 800± 0.004 639 6)和中針刺激組(0.006 288±0.002 610 1) PCNA的表達有極顯著差異(P= 0.002，0.005)，粗針刺激組PCNA的表達(0.004 950±0.003 385 3)與空白對照組有顯著差異(P = 0.039)。其中，針刺刺激組PCNA釋放增加的強度呈略微下降趨勢:細針刺激組＞中針刺激組＞粗針刺激組。見圖3。

圖3　各組“中脘”穴區(qū)筋膜結締組織PCNA免疫組化的表達(×400)

3　討論

現代實驗針灸學研究認為〔3〕，針刺腧穴后，其作用機制的始動環(huán)節(jié)在穴位感受器(游離神經末梢、肌梭、環(huán)層小體、克氏終球及關節(jié)囊感覺器)，穴位感受器將針刺機械刺激轉化為神經沖動(生物電信號)，并通過神經調節(jié)和神經-體液調節(jié)發(fā)揮防治疾病作用。但陳波等〔4〕對現代細胞生物力學的廣泛研究發(fā)現除了以往認知的神經組織神經元以外，機體其他組織(上皮組織、結締組織、肌組織的血管內皮細胞、成纖維細胞、骨細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞等)都是力學敏感細胞，力學刺激均可誘使這些細胞將機械信號轉化為生物化學信號，因此曾提出了廣義穴位感受器的學術觀點，并立足于此研究針刺治療的作用機制，逐步從生物物理學的角度建立起針刺效應的非神經組織細胞生物學啟動機制構想。眾多的研究者發(fā)現穴位并不能由一種組織學說來闡述說明時，轉向綜合性、整體性的研究，贊同穴位的立體構筑學說〔5〕，即由多種組織構成，共同參與穴位的傳導作用，但不同的穴位由某一種或幾種組織起著主要作用。同時有學者認為腧穴位于“筋膜支架”〔6〕較粗的珠樣部位，其存在以纖維(膠原纖維、彈性纖維和網狀纖維)為框架，以成纖維細胞為主要細胞主體和以細胞分泌的胞外基質(ECM)為主要成分建構遍布全身的空間網絡中，不僅作為發(fā)揮力學功能的載體，并且參與物質、信息和能量的傳輸和調節(jié)，構成一個能夠對生物機體內外環(huán)境發(fā)生反應的動態(tài)平衡體系。因此，研究毫針針刺對穴區(qū)筋膜組織細胞力感受始動機制和效應反應，可能是進一步認識針刺治療作用基本和必然途徑之一。

生物細胞力學的研究表明: ECM-整合素-細胞骨架是細胞力學信號傳導的經典途徑和重要通路〔7〕。integrin作為跨膜細胞黏附分子家族的重要成員之一，目前被認為是大多數細胞共有的力的感受器〔8〕。1987年，Hynes等首次提出integrin的概念，因其使細胞得以附著而形成一個整體故名。integrin家族是一類由α亞單位(120～185 kD)和β亞單位(90～110 kD)以1∶1比例通過非共價鍵連接而構成的異二聚體跨膜黏蛋白，目前已經確認的有18種α亞單位和8種β亞單位，按照不同的組合共構成至少24種integrin〔9〕。integrinβ按亞單位可分類為β1、β2、β3三個亞家族:其中β1亞家族稱為VLA家族，主要存在于各種體細胞表面，主要介導細胞與ECM成分之間的黏附;含β2亞家族稱為白細胞整合素，主要存在于各種白細胞表面，介導多種細胞間的相互作用;β3亞家族稱為細胞黏附素，主要存在于血小板表面，含人玻璃黏蛋白受體(VNR)和血小板的gp Ⅱb/Ⅲa，介導血小板的聚集，并參與血栓形成。integrin作為跨膜蛋白在ECM→整合素→細胞膜→細胞骨架這一信號傳導通路中起到關鍵的“信號中轉站”作用，主要介導細胞與細胞、細胞與ECM之間的相互黏附，并介導力學信號在細胞內外之間的雙向傳導〔10〕。integrin對于介導針刺生物力學信號傳導作用的研究基本還是一個空白，課題組前期通過體外實驗觀察壓力刺激對大鼠腧穴筋膜組織成纖維細胞力感受器分子integrinα1、integrinα2、α3和integrinαV表達的影響〔11〕，為針推的力學信號生物傳遞機制提供實驗依據。

PCNA〔12〕于1978年由Miyachi等在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者的血清中首次發(fā)現并命名，因其特異的“增殖性”而得名，只存在于正常增殖細胞及腫瘤細胞內，靜止狀態(tài)的細胞基本不表達，其免疫反應大多局限于增殖細胞的核中，胞質則很少甚至沒有。PCNA是目前測試細胞增殖狀態(tài)最有效的標志之一。它的表達合成與增殖細胞的增殖周期有關，G0期細胞核中無明顯表達，G1早期開始表達，至G1晚期其表達大幅度增加，S期達到高峰，G2～M期明顯減少，其表達、分布與量的變化和DNA合成一致，幾乎參與DNA所有的修復過程，對DNA復制的調節(jié)起不可取代的作用。細胞增殖是機體的重要生命特征之一，是機體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎，而應力刺激是調控細胞增殖能力的重要因素之一，能夠調節(jié)細胞新陳代謝〔13〕。有相關報道證實針刺介導的機械刺激可以增強細胞的“活力”:圍刺穴位局部可使其成纖維細胞活性增強從而達到抗皮膚老化的作用〔14〕;通過結合Brud摻入法和免疫熒光法觀察對筋膜結締組織施予拉伸刺激針刺可以顯著提高細胞的增殖活性〔15〕。

