牛病毒性腹瀉病毒E0基因重組慢病毒載體構(gòu)建和鑒定

劉 軍，尹惠瓊，顏仁和，王 蕊，李紅衛(wèi)，章金剛*，魏建忠

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850；3.南方醫(yī)科大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510515)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)為黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員，為+ssRNA 有囊膜病毒。自O(shè)lafson 等1946年首次報(bào)道該病毒[1]以來，該病毒已呈世界性分布，主要基因型為1a 和1b。動物感染BVDV 后主要表現(xiàn)為體溫升高，采食量下降，反芻次數(shù)減少或停止，口腔和鼻腔粘液分泌增多，白細(xì)胞數(shù)下降，糞便呈水樣，母畜表現(xiàn)為產(chǎn)奶量下降，懷弱胎、畸形胎或死胎，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

BVDV 基因組僅有一個(gè)開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼一個(gè)約4 000 個(gè)氨基酸殘基的前體蛋白，兩側(cè)為非翻譯區(qū)(Untranslated region，UTR)。ORF 編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白(Core、E0、E1 和E2 蛋白)和7 種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B)。

利用基因工程方法重組病毒主要保護(hù)性抗原用于疾病的預(yù)防已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，E0 蛋白在各病毒株之間相對保守，因此本研究構(gòu)建攜帶BVDV E0基因的重組慢病毒載體并包裝慢病毒，為BVDV E0蛋白哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)及其免疫原性研究，基因工程疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 慢病毒表達(dá)系統(tǒng)(pZJ-CMVeGFP、pAX2、pVsvg)由南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院李紅衛(wèi)教授饋贈；含BVDV E0 序列的pGSI-E0 重組質(zhì)粒由中美泰和生物技術(shù)公司合成；HEK-293T 細(xì)胞為本室保存；E.coil 感受態(tài)DH5α 購自TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶及T4 DNA 連接酶均購自NEB 公司；DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Axygen 公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；PEI、HBS轉(zhuǎn)染試劑由本實(shí)驗(yàn)室配置[3]；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(IgG-HRP)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BVDV 多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成 P1 為構(gòu)建載體pZJ-CMVeGFP-IgK-E0 時(shí)引入IgK 信號肽的上游引物，P2 為引入his 標(biāo)簽的下游引物；P3 為構(gòu)建不含IgK 信號肽的對照載體pZJ-CMV-eGFP-E0 時(shí)的上游引物，下游引物同P2；PCR 驗(yàn)證構(gòu)建的慢病毒載體中目的片段插入方向是否正確時(shí)上游引物為P4，下游引物為P2(表1)。引物由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成。

1.3 重組慢病毒載體p ZJ-CMV-eGFP-IgK-E0及pZJ-CMV-eGFP-E0的構(gòu)建 分別利用引物P1/P2和P3/P2 對pGSI-E0 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到含有IgK信號肽的E0 基因片段和不含IgK 信號肽的E0 基因片段，對上述兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物及慢病毒載體pZJ-CMVeGFP 進(jìn)行NheⅠ酶切，膠回收PCR 目的片段及線性化后去磷酸化的pZJ-CMV-eGFP 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒。PCR 鑒定陽性重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測序驗(yàn)證，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pZJ-CMV-eGFPIgK-E0 和pZJ-CMV-eGFP-E0。

表1 引物序列及引入序列和/或酶切位點(diǎn)Table 1 Primer sequences and the sequence and/or restriction enzyme sites that lead in

1.4 重組慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前24 h 將5×106個(gè)/mL 的HEK-293T 細(xì)胞鋪10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 ℃5 % CO2培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80 %時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在1 mL PEI 轉(zhuǎn)染試劑中加入pZJ-CMV-eGFP-IgK-E0 5 μg，pAX2 載體3.75 μg，pVsvg 載體1.25 μg，將其加入10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，同樣方法對pZJ-CMV-eGFP-E0 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，觀察熒光并收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)濃縮柱濃縮后分裝于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 慢病毒滴度測定 將生長狀態(tài)良好的HEK-293T 細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1×105個(gè)/mL，加入96孔板，100 μL/孔，每株病毒準(zhǔn)備10 個(gè)孔。用培養(yǎng)基將濃縮的病毒液按10 倍倍比稀釋，取100 μL 稀釋后的病毒液分別加入到相應(yīng)孔中，48 h 后在熒光顯微鏡下觀察各孔中GFP 的熒光表達(dá)情況，并對最后兩個(gè)有熒光的熒光細(xì)胞克隆數(shù)計(jì)數(shù)。假設(shè)為X 和Y，則滴度(TU/mL)=[(X+Y×10)×1 000]/2 即為X 孔的病毒液的含量[3]。

