王玉龍，李慧昕，李 冰，胡永浩，劉勝旺,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001)

鴨病毒性腸炎(Duck viral enteritis，DVE)是由鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)引起的鴨、鵝及多種雁型目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。1923 年，在荷蘭首次報(bào)道該病[1]，隨后多個(gè)國(guó)家均有該病的發(fā)生，美國(guó)多個(gè)州暴發(fā)DVE 疫情[2]。我國(guó)于1957 年首次報(bào)道該病[3]，在我國(guó)各養(yǎng)鴨地區(qū)均有發(fā)生和流行。該病可以導(dǎo)致商品水禽的產(chǎn)蛋量下降和死亡，對(duì)野生水禽有不同的致死率[4]，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于病毒呈長(zhǎng)期潛伏感染狀態(tài)，水禽可帶毒長(zhǎng)達(dá)4 年之久，給疫病的防控帶來(lái)困難[5]。

DEV 為皰疹病毒科成員[6]，基因組為雙股線性DNA，大小約為158 kb[7]，基因組龐大。其基因組中的部分基因?yàn)椴《緩?fù)制非必需基因，如UL44[8]、UL41、US7-8[9]和US2[10]。皰疹病毒科所有成員的TK 基因均編碼胸苷激酶，蛋白具有保守的ATP 結(jié)合基序[11]。其他皰疹病毒如單純皰疹病毒(HSV-1)中已經(jīng)報(bào)道TK 基因?yàn)椴《緩?fù)制非必需基因[12]，而DEV 中TK 基因是否是病毒復(fù)制非必需基因尚未見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)研究在DEV 中TK 基因是否是病毒復(fù)制非必需基因，TK 基因的缺失是否影響病毒的復(fù)制能力。TK 缺失重組DEV 的構(gòu)建也將為以DEV 為載體的活載體疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細(xì)胞及載體 DEV Clone-03 株由本研究室保存；E.coli 感受態(tài)細(xì)胞TG1、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)由本研究室制備；pCS2+載體由清華大學(xué)龐海教授饋贈(zèng)；pMD18-T 載體購(gòu)自TaKaRa 公司。

1.2 主要試劑 T4 DNA 連接酶、Ex Taq DNA 聚合酶及各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa 公司；基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒均購(gòu)自Axygen 公司；轉(zhuǎn)染試劑Fermentas Turbo-Fect 購(gòu)自MBI 公司；兔抗GFP 抗體、羊抗兔IgGHRP 購(gòu)自Sigma 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 中登錄的DEV Clone-03 基因序列UL24(DQ227739)、TK(AY963569)和gH(DQ227740)序列設(shè)計(jì)引物，用于構(gòu)建同源臂片段，序列如下：T1：5'-GACGTGTTGGCATCGGTT C-3'；T2：5'-AAACAAATAGGGAGTAGCGAAGG-3'；T4：5'-CCATGTGCAGCATTACGATGTC-3'，引物由北京華大基因工程有限公司合成。

1.4 目的基因的擴(kuò)增及轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 以DEV Clone-03 基因組DNA 為模板，采用引物T1/T4 擴(kuò)增含有TK 基因及其側(cè)翼序列的片段，克隆至pMD18-T 載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pTK，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。將來(lái)自載體pCS2+的含有CMV 啟動(dòng)子的增強(qiáng)型綠色蛋白(EGFP)表達(dá)盒插入至重組質(zhì)粒pTK 的HpaⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pTK-EGFP。

1.5 重組病毒的構(gòu)建

1.5.1 重組病毒的篩選 將轉(zhuǎn)移載體pTK-EGFP 與DEV 基因組共轉(zhuǎn)染CEF，待出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時(shí)收獲培養(yǎng)物，經(jīng)蝕斑純化對(duì)重組病毒進(jìn)行篩選和純化，綠色熒光為重組病毒篩選標(biāo)記。

1.5.2 重組病毒的PCR 鑒定 采用引物T1/T2 對(duì)蝕斑篩選的表達(dá)EGFP 的重組病毒進(jìn)行PCR 鑒定，利用基因組DNA 提取試劑盒提取重組病毒基因組，同時(shí)以親本病毒為對(duì)照，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并對(duì)獲得的片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5.3 重組病毒的western blot 鑒定 重組病毒以0.001 MOI 接種CEF 單層，在感染后48 h 收集細(xì)胞，同時(shí)以親本病毒DEV Clone-03 和CEF 作為對(duì)照，以兔抗GFP 抗體為一抗(1∶5 000)，以羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)為二抗，DAB 顯色后進(jìn)行western blot 鑒定。

1.6 重組病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué) 重組病毒以0.001 MOI接種于鋪有CEF 單層的12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃孵育2 h，棄掉病毒液，加入DMEM 細(xì)胞維持液(含2 % FBS)，于37 ℃5 % CO2箱中培養(yǎng)。分別于接種后12 h、24 h、48 h、72 h 及96 h 后收獲含有病毒的細(xì)胞和上清液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3 個(gè)平行重復(fù)，反復(fù)凍融3 次，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

