張富婷，常德輝，張　斌，李君紅，桑春艷，王養(yǎng)民，惠　玲

·論著·

高原環(huán)境下大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后急性腎損傷的研究

張富婷，常德輝，張斌，李君紅，桑春艷，王養(yǎng)民，惠玲

[摘要]目的探討大鼠在亞高原環(huán)境及高原環(huán)境下力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間腎損傷程度的變化，以及對(duì)急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)各指標(biāo)進(jìn)行比較，初步評(píng)價(jià)不同指標(biāo)檢測(cè)AKI的靈敏度與可靠性。方法72只大鼠隨機(jī)分為亞高原組和高原組，每組36只，再將兩組大鼠分別隨機(jī)分為6個(gè)亞組，每組6只，各組取樣時(shí)間不同。通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行負(fù)重游泳至力竭，記錄游泳時(shí)間，檢測(cè)力竭后不同時(shí)間血清中肌酐、尿素氮以及中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)紙質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatnase associated lipocalin, NGAL)的含量。結(jié)果高原組力竭游泳時(shí)間明顯比亞高原組短(P<0.05)；亞高原組血清肌酐及尿素氮在力竭后12 h時(shí)升高(P<0.01)，血清肌酐48 h時(shí)依然維持高濃度(P<0.01)，而尿素氮在24 h時(shí)恢復(fù)到對(duì)照組水平，高原組血清肌酐及尿素氮在力竭運(yùn)動(dòng)后即刻升高(P<0.01)，6 h后恢復(fù)到對(duì)照組水平，血清肌酐48 h后又顯著升高(P<0.05)，血清尿素氮12 h時(shí)又顯著升高(P<0.05)，48 h時(shí)恢復(fù)到對(duì)照組水平。亞高原及高原組血清NGAL在力竭后12 h時(shí)升高(P<0.05，P<0.01)，在24 h、48 h持續(xù)升高。結(jié)論高原環(huán)境可使大鼠運(yùn)動(dòng)能力降低，血清中肌酐、尿素氮以及NGAL都可表征AKI，但NGAL靈敏度高、可靠性強(qiáng)，具有極高的穩(wěn)定性。

[關(guān)鍵詞]急性腎損傷；高原；力竭運(yùn)動(dòng)；血清肌酐；血清尿素氮；中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)紙質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)；大鼠

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.09.003

腎臟作為機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要器官之一，在人類(lèi)對(duì)高原的適應(yīng)過(guò)程中扮演著極其重要的角色[1]。在高原缺氧、低壓環(huán)境下，機(jī)體的有效循環(huán)血量減少，腎臟血流量也相應(yīng)減少，進(jìn)而引起腎臟及機(jī)體內(nèi)環(huán)境一系列生理、病理改變，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致急性腎損傷(acute kidney injury， AKI)[2]。目前針對(duì)高原缺氧、低壓環(huán)境引起的AKI尚無(wú)有效的早期診斷措施及防治預(yù)案，大部分學(xué)者研究方向重點(diǎn)集中在高原腦水腫、肺水腫方面，對(duì)高原環(huán)境下AKI防治重要性認(rèn)識(shí)不足。本研究通過(guò)檢測(cè)高原環(huán)境下AKI動(dòng)物模型中血清生化指標(biāo)，重點(diǎn)篩查中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)紙質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatnase associated lipocalin, NGAL)的含量。以期其成果可以用于內(nèi)地首次進(jìn)入高原人群和高原常駐人群的早期預(yù)警診斷。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用2月齡SPF級(jí)Wistar雄性健康大鼠72只，體重(200±10)g。由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SYXK(軍) 2012-0020，常規(guī)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑及儀器NGAL酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海豐翔生物科技有限公司，貝克曼LX20全自動(dòng)生化檢測(cè)儀為美國(guó)BeckMan公司產(chǎn)品，F(xiàn)LYDWC50-IIA型低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(中航工業(yè)貴州雷航空軍械有限責(zé)任公司)。

