余 涵 ，陳 麗，馬 猛，周玉波，王林杰，羅亞楠，朱曉琴，雷水生

癲癇(Epilepsy)是一種常見的以腦部神經元同步化異常放電所致的以中樞神經系統(tǒng)功能失常為特征的慢性臨床綜合征，其中約有30%～40%的癲癇為藥物難以控制的頑固性癲癇［1］。IL-1β、IL-6 和TNF-α 是具有廣泛生物學作用的細胞因子，參與細胞免疫調節(jié)作用。大量臨床和基礎研究顯示，細胞因子參與慢性癲癇的發(fā)病過程［2］。AQP4 是腦內與水的通透性有關的最重要的轉運蛋白，并與癲癇發(fā)病的電生理學機制及難治性癲癇腦損傷機制等密切相關［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)AQP4 缺失可以明顯減輕脂多糖(LPS)誘導的促炎反應［4］，提示AQP4 表達可能參與炎性因子的調控作用，然而在癲癇發(fā)作過程中AQP4 與炎性因子的關系不明確，本課題組前期研究已證實乙酰唑胺能通過抑制AQP4 的表達從而抑制癲癇發(fā)作(文章已錄用)，因此本研究采用AQP4 抑制劑乙酰唑胺抑制AQP4 的表達，旨在探討在慢性癲癇發(fā)作過程中AQP4 與炎性因子間的調控關系以及乙酰唑胺抑制癲癇發(fā)作的其它可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及動物 乙酰唑胺購自Sigma公司;戊四氮購自Sigma 公司;Trizol 購自Invitrogen公司;引物合成由上海Invitrogen 生物工程公司完成;RT-qPCR 試劑盒購自Takara 公司;ELISA 試劑盒購自深圳欣博盛公司;NF-κB p65 購于Abcam 公司;二抗購自北京中杉金橋公司;ECL 發(fā)光液購自凱基生物技術公司。

1.2 實驗分組 選用成年健康(Sprague-Dawley，SD)大鼠(廣州醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，體重(240 ±30)g，雌雄不拘，實驗室常規(guī)條件下喂養(yǎng)。按實驗要求隨機分為3 組:對照組、致癇組、乙酰唑胺干預組。

1.3 慢性動物模型制備及評定標準 體重為(240 ±30)g 成年SD 大鼠50 只，(1)對照組(n=10)腹腔注射等量生理鹽水;(2)致癇組(n=20)腹腔注射戊四氮亞劑量35 mg/kg;(3)乙酰唑胺干預組(n=20)腹腔注射乙酰唑胺35 mg/kg，30 min 后再注射上述劑量PTZ，連續(xù)注射28 d。每次注射均在上午8:00～10:00 進行。每次注射后1 h 內觀察并記錄癇性發(fā)作潛伏期和發(fā)作強度等行為學變化。癲癇發(fā)作強度按Racine 癲癇發(fā)作分級標準評價［5］:0 級:無抽搐反應;Ⅰ級:口周及面部肌肉抽搐;Ⅱ級:節(jié)律性點頭樣發(fā)作或甩尾;Ⅲ級:頭部抽搐及前肢陣攣發(fā)作;Ⅳ級:直立，全身強直陣攣發(fā)作;Ⅴ級:驚厥致摔倒，全身強直陣攣發(fā)作伴失張力發(fā)作。凡至少連續(xù)出現(xiàn)5 d Ⅱ級以上的發(fā)作即認為慢性點燃成功［6］。

1.4 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達 稱取50 mg 海馬，溶于500 μlTrizol，逆轉錄合成cDNA;β-actin 的引物序列:上游5'-GGAGATTACTGCCCGGCTCCTA-3’，下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’，擴增片段長度為150 bp。IL-1β 的引物序列:上游5'-CTGTACTCGTGGGATGATG-3’，下游5'-ACAGTGCATCATCGCTGTTC-3’，擴增片段長度為210 bp。IL-6的引物序列:上游5'-CAGTTGCCTTCTTGGGACT -3’，下游5'-TCTGACAGTGCATCATCGCT-3’，擴增片段長度為224 bp。TNF-α 的引物序列:上游5'-AGATGTGGAACTGGCAGAGG-3’，下游5'-GAGCCCATTTGGGAACTTCT -3’，擴增片段長度為181 bp。qPCR 反應條件為95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s，共40 個循環(huán);95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。實驗數(shù)據使用IL-1β、IL-6、TNF-α 和β-actin RNA 循環(huán)閾值(Ct)之差(△Ct)計算得到相關基因的表達情況。計算對比的樣本間基因表達的差異(△△Ct)，表達差異的倍數(shù)RQ 為2-△△Ct，以對照組的RQ 值為1，各組是相對于1 的變化倍數(shù)。

