一株H1N1亞型豬流感病毒的分離鑒定及其遺傳進(jìn)化分析

付新亮，方 博，王麗芳，何淑儀，鄭 運，紀(jì)方曉，曹振鵬，周 沛，陳濟(jì)鐺，粟 碩，張桂紅

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

豬流感(Swine influenza，SI)是由A 型流感病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病。1930 年Shope 首次分離鑒定了經(jīng)典H1N1 亞型豬流感病毒(SIV)。其主要引起咳嗽、噴嚏、流鼻涕、體溫升高、呼吸困難和食欲下降等癥狀，與其他病原混合感染，會使病情加重，死亡率增高，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

SIV 屬于正粘病毒科A 型流感病毒屬，為單股負(fù)鏈分節(jié)段RNA 病毒，其基因組由8 個獨立節(jié)段構(gòu)成，編碼至少10 種基因產(chǎn)物，其中節(jié)段1～3 分別編碼PB2、PB1、PA 聚合酶，節(jié)段4 和節(jié)段6 分別編碼血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，節(jié)段5 編碼核蛋白(NP)，節(jié)段7 編碼基質(zhì)蛋白M1和離子通道蛋白M2，節(jié)段8 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2[1]。一般認(rèn)為SIV 具有宿主限制性，很少跨越種間屏障在另外的宿主群內(nèi)建立穩(wěn)定的譜系。但由于豬體內(nèi)呼吸道上皮細(xì)胞具有人流感病毒受體SA-α-2、6Gal 和禽流感病毒(AIV)受體SA-α-2、3Gal[2]，因此豬既可以感染人流感病毒又可以感染AIV，被認(rèn)為是禽、豬、人等不同流感病毒基因重組或重配的“混合器”。目前在豬群中流行的SIV 主要有H1N1、H1N2和H3N2 3 種亞型。其中H1N1 亞型SIV 主要包括經(jīng)典SIV、歐亞類禽H1N1 SIV 和甲型H1N1 SIV[3-6]。本研究從采集的樣品中分離得到一株H1N1 亞型SIV，對其進(jìn)行分子特征和遺傳進(jìn)化分析以及小鼠的致病性試驗，為了解當(dāng)前我國豬群中流行的SIV的來源與進(jìn)化提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集、SPF雞胚及實驗動物 于2013 年11 月～12 月在廣東省5 個豬場共采集疑似流感癥狀豬鼻拭子115 份，樣品經(jīng)雙抗處理后用于病毒分離；10 日齡SPF 雞胚購自華南農(nóng)大生物藥品有限公司；6 周齡雌性BALB/c 小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑 TRIzol 總RNA 提取試劑購自天根生化科技(北京)有限公司；M-MLV Reverase、Ex Taq DNA 聚合酶購自TaKaRa 公司；膠回收試劑盒購自MAGEN 公司。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank 中登錄的A 型流感病毒的序列設(shè)計M 基因檢測引物序列為：5'-CAAGACCAATCCTGTCACCTC-3'/5'-AAGACGAT CAAGAATCCACAA-3'；并設(shè)計擴(kuò)增流感病毒8 個節(jié)段的8 對引物，其中HA 節(jié)段的引物序列為：5'-AGCAAAAGCAGGGG-3'/5'-AGTAGAAACAAGGG TGTTTT-3'；NA 節(jié)段的引物序列為：5'-AGCAAAAG CAGGAGT-3'/5'-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3'；其他節(jié)段的擴(kuò)增引物參考文獻(xiàn)[7]的序列；反轉(zhuǎn)錄引物為Unil-2：5'-AGCAAAAGCAGG-3'，引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.4 病毒分離與鑒定

1.4.1 雞胚接種 將處理的拭子樣品上清液經(jīng)尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚(0.1 mL)，于37 ℃孵化48 h，收集24 h 后死亡和存活的雞胚尿囊液，測定其對雞紅細(xì)胞的凝集活性，有血凝性的陽性樣品通過雞胚接種有限稀釋法純化。對于血凝陰性尿囊液則在SPF 雞胚中盲傳3 代，如果仍然無血凝性則判為病毒分離陰性。