將不同時(shí)間點(diǎn)收獲的病毒液做10-1～10-6倍稀釋后接種CEF，每個(gè)稀釋度做8 個(gè)重復(fù)，測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)收獲樣品的TCID50。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品做3 次平行測(cè)定。觀察CPE，連續(xù)觀察7 d 后判定結(jié)果。按照Reed Muench 法計(jì)算病毒的TCID50，繪制生長(zhǎng)曲線。同時(shí)對(duì)親本病毒DEV Clone-03 的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行平行測(cè)定。

1.7 重組病毒感染能力熒光強(qiáng)度檢測(cè) 將重組病毒以0.001 MOI 接種CEF 單層，分別于感染后12 h、24 h、48 h 及72 h 采集樣品，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，以4 %多聚甲醛固定，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光表達(dá)強(qiáng)度，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品采集3 份，平行檢測(cè)。同時(shí)以親本病毒感染細(xì)胞做對(duì)照，檢測(cè)表達(dá)EGFP 的細(xì)胞比率。

1.8 重組病毒遺傳穩(wěn)定性 將重組病毒接種于CEF細(xì)胞連續(xù)傳代，熒光顯微鏡下觀察EGFP 的表達(dá)情況，當(dāng)CPE 達(dá)到80 %～90 %時(shí)收獲病毒。連續(xù)傳代至20 代，每5 代進(jìn)行PCR 檢測(cè)并在熒光顯微鏡下檢測(cè)EGFP 的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用t 檢驗(yàn)對(duì)重組病毒和親本病毒感染后的熒光表達(dá)信號(hào)差異進(jìn)行分析，使用Graphpad prism 5 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 重組病毒的蝕斑篩選 將轉(zhuǎn)移載體和DEV 基因組共轉(zhuǎn)染CEF，轉(zhuǎn)染后的重組病毒在CEF 中進(jìn)行蝕斑純化，熒光顯微鏡下觀察，選取表達(dá)EGFP 的蝕斑進(jìn)行3 輪蝕斑純化，結(jié)果如圖1 所示，經(jīng)3 輪蝕斑純化后獲得純化的表達(dá)EGFP 的重組DEV，命名為rDEVTK-EGPF。

圖1 rDEVTK-EGFP 的蝕斑形態(tài)Fig.1 Morphology of the plaque of rDEVTK-EGFP

2.2 重組病毒的鑒定

2.2.1 重組病毒PCR 鑒定 采用引物T1/T2 對(duì)重組病毒進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果顯示，親本病毒DEV Clone-03 擴(kuò)增出約1 000 bp 的片段，重組病毒可以擴(kuò)增出約3 300 bp 的片段，對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明EGFP 基因已正確插入DEV clone-03的TK 基因內(nèi)部(圖2)。

2.2.2 重組病毒western blot 鑒定 以兔抗GFP 抗體為一抗對(duì)重組病毒進(jìn)行western blot 鑒定，結(jié)果顯示在約35 ku 處能夠檢測(cè)到特異性條帶，其大小與預(yù)期一致。而親本病毒DEV Clone-03 和CEF 中未檢測(cè)到EGFP 的表達(dá)，這一結(jié)果與熒光顯微鏡下綠色熒光蛋白的表達(dá)結(jié)果一致，表明EGFP 插入到DEV 基因組中后得到了正確表達(dá)(圖3)。

圖2 重組病毒PCR 鑒定Fig.2 Identification of recombinant virus by PCR

圖3 Western blot 檢測(cè)重組病毒中EGFP 的表達(dá)Fig.3 Identification of the expression of EGFP in the infected CEF of rDEVTK-EGFP by western blot

2.3 重組病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué) 將rDEVTK-EGFP 和DEV Clone-03 分別以0.001 MOI 接種于CEF 細(xì)胞，分別于不同時(shí)間收獲病毒測(cè)定TCID50，并繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，與親本病毒相比，在感染后12 h～24 h，親本病毒和重組病毒的滴度無(wú)明顯差異，在感染后48 h～72 h，親本病毒滴度和重組病毒滴度差異顯著。感染后96 h，親本病毒和重組病毒的滴度開始下降，表明二者的復(fù)制高峰在72 h(圖4)。重組病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，重組病毒在缺失TK 基因后能夠在CEF 中復(fù)制，但TK 基因缺失使其復(fù)制滴度下降。

2.4 重組病毒感染能力及熒光表達(dá)分析 采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)病毒感染后熒光蛋白表達(dá)的時(shí)相進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，將病毒感染CEF 后各時(shí)間點(diǎn)的峰進(jìn)行疊加，可明顯觀察到重組病毒感染組在感染后24 h有痕量的熒光信號(hào)，感染后48 h 熒光信號(hào)明顯增加，感染后72 h 繼續(xù)增加，而親本病毒感染組無(wú)熒光信號(hào)。對(duì)病毒感染CEF 后各時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度平均值進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，感染后48 h～72 h，重組病毒感染組和親本病毒感染組熒光強(qiáng)度差異極顯著(p<0.01)，重組病毒感染細(xì)胞比率，在感染后12 h為0.37 %，感染后24 h 為2.6 %，感染后48 h 為96.6 %，感染后72 h 為99.8 %(圖5)，表明在感染后24 h 病毒開始具有感染能力，48 h 病毒開始大量增殖，此時(shí)的細(xì)胞感染數(shù)量達(dá)到高峰，感染后72 h感染細(xì)胞比率仍然在增加，該結(jié)果與復(fù)制動(dòng)力學(xué)結(jié)果一致。