本研究結果顯示，不同規(guī)格毫針刺激對腧穴筋膜結締組織integrinβ1亞基的表達情況均有不同程度的影響。無論是否針刺刺激，刺激量不管大還是小，筋膜結締組織細胞中integrinβ3亞基的表達始終呈陰性結果。

綜上實驗結果，其針灸學意義可能是:①β1類integrins是以筋膜結構組織為主的穴位針刺機械信號力學感受的主要分子途徑。②β3類integrins不是以筋膜結構組織為主的穴位針刺機械信號力學感受的主要分子途徑，但有可能是以血管為主的穴位針刺機械信號力學感受的主要分子途徑。③在以β1類integrins為主的穴位筋膜結締組織中，integrinβ1亞基感受有可能存在不同的表現方式，對輕中度刺激強表達，對重刺激弱表達，這可能是integrinβ1亞基感受存在敏感閾值范圍，大體以中等強度刺激為佳。④毫針針刺能夠提高受治腧穴穴區(qū)局部組織的細胞PCNA表達量，進一步揭示了針刺刺激信號通過細胞integrins感受后能激發(fā)細胞本身功能狀態(tài)的改變，但PCNA表達量大小與刺激強度呈反向趨勢，說明針刺信號感受與效應見存在復雜的量-效關系，而這有待于進一步研究。

4　參考文獻

1陳波.毫針刺法基本微觀力學作用的分析研究〔J〕．貴陽中醫(yī)學院學報，2011; 33(2) : 32-5．

2陳波，崔瑾，謝西梅，等.體外壓力刺激對大鼠“足三里”穴筋膜組織成纖維細胞合成釋放基質金屬蛋白酶1、基質金屬蛋白酶抑制劑1、前列腺素E2和胰島素樣生長因子1的影響〔J〕．中國組織工程研究與臨床康復，2010; 14(15) : 2756-60．

3郭義.實驗針灸學〔M〕．北京:中國中醫(yī)藥出版社，2008: 416．

4陳波，江瑜，張小珊，等.機體非神經組織力學敏感細胞的研究與針推治療作用機理的新思考〔J〕．貴陽中醫(yī)學院學報，2012; 34 (1) : 9-12．

5余安勝，趙英俠，嚴振國，等.21世紀“穴位”的形態(tài)研究展望〔J〕．上海針灸雜志，2000; 19(增刊) : 1-2．

6原林，焦培峰，唐雷，等.中醫(yī)經絡理論的物質基礎-結締組織筋膜和自體監(jiān)控體系〔J〕．中國基礎科學，2005; (3) : 44-8．

7 Roberts GC，Critchley DR.Structural and biophysical properties of the integrin-associated cytoskeletal protein talin〔J〕．Biophys Rev，2009; 1(2) : 61-9.

8 Vogel V，Thomas WF，Graig D，et al.Structural insights into the mechanical regulation of molecular recognition sites〔J〕．Trends Biotechnol，2001; 19(10) : 416-24．

9 Hynes RO.lntegrins: bidirectional，allostric sigaling machines〔J〕．Cell，2002; 110(6) : 673-87．

10Ingber DE.Mechanobiology and diseases of mechanotransduction〔J〕．Ann Med，2003; 35(8) : 564-77．

11楊慶，王興桂，李程，等.基本機械力學刺激對腧穴筋膜成纖維細胞力感受器分子整合素α1，α3亞基表達影響研究〔A〕．中國針灸學會第十二屆全國針灸經絡學術研討會論文集〔C〕; 2012: 18-21．

12向生光，胡維新.增殖細胞核抗原PCNA在DNA修復中的作用〔J〕．生命的化學，2009; 29(4) : 472-6．

13邱小忠，李小娜，余磊，等.周期性機械拉伸對C2C12成肌細胞增殖的影響〔J〕．中國臨床解剖學雜志，2006; 24(2) : 183-5．

14蘆源，任寶琴，張鷗.針刺對老齡大鼠皮膚老化影響的實驗研究〔J〕．針灸推拿醫(yī)學:英文版，2011; 9(3) : 137-41．

15張全學，楊林林，戴景興，等.拉伸應力對疏松結締組織結構與細胞活性的影響〔J〕．解剖學雜志，2009; 32(3) : 391-4．

〔2015-01-26修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:陳波(1974-)，男，教授，碩士生導師，博士，主要從事針灸推拿的基礎與臨床運用研究。

基金項目:國家自然科學基金項目(No．81160456)

〔中圖分類號〕R245.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4442-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.010