1.5 免疫蛋白印跡(Western blot)檢測NF-κB p65 蛋白表達 取50 mg 海馬組織加入蛋白裂解液，勻漿收集上清。蛋白定量后，以40 μg/孔上樣，經10% SDS-PAGE 垂直電泳后電轉移至PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入NF-κB p65兔抗大鼠單克隆抗體(1∶ 2000)和β-actin 兔抗大鼠單克隆抗體(1∶ 2000)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶ 5000)室溫孵育1 h，ECL顯色利用Gene Gnome 成像分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶。使用Image-J 軟件測定各條帶的灰度值，以β-actin作為內參標準化NF-κB p65 蛋白的表達水平。

1.6 ELISA 檢測海馬和血清內IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達 取50 mg 海馬組織加入蛋白裂解液，勻漿收集上清。IL-1β、IL-6、TNF-α 含量嚴格按照ELISA 試劑盒說明書的步驟進行操作，以空白調零，450 nm 波長下檢測光密度值，制作標準曲線，按照標準曲線算出各表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義，P ＜0.001為差別有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學觀察 戊四氮注射后，首先為I 級發(fā)作，表現(xiàn)為全身顫抖、豎毛、嘴和面部肌肉抽搐反應，隨著用藥時間的延長，癲癇發(fā)作程度也加重，從活動減少、咀嚼、節(jié)律性點頭(Ⅱ級)到頭頸上仰、前肢陣攣發(fā)作(Ⅲ級)甚至出現(xiàn)明顯出現(xiàn)直立豎尾、以尾拍擊地面、全身強直陣攣發(fā)作甚至直立并摔倒(Ⅳ、Ⅴ級)。對照組未見癲癇發(fā)作。

2.2 海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達 RT-qPCR 結果顯示腦組織IL-1β、IL-6、TNFα mRNA 的表達:致癇組均顯著高于對照組和乙酰唑胺干預組(P ＜0.001 或P ＜0.05);乙酰唑胺干預組IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達有所下降但仍高于對照組(P ＜0.05)(見表1)。

2.3 海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白的表達 ELISA 結果顯示腦組織IL-1β、IL-6 和TNF-α蛋白的表達變化:IL-1β、IL-6 和TNF-α 在對照組中也有表達，致癇組中的含量顯著高于對照組(P ＜0.001);癲癇模型大鼠用乙酰唑胺處理后IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白的含量低于致癇組(P ＜0.05)，但仍高于對照組(P ＜0.05)(見表2)。

2.4 Western blot 檢測各組NF-κB p65 蛋白表達情況 Western blot 結果顯示:NF-κB/p65 蛋白在各組表達相對灰度值比值分別為(0.2192 ±0.0254)、(0.4741 ±0.0206)、(0.3561 ±0.0229)。致癇組與對照組相比NF-κB p65 蛋白表達量顯著增加(P ＜0.001)，致癇組NF-κB p65 蛋白表達要高于乙酰唑胺干預組(P ＜0.05)，乙酰唑胺干預組與對照組相比明顯降低(P ＜0.05)(見圖1)。

表1 大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達()

表1 大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達()

致癇組、乙酰唑胺干預組與對照組比較* P ＜0.05，＊＊P ＜0.001;乙酰唑胺干預組與致癇組比較#P ＜0.05

表2 大鼠海馬組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 蛋白的含量()(pg/ml)

表2 大鼠海馬組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 蛋白的含量()(pg/ml)

致癇組、乙酰唑胺干預組與對照組比較* P ＜0.05，＊＊P ＜0.001;乙酰唑胺干預組與致癇組比較#P ＜0.05

圖1 Western blot 檢測NF-κB p65 蛋白在大鼠海馬組織中的表達

3 討論

目前大多數(shù)學者認為，神經免疫調節(jié)網絡失衡是癲癇發(fā)病的重要原因［7］。大量臨床和基礎研究也證實，炎性因子與炎癥反應參與了癲癇的發(fā)病過程［8，9］。本課題前期實驗研究發(fā)現(xiàn)大鼠側腦室注射IL-1β 出現(xiàn)中度癲癇發(fā)作［10］。Gomez 等［11］發(fā)現(xiàn)藥物長春西汀和卡馬西平抗癲癇作用可能與減少大鼠海馬內炎性因子IL-1β、TNF-α 表達有關。慢性癲癇反復發(fā)作致使腦內炎癥持續(xù)性存在，腦組織發(fā)生病理改變，特別是腦內對癲癇發(fā)作敏感區(qū)域如海馬等。