圖4 rDEVTK-EGFP 一步生長(zhǎng)曲線Fig.4 One step growth curve of rDEVTK-EGFP

圖5 重組病毒熒光表達(dá)分析Fig.5 Analysis on the fluorescence of the recombinant virus

2.5 重組病毒遺傳穩(wěn)定性 將重組病毒在CEF 中連續(xù)傳代，采用引物T1/T2 對(duì)重組病毒F5、F10、F15 及F20 代進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，各代次重組病毒均能夠擴(kuò)增到目的片段(3 358 bp)，未擴(kuò)增到親本病毒特異性片段(1 100 bp)，表明EGFP 基因在重組病毒復(fù)制過(guò)程中穩(wěn)定遺傳，并且不存在回復(fù)突變。同時(shí)對(duì)重組病毒每5 代進(jìn)行熒光檢測(cè)，在熒光顯微鏡下觀察蝕斑形態(tài)和蝕斑的熒光表達(dá)情況，結(jié)果表明，外源基因EGFP 隨病毒在CEF 中的復(fù)制穩(wěn)定遺傳并穩(wěn)定表達(dá)。

3 討論

DEV TK基因編碼胸苷激酶，是皰疹病毒的主要毒力基因。研究表明皰疹病毒TK 基因內(nèi)部插入外源基因不會(huì)影響病毒的體外復(fù)制[12]。因此，本研究以DEV 為載體，以TK 基因3'端為外源基因插入位點(diǎn)，插入報(bào)告基因EGFP，在插入的同時(shí)造成TK基因的功能缺失，構(gòu)建表達(dá)EGFP 的TK 缺失DEV。重組病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)研究表明，與親本病毒相比，TK 基因缺失重組病毒的滴度下降約10 倍，其在CEF 中復(fù)制時(shí)病毒滴度的高峰和下降的時(shí)間趨勢(shì)與親本病毒一致。Wang 等構(gòu)建了一系列UL44(gC)基因缺失重組DEV，與其親本病毒相比，UL44 缺失重組DEV 滴度下降50～500 倍[8]。因此認(rèn)為，盡管DEV 具有皰疹病毒共有特性，即基因組中部分基因是病毒復(fù)制非必需基因，但基因缺失還是對(duì)病毒的復(fù)制能力造成不同程度的影響。

對(duì)重組病毒表達(dá)熒光的時(shí)相和熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，感染后24 h 即檢測(cè)到痕量的具有熒光信號(hào)的細(xì)胞，在感染后48 h～72 h 熒光信號(hào)明顯增加，從比率上看，在感染后72 h，重組病毒感染組中具有熒光信號(hào)的細(xì)胞達(dá)99.8 %，表明重組病毒對(duì)CEF 的感染能力較好。而此時(shí)在重組病毒對(duì)CEF具有高感染能力的情況下，其病毒復(fù)制滴度與親本病毒相比仍然下降10 倍(p<0.01)，其原因尚有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)也需要檢測(cè)親本病毒和重組病毒對(duì)CEF 細(xì)胞感染能力差異，這部分工作內(nèi)容將在后續(xù)工作中繼續(xù)研究。本研究中將重組病毒于CEF 中連續(xù)傳代至20 代，從基因水平和蛋白水平上檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性，每5 代進(jìn)行PCR 檢測(cè)和熒光表達(dá)確認(rèn)，結(jié)果表明TK 基因可以作為外源基因插入位點(diǎn)，攜帶外源基因穩(wěn)定遺傳，并且外源基因能夠穩(wěn)定表達(dá)。

DEV 的宿主譜較窄，作為活載體疫苗具有很大優(yōu)勢(shì)，一方面可以作為水禽疫病疫苗載體，另一方面也可用于非感染宿主如雞，因此近年來(lái)以DEV 為疫苗載體的研究比較活躍。Liu 等以DEV 為載體構(gòu)建表達(dá)禽流感病毒HA 基因重組DEV，將其免疫肉雞，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生快速免疫保護(hù)，在免疫后3 d既可抵抗H5N1 亞型高致病性禽流感病毒致死劑量的攻擊，并且在免疫后采集腦、十二指腸、肝臟、法氏囊和血液等樣品，檢測(cè)DEV 在各組織中的復(fù)制，結(jié)果未在上述任何組織中檢測(cè)到DEV 的復(fù)制[13]，表明DEV 在雞體內(nèi)不進(jìn)行復(fù)制。因此，從更廣泛的范圍來(lái)說(shuō)，DEV 可作為禽用疫苗的載體，在水禽其可以同時(shí)預(yù)防兩種以上水禽傳染病，在非易感宿主如雞等，其可作為非復(fù)制型疫苗載體，研制雞用新型活載體疫苗。

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