1.4.2 病毒核酸的提取和RT-PCR 鑒定 采用TRIzol 法提取病毒總RNA，以Unil-2 為引物，通過M-MLV 反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，并以其為模板，采用A型流感病毒的M 基因檢測引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃1 min、54 ℃45 s、72 ℃1 min，30 個循環(huán)；72 ℃10 min，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 全基因序列測定及分析 以制備的cDNA 為模板，采用A 型流感病毒各節(jié)段特異性PCR 引物擴(kuò)增8 個基因片段。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)膠回收后克隆至pMD18-T 載體，提取重組質(zhì)粒，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.6 病毒遺傳進(jìn)化與分子特征分析 采用DNAStar軟件對所測得的序列進(jìn)行拼接，并與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對，同時通過MEGA5.0 軟件對HA 和NA 基因進(jìn)行進(jìn)化分析、繪制進(jìn)化樹，并對HA 和NA 推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行流感病毒分子特征分析。

1.7 小鼠致病性試驗 將6 周齡雌雄BALB/c 小鼠分為實驗組和空白對照組，每組10 只；實驗組以106EID50/只的劑量經(jīng)鼻腔接種病毒，接種后每天觀察小鼠的臨床癥狀、采食和飲水情況，定期稱重并記錄采食量，連續(xù)觀察14 d，感染后第3 d 隨機(jī)迫殺3 只小鼠，無菌采集肝臟、脾臟、肺臟和腦進(jìn)行臟器中病毒滴度測定。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離 將115 份鼻拭子接種SPF 雞胚，盲傳至第3 代，將通過血凝試驗判為陽性的尿囊液，采用A 型流感的M 基因檢測引物進(jìn)行RT-PCR 檢測，結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到約750 bp 的目的片段(圖1A)，分離得到一株流感病毒。

2.2 分離株各節(jié)段的RT-PCR擴(kuò)增 以提取病毒總RNA 反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA 為模板，采用A 型流感病毒各節(jié)段特異性PCR 引物分別進(jìn)行各節(jié)段的RT-PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增的各片段大小均與預(yù)期相符(圖1B)。對其全基因序列進(jìn)行測定分析，結(jié)果表明該分離株為H1N1 亞型SIV，命名為A/Swine/Guangdong/L2/2013(H1N1)。

圖1 SIV M 基因的RT-PCR 檢測(A)及8 個節(jié)段擴(kuò)增(B)結(jié)果Fig.1 Detection of the M gene(A)and eight segments(B)of SIV by RT-PCR

2.3 核苷酸同源性分析 通過NCBI 中的Blast 程序?qū)υ摲蛛x株的全基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，PB2、PB1、HA、NA 和NS 5 個節(jié)段與A/swine/Shanghai/2/2005(H1N1)同源性最高；而PA、NP 和M 基因片段與A/swine/Guangdong/33/2006(H1N1)同源性最高(表1)。

2.4 病毒分子特征分析 HA 基因序列測定結(jié)果顯示，SIV A/Swine/Guangdong/L2/2013(H1N1)HA 基因編碼區(qū)由1 698 個核苷酸組成，編碼565 個氨基酸，裂解位點氨基酸序列為PSIQSR↓GL，與高致病性AIV 含有多個堿性氨基酸裂解位點相比，具有典型的低致病性流感病毒特征。與參考株A/swine/Shanghai/2/2005 相比，該分離株HA 蛋白共有5 個氨基酸發(fā)生了突變，其中4 個位于HA1 蛋白中，分別為R62G、E144V、S278Y、S326N；1 個突變位點位于HA2 蛋白中，為S540P；另外該分離株在522 位發(fā)生了一個氨基酸的缺失(表2)。

NA 基因編碼區(qū)由1 410 個氨基酸組成，編碼470 個氨基酸。與參考株相比，有6 個氨基酸位點發(fā)生了突變，分別為L23M、I195L、R222K、D307N、K347N 和M415L，而糖基化位點未發(fā)生變化。

表2 A/Swine/Guangdong/L2/2013 與參考株HA 氨基酸比較Table 2 Amino acid of HA proteins of A/Swine/Guangdong/L2/2013 and the reference viruses

2.5 病毒遺傳進(jìn)化分析 對該分離株的HA 基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示：A/Swine/Guangdong/L2/2013(H1N1)的8 個節(jié)段均位于經(jīng)典SIV 亞群中，未同其他亞群進(jìn)行重組，并與2005 年前后的經(jīng)典SIV 株A/swine/Shanghai/2/2005 在同一分支，進(jìn)化關(guān)系最近(圖2)。同時對NA 的基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，其結(jié)果與HA 的進(jìn)化分析結(jié)果相符(圖3)。

