解士海，潘武輝，宗國(guó)勇，黃小雄

（廣東省惠州市皮膚病醫(yī)院，惠州 516001）

色素障礙性皮膚病一向是皮膚科一大難點(diǎn)，尤其是白癜風(fēng)，由于其發(fā)病確切機(jī)制仍然未被明確，涉及多重因素，臨床治療上尚無(wú)滿意藥物。近年來(lái)隨著對(duì)人皮膚著色機(jī)制的研究不斷深入，色素由黑素細(xì)胞向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程逐漸受到重視。我們前期研究發(fā)現(xiàn)龍膽草有促進(jìn)黑素合成的作用[1]，本研究中進(jìn)一步探討龍膽草對(duì)黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 龍膽草：取中藥龍膽草置于不銹鋼罐內(nèi)，加相當(dāng)于藥材量8 倍的蒸餾水浸泡1 h，煮沸40 min 后過(guò)濾。藥渣加6 倍量水后繼續(xù)煎煮，煮沸30 min 后過(guò)濾。合并兩次濾液，濃縮成每毫升相當(dāng)于原藥100 mg 的中藥藥液。

CFDA-SE（二乙酰羧基熒光素-琥珀酰亞胺酯），中性酶、胰酶、二甲基亞砜（DMSO）、疊氮鈉（PFA）以及四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）均購(gòu)自Sigma 公司，鼠源抗角蛋白單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz 公司，結(jié)合藻紅霜（PE） 的羊抗鼠IgG 購(gòu)自Boster Biotechology，小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；高通量多功能微板測(cè)試系統(tǒng)（德國(guó)BMG），圖像信號(hào)采集與分析系統(tǒng)（德國(guó)LEICA 公司），倒置顯微鏡，熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀，無(wú)菌工作臺(tái)等。

1.2 方法

1.2.1 取材來(lái)源 人表皮黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞均來(lái)源于12～18 歲正常中國(guó)男性常規(guī)包皮環(huán)切術(shù)后的包皮

1.2.2 MTT 實(shí)驗(yàn) 將黑素細(xì)胞及共培養(yǎng)細(xì)胞按1×104/孔接種于96 孔板，在37 ℃及5%CO2下孵育24 h，去上清液，每孔加入含一定藥物濃度的共培養(yǎng)培養(yǎng)基200 μL，龍膽草設(shè)6 個(gè)濃度（0，0.1，0.2，0.5，1，2 g/L），每一濃度設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組直接加共培養(yǎng)培養(yǎng)基200 μL，空白孔不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育72 h，每孔加入5 g/L 的MTT 溶液20 μL，在37 ℃及5%CO2下孵育4 h，棄上清液，每孔加DMSO150 μL，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)（參考波長(zhǎng)620 nm）下測(cè)量各孔吸光度值，細(xì)胞增殖率＝[（待篩物各濃度平均吸光度值－空白組平均吸光度值）/（對(duì)照組平均吸光度值－空白組平均吸光度值）]×100%。

1.2.3 黑素轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定實(shí)驗(yàn) 黑素轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定實(shí)驗(yàn)主要參考Minwalla 等[2]的方法。簡(jiǎn)述如下，黑素細(xì)胞先與CFDA-SE 孵育，然后與角質(zhì)形成細(xì)胞共同孵育7 d。共培養(yǎng)細(xì)胞中加入不同濃度（0.1，0.2，0.5 g/L）的龍膽草以及1.0 mmol/L 的煙酰胺，龍膽草與煙酰胺連續(xù)6 d 每12 h 加藥1 次，第7 天，用PBS 將貼壁細(xì)胞洗脫下來(lái)，用含有熱滅活胎牛血清及疊氮鈉（PFA）的PBS 洗細(xì)胞，在4 ℃下將細(xì)胞前固定于4%的多聚甲醛內(nèi)30 min，然后室溫下放入熒光激活細(xì)胞術(shù)（Fluorescence activating cell sorting，F(xiàn)ACS）穿透液中10 min，再在室溫下與基礎(chǔ)抗體共同孵育45 min，基礎(chǔ)抗體是鼠源抗角蛋白單克隆抗體，用于在FACS 中鑒別角質(zhì)形成細(xì)胞。用PFA 將細(xì)胞再洗3遍，然后與第二抗體[結(jié)合藻紅霜（PE）的羊抗鼠IgG]37 ℃下共同孵育30 min，用1%多聚甲醛后固定，最后放入檢測(cè)管在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)，CFDA-SE 和PE 可以同時(shí)被488 nm 氬離子激光激發(fā)，CFDA-SE熒光與PE 熒光可分別通過(guò)525 nm 以及575 nm 波長(zhǎng)帶通濾波器檢測(cè)，黑素細(xì)胞只有CFDA-SE 陽(yáng)性，角質(zhì)形成細(xì)胞PE 陽(yáng)性，共培養(yǎng)體系中角質(zhì)形成細(xì)胞因?yàn)楹泻谒丶?xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)來(lái)的黑素小體同時(shí)具有CFDA-SE 和PE 陽(yáng)性，空白對(duì)照是取不加任何實(shí)驗(yàn)物的共培養(yǎng)體系中含有轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)的CFDA-SE 的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)分析，然后分別檢測(cè)含各種濃度龍膽草以及1.0 mmol/L 的煙酰胺的共培養(yǎng)體系中角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)CFDA-SE 熒光的改變，煙酰胺已被證實(shí)有抑制黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，本實(shí)驗(yàn)中作為另一個(gè)對(duì)照。每次測(cè)試都選取10 000 個(gè)樣本，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Coulter SystemⅡ分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩因素方差分析檢驗(yàn)，通過(guò)方差得出P 值，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍膽草對(duì)細(xì)胞增殖的影響 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示龍膽草濃度在（0.1～0.5 g/L）對(duì)共培養(yǎng)體系細(xì)胞增殖無(wú)影響，見(jiàn)表1，試驗(yàn)中每一濃度都重復(fù)試驗(yàn)6次，所有濃度實(shí)驗(yàn)組均與不加藥物對(duì)照組對(duì)比進(jìn)行方差分析，得出P 值。