NF-κB 以二聚體的形式存在，是體內重要的信號調控蛋白。NF-κB 能通過與免疫球蛋白κ 輕鏈基因的增強子κB 序列特異性的結合，參與多種炎性因子基因的轉錄和調控，并與細胞因子、炎癥介質的產生和釋放有關［12］。p50/p65 異源二聚體是該家族成員中發(fā)揮主要作用的因子，廣泛存在于神經元中。Crespel［13］利用合并海馬硬化的顳葉癲癇患者術后病理切片進行免疫組化發(fā)現(xiàn)，膠質細胞和大腦錐體細胞NF-κB p65 過度表達，并推測癲癇形成過程可能是由NF-κB 介導的炎癥反應過程。研究表明NFκB 信號通路參與了神經元興奮和神經膠質疤痕的形成、神經元的調亡及突觸可塑性變化等，過度激活將引起機體的炎癥反應，誘發(fā)癲癇發(fā)作［14］。

AQP4 在正常腦組織中呈極性分布，主要表達在血管周圍的星形膠質細胞終末足突，而靠近神經元側的終末足突表達較少［15］，在腦脊液的形成與吸收、滲透壓調節(jié)、腦水腫形成等病理生理過程中發(fā)揮重要作用［16］。顳葉癲癇致海馬硬化的患者手術所取的海馬標本檢測發(fā)現(xiàn)AQP4 mRNA 和蛋白表達量明顯增加［17］。最近有研究顯示AQP4 缺失可以明顯減輕脂多糖(LPS)誘導的促炎反應，AQP4 敲除小鼠可降低炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達［18］。大量研究表明星形膠質細胞可通過釋放炎性因子，直接改變神經元的興奮性［19］，這些研究提示AQP4與炎性因子表達可能有密切聯(lián)系。

本課題組前期在戊四氮誘導慢性致癇大鼠中應用乙酰唑胺，發(fā)現(xiàn)能夠抑制AQP4 的表達，并且延長了慢性癲癇點燃潛伏期，具有抑制癲癇發(fā)作的效應。在本實驗中RT-qPCR 以及ELISA 結果顯示大鼠海馬組織以及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 在致癇組的表達均明顯高于對照組(P ＜0.001);Western blot 結果顯示海馬NF-κB p65 含量與對照組相比升高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。本研究中戊四氮誘導大鼠慢性癲癇發(fā)作后，海馬組織勻漿液中IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平均升高，表明免疫細胞處于活化狀態(tài)。本實驗中RT-qPCR 和ELISA 結果顯示乙酰唑胺干預組IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達量與致癇組相比降低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，但依然高于對照組(P ＜0.05)。同樣Western blot 結果顯示乙酰唑胺干預組AQP4 和NF-κB p65 的表達量與慢性致癇組相比也降低，但依然高于對照組(P ＜0.05)。我們觀察到用乙酰唑胺預處理后，海馬促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量以及NF-κB p65 也下降。表明AQP4 的選擇性抑制劑乙酰唑胺也能夠抑制NF-κB 信號傳導通路激活，使NF-κB p65 的活化程度下降，其下游所調控的IL-1β、TNF-α等炎癥基因的轉錄下降，相應因子合成減少，炎癥反應減輕，而在待發(fā)表的文章中我們已證實AQP4 選擇性抑制劑乙酰唑胺預處理后能夠明顯延長戊四氮致慢性癲癇大鼠發(fā)作潛伏期。因此乙酰唑胺可能通過減輕炎癥反應抑制癲癇發(fā)作。