1.3動(dòng)物分組模型制備將72只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為亞高原和高原兩組，每組各36只。再將兩組大鼠分別隨機(jī)分為6個(gè)亞組，每組6只。分別為兩種海拔高度的對(duì)照組、力竭后0、6、12、24、48 h亞組。亞高原組在蘭州市區(qū)海拔高度1520 m進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組不進(jìn)行任何訓(xùn)練，其余5組進(jìn)行負(fù)重游泳訓(xùn)練。高原組大鼠在負(fù)重游泳前均在亞高原環(huán)境下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)以2 m/s的上升速度模擬升至海拔高度4500 m，在低壓氧艙中模擬高原環(huán)境進(jìn)行負(fù)重游泳，對(duì)照組不進(jìn)行任何訓(xùn)練，其余5組進(jìn)行負(fù)重游泳訓(xùn)練。大鼠游泳訓(xùn)練裝置均采用100 cm×50 cm×60 cm的玻璃泳槽，水深50 cm，水溫(28±2)℃。除對(duì)照組外，所有亞高原與高原組大鼠，均在負(fù)重游泳前適應(yīng)性游泳30 min。30 min之后負(fù)10%體重游泳，開(kāi)始計(jì)時(shí)，每次游泳至力竭。大鼠開(kāi)始游泳至力竭所用時(shí)間為大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間，力竭標(biāo)準(zhǔn)以大鼠下沉后10 s不露出水面為度。力竭后的大鼠按時(shí)間要求放置在各自的海拔高度飼養(yǎng)。

1.4取樣將各組大鼠用乙醚麻醉后，腹正中切開(kāi)，于下腔靜脈采血，收集靜脈血于黃頭管(分離膠)，3000 r/min離心20 min，取上清血清保存于-80℃冰箱中待測(cè)。

2結(jié)果

2.1力竭游泳時(shí)間亞高原組與高原組組內(nèi)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，組間比較差異具有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2血清肌酐亞高原組血清肌酐在力竭后12 h時(shí)升高(P<0.01)，至48 h時(shí)依然維持這種高濃度；高原組血清肌酐在力竭運(yùn)動(dòng)后即刻升高(P<0.01)，6 h后恢復(fù)到對(duì)照組水平，48 h后又顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3尿素氮亞高原組血清尿素氮在力竭后12 h時(shí)升高(P<0.01)，24 h時(shí)恢復(fù)到對(duì)照組水平；高原組血清尿素氮在力竭運(yùn)動(dòng)后即刻升高(P<0.01)，6 h后恢復(fù)到對(duì)照組水平，12 h時(shí)又顯著升高(P<0.05)，48 h時(shí)恢復(fù)到對(duì)照組水平，高原組與亞高原組同時(shí)間兩個(gè)亞組之間比較結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。

表1　各組大鼠力竭游泳時(shí)間

注：與亞高原組比較，aP<0.05

表2　亞高原組與高原組大鼠力竭后不同時(shí)間血清肌酐的變化±s，μmol/L)

注：與亞高原對(duì)照組比較，bP<0.01。與高原對(duì)照組、6 h組比較，dP<0.01；與高原對(duì)照組比較，aP<0.05，與高原12h、24h組比較，cP<0.05；與亞高原組同時(shí)間比較，fP<0.01。

表3　亞高原組與高原組大鼠力竭后不同時(shí)間血清尿素氮的變化±s，IU/L)

注：與亞高原對(duì)照組比較，bP<0.01；與亞高原12 h組相比，aP<0.05。與高原對(duì)照組比較，cP<0.05；與高原6 h及24 h組比較，eP<0.05；與高原對(duì)照組及48 h組比較，dP<0.01；與高原12 h組比較，fP<0.01