2.6 小鼠的致病性試驗 小鼠接種病毒后出現(xiàn)的臨床癥狀主要表現(xiàn)為食欲下降，行動遲緩。實驗組小鼠的體質(zhì)量在1 d～5 d 緩慢下降，并在6 d 以后體質(zhì)量開始逐漸恢復(fù)，表明A/Swine/Guangdong/L2/2013(H1N1)分離株不需要經(jīng)過適應(yīng)，可以直接感染小鼠并具有一定的致病性，導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量降低(圖4A)，但所有感染小鼠并未發(fā)生死亡。組織病理學(xué)觀察表明，感染小鼠第3 d 表現(xiàn)為以肺臟充血和滲出性炎癥為特征的肺炎癥狀(圖4B)。小鼠腦、肝、腎和脾中均未分離到病毒。迫殺的3 只小鼠肺臟的病毒滴度分別為104.25EID50、104.5EID50和103.75EID50，表明病毒僅能夠在呼吸道復(fù)制。

圖2 分離株HA 基因進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on HA gene of the isolate strains

圖3 分離株NA 基因進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on NA gene of the isolate strains

圖4 病毒接種后小鼠體質(zhì)量變化(A)和組織病理學(xué)變化HE(400×)(B)Fig.4 Weight changes of mice after inoculate with A/Swine/Guangdong/L2/2013(A)and the pathological(HE)in tissues of lungs at days 3 after inoculate(B)

3 討論

我國于1991 年首次分離到SIV，自1998 年～2005 年，美洲來源的經(jīng)典H1N1、歐洲來源的類禽H1N1 和三源重配H1N1 流感病毒在我國南部地區(qū)的豬群中共同流行，同時還有人的季節(jié)性流感病毒。但從2005 年之后，歐亞類禽SIV 的流行在豬群中逐漸占主導(dǎo)地位，并且于2009 年從豬群中分離到甲型pdm09 病毒株[8-10]。

本研究從豬場采集的鼻拭子樣品中分離到一株流感病毒，進(jìn)行全基因序列分析，鑒定為H1N1 亞型SIV；同源性分析結(jié)果顯示：該分離株的PB2、PB1、HA、NA 和NS 5 個節(jié)段與A/swine/Shanghai/2/2005(H1N1)具有較高的同源性，而PA、NP 和M 3 個基因片段與A/swine/Guangdong/33/2006(H1N1)具有較高的同源性，后兩者屬于經(jīng)典SIV；對該分離株的氨基酸序列分析顯示，與參考株A/swine/Shanghai/2/2005 相比，該分離株HA 蛋白共有5 個氨基酸發(fā)生了突變，另外該分離株還在522 位發(fā)生了一個氨基酸的缺失，缺失位點位于跨膜區(qū)附近，對病毒HA 蛋白的功能影響不大，并且該分離株潛在的糖基化位點與參考株一致。遺傳進(jìn)化分析表明，該分離株與A/swine/Shanghai/2/2005(H1N1)的進(jìn)化關(guān)系最近，均位于經(jīng)典SIV 亞群，未發(fā)生重組，表明經(jīng)典SIV 仍然在我國豬群中流行；小鼠致病性試驗表明，該分離株可以直接感染小鼠，引起小鼠體質(zhì)量降低，雖然未引起明顯的臨床癥狀，但可以在小鼠肺臟內(nèi)增殖，導(dǎo)致肺臟出現(xiàn)病理變化。表明該分離株對小鼠呈低致病性，尚未獲得感染其他組織器官的能力。

豬被認(rèn)為是AIV 對人的適應(yīng)過程的中間宿主或是作為遺傳學(xué)上重配病毒的混合器[11]。因此及時掌握我國豬群中SIV 流行株的變異情況，為豬群中流感病毒的檢測及其科學(xué)防制提供依據(jù)，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究從豬群中分離到的H1N1亞型SIV 是否會在豬群中持續(xù)進(jìn)化，然后發(fā)生重組，并由豬傳染給人，以及其是否會對豬造成更嚴(yán)重的致病性有待于進(jìn)一步監(jiān)測和研究。

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