1.6 Western blot鑒定 收集轉(zhuǎn)染后HEK-293T 細(xì)胞上清液，以正常HEK-293T 細(xì)胞的上清液作為陰性對照，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離蛋白后，將其電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，以抗BVDV 兔多克隆抗體(1∶2 000)為一抗，山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)為二抗，DAB顯色觀察結(jié)果，進(jìn)行western blot 鑒定。

2 結(jié)果

2.1 兩種慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 采用P3/P4引物對構(gòu)建的慢病毒重組質(zhì)粒pZJ-CMV-eGFP-IgKE0 及pZJ-CMV-eGFP-E0 進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果表明目的片段插入方向正確(圖1)。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明插入序列未發(fā)生突變。對慢病毒重組質(zhì)粒進(jìn)行NheⅠ酶切，分別得到與預(yù)期相符片段(726 bp 和705 bp)(圖略)。

圖1 pZJ-CMV-eGFP-IgK-E0 和pZJ-CMV-eGFP-E0 的PCR 鑒定Fig.1 PCR identification of pZJ-CMV-eGFP-IgK-E0 and pZJ-CMV-eGFP-E0 plasmid

2.2 兩種慢病毒包裝及滴度測定 按PEI 轉(zhuǎn)染操作，將兩種慢病毒重組質(zhì)粒分別與病毒包裝輔助重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于HEK-293T 細(xì)胞，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24 h即可以觀察的熒光，48 h 后熒光增強(qiáng)(圖2)。pZJCMV-eGFP-IgK-E0 和pZJ-CMV-eGFP-E0 包裝的慢病毒滴度分別為1×108TU/mL 和1×109TU/mL。

圖2 兩種慢病毒載體轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞后不同時(shí)間段熒光情況Fig.2 Fluorescence identification of packaged the recombinant lentiviral viruses in HEK-293T cells

2.3 Western blot鑒定 將兩種慢病毒重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞后，對收集的上清液進(jìn)行western blot 檢測，結(jié)果顯示兩個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞樣品均在33 ku～48 ku 出現(xiàn)特異性條帶，對照樣品無條帶，表明轉(zhuǎn)染操作中E0 蛋白得到表達(dá)，本研究包裝了含BVDV E0 基因的慢病毒。

圖3 PEI 方法轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞后western blot 鑒定結(jié)果Fig.3 Western blot analysis of the BVDV E0 gene expression in the transfected HEK-293T cells

3 討論

目前，發(fā)達(dá)國家主要通過免疫接種和撲殺持續(xù)感染動物來防控反芻動物感染BVDV[4]。用于免疫接種的疫苗主要有滅活苗和弱毒苗兩種，前者的安全性高，但其存在免疫后刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的能力弱，抗體維持時(shí)間短，與弱毒疫苗相比制造成本高等缺點(diǎn)。弱毒疫苗免疫后有效保護(hù)期長，但存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，目前僅批準(zhǔn)用于疫區(qū)，并且不宜用于懷孕母畜的免疫。

研究表明E0 和E2 均可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，其中以E2 的免疫原性最強(qiáng)，是介導(dǎo)宿主細(xì)胞識別和吸附的主要部位，由于其具有較高的突變率，是導(dǎo)致疫苗失效和牛持續(xù)性感染的主要原因，其中和逃逸頻率為10-2.47，這阻礙了E2 蛋白在亞單位疫苗方面的研究[5]；E0 蛋白由227 個(gè)氨基酸殘基組成，有8 個(gè)糖基化位點(diǎn)，保守性較高，其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體具有中和CSFV 和HCV 的能力[6-7]。Langedijk 等確定了CSFV E0 蛋白的抗原表位，該表位位于C 端aa191～aa227 處[8]。由于E0 蛋白在黃病毒科中比較保守，為BVDV 外膜糖蛋白，其在病毒本身和宿主細(xì)胞活性酶以及信號肽的作用下，從前期蛋白剪切并分泌到病毒外[9]。IgK 信號肽能協(xié)助靶蛋白進(jìn)行高效分泌，已經(jīng)在哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)中得到廣泛應(yīng)用。因此，本研究以BVDV E0基因構(gòu)建了重組慢病毒載體，并表達(dá)了E0 蛋白。

慢病毒載體是一種有效的基因轉(zhuǎn)移載體，它能夠在哺乳動物細(xì)胞中高效的轉(zhuǎn)移、整合和表達(dá)外源基因[10]。它的主要優(yōu)點(diǎn)在于能感染靜止期和分裂期細(xì)胞、表達(dá)時(shí)間長、不引起宿主的免疫反應(yīng)等。由哺乳動物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)。

本研究構(gòu)建了攜帶BVDV E0 基因的重組慢病毒載體并包裝慢病毒，為E0 蛋白在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)以及基因工程亞單位疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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