2.4血清NGAL亞高原組血清NGAL在力竭后12 h時(shí)升高(P<0.05)，24 h時(shí)保持在12 h時(shí)的水平，48 h時(shí)升高水平極顯著(P<0.01)。高原組血清NGAL在力竭運(yùn)動(dòng)后12 h升高(P<0.01)，24 h時(shí)達(dá)到最高值，48 h時(shí)有所降低(P<0.05)，但與對(duì)照組相比依然具有極顯著的差異(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4　亞高原組與高原組大鼠力竭后不同時(shí)間NGAL的變化±s，ng/L)

注：與亞高原對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與高原對(duì)照組比較，dP<0.01；與高原24 h組比較，cP<0.05，與亞高原組同時(shí)間比較，fP<0.01。

3討論

高原是指海拔3000 m以上，能激發(fā)機(jī)體發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)的環(huán)境及高度[3-4]。我國(guó)幅員遼闊，高原和山地占全國(guó)總面積的1/6，隨著高原旅游業(yè)發(fā)展和國(guó)家對(duì)高原軍事訓(xùn)練需求，平原人員進(jìn)入高原機(jī)會(huì)越來(lái)越多[5]。高原自然環(huán)境具有以下特點(diǎn)：空氣稀薄、寒冷、風(fēng)大等[6-7]。其中，空氣稀薄、大氣壓和氧分壓低是高原環(huán)境影響機(jī)體的主要因素，缺氧對(duì)于腎臟具有明顯的影響，同時(shí)高原病誘發(fā)或加重AKI的報(bào)道也不少見(jiàn)[8]。

腎臟作為機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要器官之一，對(duì)缺氧十分敏感。在高原缺氧、低壓環(huán)境下，機(jī)體循環(huán)血量減少，最終導(dǎo)致AKI[2，9-10]。AKI是指腎臟清除代謝廢物能力急劇下降，定義為機(jī)體在受到創(chuàng)傷或感染時(shí)血清肌酐在48 h內(nèi)大幅升高且腎臟在結(jié)構(gòu)或功能上發(fā)生改變[11-12]。針對(duì)高原缺氧、低壓環(huán)境引起的AKI目前尚無(wú)有效早期診斷措施及防治預(yù)案，目前大部分學(xué)者研究方向仍重點(diǎn)集中在高原腦水腫、肺水腫診治研究方面，對(duì)高原環(huán)境下AKI防治重要性認(rèn)識(shí)不足。

目前診斷AKI主要依賴(lài)于血清肌酐的大幅增加與少尿癥狀的產(chǎn)生[13]，最常用的標(biāo)志物為血清肌酐[14-17]，但都是腎損傷的結(jié)果而非腎損傷本身標(biāo)志物，具有滯后性。研究者通過(guò)腎臟對(duì)早期損傷壓力反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了幾種潛在的能夠指示AKI的生物標(biāo)志物。目前最具有應(yīng)用前景的AKI標(biāo)志物主要有NGAL、KIM-1、L-FABP及IL-184[18]。有文獻(xiàn)報(bào)道NGAL是AKI非常具有應(yīng)用前景的生物標(biāo)志物之一[19-20]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在AKI早期，NGAL基因表達(dá)大幅上調(diào)[21]。下游蛋白組學(xué)研究同樣證明，在AKI動(dòng)物模型中，NGAL蛋白同樣高強(qiáng)度誘導(dǎo)表達(dá)[22]。