2.2 龍膽草對(duì)共培養(yǎng)體系中黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了轉(zhuǎn)運(yùn)到角質(zhì)形成細(xì)胞的熒光色素的含量，以此評(píng)估龍膽草是否影響黑素的轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)果見(jiàn)表2，共培養(yǎng)體系中，1.0 mmol/L 煙酰胺對(duì)與黑素轉(zhuǎn)運(yùn)有明顯的抑制作用，證明本研究體系的可靠性，不同濃度的龍膽草可以劑量依賴地促進(jìn)黑素的轉(zhuǎn)運(yùn)。

表1 龍膽草對(duì)共培養(yǎng)體系細(xì)胞增殖的影響 (n=6)

表2 龍膽草對(duì)黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

3 討論

人類(lèi)皮膚著色涉及黑素在黑素細(xì)胞內(nèi)合成、黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)以及黑素顆粒在角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)分布三大過(guò)程。一直以來(lái)，對(duì)于黑素合成研究比較多[3]。近年來(lái)，由于免疫熒光技術(shù)以及流式細(xì)胞儀技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)于黑素轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的研究取得一定進(jìn)展。利用人表皮黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系，羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFDA-SE）熒光染色，通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察黑素的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[4]?；铙w染料CFDA-SE 是一種非極性分子，可自由穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)被酯酶轉(zhuǎn)化成帶負(fù)電荷的CFDA-SE，此時(shí)的CFDA-SE 才具有熒光性并可以自發(fā)不可逆的通過(guò)可利用的胺偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上，一些低轉(zhuǎn)化率的蛋白（如某些細(xì)胞骨架成分）可以使其長(zhǎng)期穩(wěn)定的儲(chǔ)留在細(xì)胞內(nèi)[5]，因此可以利用這一特性提前標(biāo)記黑素細(xì)胞內(nèi)包括黑素小體在內(nèi)的穩(wěn)定成分，然后與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)借助流式細(xì)胞儀測(cè)定黑素小體由黑素細(xì)胞向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。1.0 mmol/L 的煙酰胺對(duì)共培養(yǎng)體系中黑素細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞增殖無(wú)影響，已經(jīng)證明對(duì)于黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)有抑制作用，因此本研究中作為對(duì)照藥物。

龍膽草出現(xiàn)在許多治療白癜風(fēng)的傳統(tǒng)中藥方劑中，我們通過(guò)前期研究研發(fā)現(xiàn)其對(duì)于黑素合成有一定促進(jìn)作用，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)龍膽草對(duì)于黑素轉(zhuǎn)運(yùn)同樣具有促進(jìn)作用，龍膽草可以同時(shí)促進(jìn)黑素的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，是未來(lái)開(kāi)發(fā)治療白癜風(fēng)的理想藥物。

[1] 黃壯峰，解士海.龍膽草在人表皮黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系中對(duì)酪氨酸酶活性及黑素合成的影響[J].皮膚性病診療學(xué)雜志，2011，18（4）：258-259.

[2] Minwalla L, Zhao Y, Cornelius J, et al. Inhibition of melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes by lectins and neoglycoproteins in an in vitro model system[J]. Pigment Cell Res,2001,14:185-194.

[3] 劉棟，朱文元. 積雪草甙對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用及對(duì)Cloudman S91 黑素瘤細(xì)胞黑素合成的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2004,3（1）：7-10.

[4] 解士海，陳志強(qiáng)，馬鵬程,等.人表皮黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體外模型中黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的觀察[J].臨床皮膚科雜志，2006,35（5）:286-288.

[5] Lyons AB. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution[J]. J Immunol Methods,2000,243:147-154.