本研究表明，大鼠進(jìn)入高原環(huán)境后運(yùn)動(dòng)能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于亞高原環(huán)境。同時(shí)大鼠在運(yùn)動(dòng)至力竭后，無(wú)論是比較傳統(tǒng)的AKI標(biāo)志物血清肌酐、尿素氮，還是新標(biāo)志物NGAL，都能夠表征AKI。在亞高原環(huán)境下，血清肌酐和尿素氮濃度隨時(shí)間有規(guī)律的變化，但是在高原環(huán)境下，這兩種標(biāo)志物表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性，因而不能夠很好的顯示AKI的發(fā)生及發(fā)展。相反，NGAL無(wú)論是在亞高原環(huán)境還是在高原環(huán)境下，都能夠準(zhǔn)確地表征AKI的進(jìn)程，且其濃度在AKI發(fā)生12 h后即可檢測(cè)到顯著升高，在24 h以及48 h后仍然保持高濃度。因此，相對(duì)血清肌酐和尿素氮來(lái)說(shuō)，NGAL在檢測(cè)AKI的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中具有較強(qiáng)可靠性及靈敏性。通過(guò)NGAL的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在亞高原還是高原環(huán)境下，大鼠在力竭12 h后可檢測(cè)到AKI的發(fā)生，但是在同一時(shí)間下進(jìn)行比較，高原組NGAL濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于亞高原組(P<0.01)，從而證明高原組AKI程度比亞高原組嚴(yán)重，這也表明高原環(huán)境確實(shí)能夠誘導(dǎo)AKI發(fā)生并促進(jìn)其發(fā)展。

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(收稿時(shí)間：2015-06-18修回時(shí)間：2015-07-15)

A Study on Acute kidney Injury after Exhausting Exercise under High Altitude Environment in Rats

ZHANG Fu-tinga, CHANG De-huib, ZHANG Binb, LI Jun-honga, SANG Chun-yana, WANG Yang-minb, HUI-Linga

(a. Medical Experiment CenterKey Lab of Stem Cells and Genetaceutical of Gansu Province, b. Department of Urinary Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate changes of acute kidney injury (AKI) after exhausting excise under high altitude and sub-high altitude environments for different times in rats, and to evaluate the sensitivity and reliability by different indexes detection for AKI after comparing AKI indexes. MethodsA total of 72 rats were randomly divided into high altitude group (group A,n=36) and sub-high altitude group (group B,n=36), and then each group was randomly divided into six subgroups (n=6 for each subgroup) by taking samples with different times. The rats underwent weight-bearing swimming test till exhaustion, and then the swimming time was recorded, and the values of serum creatinine, urea nitrogen and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) content in different times after exhaustion were detected. ResultsThe swimming time of group A was significantly shorter than that of group B (P<0.05). In group B, the values of serum creatinine and urea were significantly increased at 12 h after exhausting exercise (P<0.01); the concentration of serum creatinine kept high at 48 h after exhausting exercise (P<0.01), while serum urea value restored to the level of control group at 24 h after exhausting exercise. In group A, the values of serum creatinine and urea were increased immediately after exhausting exercise (P<0.01), and then the values returned to the level of control group at 6 h after exhausting exercise, while serum creatinine value was significantly increased at 48 h after exhausting exercise (P<0.05), and serum urea value was increased at 24 h after exhausting exercise (P<0.05), and then the value restored to the level of control group at 48 h after exhausting exercise. Values of serum NGAL were increased at 12 h after exhausting exercise in the two groups (P<0.05,P<0.01), and the values were still increasing at 24 h and 48 h after exhausting exercise. ConclusionThe motor abilities of rats can be decreased in high altitude environment. Serum creatinine, urea and NGAL can be markers of acute kidney injury, but NGAL shows better sensitivity, reliability and stability.

[Key words]Acute kidney injury； High altitude； Exhausting exercise； Serum creatinine； Serum urea nitrogen；Neutrophil gelatinase-associated lipocalin； Rats

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國(guó)圖書(shū)資料分類(lèi)號(hào)]R-322A

[文章編號(hào)]2095-140X(2015)09-0013-04

[通訊作者]惠玲，Email:zyhuil@hotmail.com

[基金項(xiàng)目]全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金面上項(xiàng)目(CLZ12JA10)；全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金面上項(xiàng)目(CLZ12JA08)
[作者單位]730050 蘭州，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心、甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(張富婷、李君紅、桑春艷、惠玲),泌尿外科(常德輝、張斌、王養(yǎng)民)