結合前期研究，戊四氮致癇后AQP4 表達增加，而AQP4 與腦內水平衡維持密切相關。神經網絡間過多的水經星形膠質細胞上AQP4 通道及時的轉運到血管前區(qū)域，以維持神經網絡細胞間正常的間隙和滲透壓。癲癇發(fā)作后靠近神經元一側的星形膠質細胞突觸上AQP4 表達增加，而靠近血管前一側表達量減少，使得水在神經網絡間的轉運紊亂，導致星形膠質細胞水腫性損傷。AQP4 選擇性抑制劑能夠抑制AQP4 和炎性因子的表達，進而抑制癲癇發(fā)作。其機制可能與乙酰唑胺抑制AQP4 表達、改善星形膠質細胞水腫損傷、減輕炎性因子的表達有關。也有研究發(fā)現(xiàn)雙氯芬酸鈉能夠增強炎性因子及星形膠質細胞膜上AQP4 的表達［20］。Ito［21］等人研究發(fā)現(xiàn)經側腦室穿刺注射IL-1β 后能夠引起AQP4 的表達上調。既往研究表明炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 在癲癇發(fā)作后6 h 快速升高［22］，并且大量研究表明慢性炎性因子持續(xù)性表達可能參與了癲癇自發(fā)性發(fā)作過程［23］。我們推測癲癇發(fā)作后星形膠質細胞分泌炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α，引起神經退行性變，血腦屏障破壞甚至導致腦水腫，這些病理改變同時維持了炎性因子信號表達，使得癲癇腦內持續(xù)性炎癥刺激，導致神經元變性、興奮性增高以及血腦屏障破壞，最終導致癲癇反復發(fā)作。有研究證實星形膠質細胞對整個癲癇形成過程中維持炎性活化狀態(tài)有重要作用。

綜上所述，可能是在癲癇發(fā)作早期，炎性因子大量表達刺激星形膠質細胞膜上AQP4 表達增加，致使星形膠質細胞水腫性損傷激活NF-κB 等信號分子促進炎性因子的分泌，使癲癇狀態(tài)下慢性炎癥持續(xù)存在。然而本實驗沒有抑制炎性因子表達來研究炎性因子表達對AQP4 的調控作用。因此，需進一步研究AQP4 與炎癥因子在癲癇反復發(fā)作過程中的關系，為控制癲癇發(fā)作和預防復發(fā)提供新的思路。

［1］Kwan P，Brodie MJ.Early identification of refractory epilepsy［J］.N Engl J Med，2000，342(5):314-319.

［2］Vezzani A，Aronica E，Mazarati A，et al.Epilepsy and brain inflammation［J］.Exp Neurol，2013，244:11-21.

［3］Alvestad S，Hammer J，Hoddevik EH，et al.Mislocalization of AQP4 precedes chronic seizures in the kainate model of temporal lobe epilepsy［J］.Epilepsy Res，2013，105(1/2):30-41.

［4］Li L，Zhang H，Varrin-Doyer M，et al.Proinflammatory role of aquaporin-4 in autoimmune neuroinflammation［J］.FASEB J，2011，25(5):1556-1566.

［5］Mcnamara JO.Kindling:an animal model of complex partial epilepsy［J］.Ann Neurol，1984，16:72-76.

［6］Dhir A.Pentylenetetrazol (PTZ)kindling model of epilepsy［J］.Curr Protoc Neurosci，2012，9:9-37.

［7］Billiau AD，Wouters CH，Lagae LG.Epilepsy and the immune system:is there a link［J］.Eur J Paediatr Neurol，2005，9(1):29-42.

［8］Uludag IF，Duksal T，Tiftikcioglu BI，et al.IL-1beta，IL-6 and IL1Ra levels in temporal lobe epilepsy［J］.Seizure，2015，26:22-25.

［9］Shimada T，Takemiya T，Sugiura H，et al.Role of inflammatory mediators in the pathogenesis of epilepsy［J］.Mediators Inflamm，2014，2014:901-902.

［10］朱曉琴，雷水生，李正莉，等.IL-1β、IL-6 致癇對大鼠腦電的影響［J］.咸寧學院學報(醫(yī)學版)，2007，3:203-207.

［11］Gomez CD，Buijs RM，Sitges M.The anti-seizure drugs vinpocetine and carbamazepine，but not valproic acid，reduce inflammatory IL-1beta and TNF-alpha expression in rat hippocampus［J］.J Neurochem，2014，130(6):770-779.

［12］Pasparakis M.Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling:implications for inflammatory diseases［J］.Nat Rev Immunol，2009，9(11):778-788.

［13］Crespel A，Coubes P，Rousset MC，et al.Inflammatory reactions in human medial temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis［J］.Brain Res，2002，952(2):159-169.

［14］Das A，Wallace GT，Holmes C，et al.Hippocampal tissue of patients with refractory temporal lobe epilepsy is associated with astrocyte activation，inflammation，and altered expression of channels and receptors［J］.Neuroscience，2012，220:237-246.

［15］Binder DK，Papadopoulos MC，Haggie PM，et al.In vivo measurement of brain extracellular space diffusion by cortical surface photobleaching［J］.J Neurosci，2004，24(37):8049-8056.

［16］Medici V，F(xiàn)rassoni C，Tassi L，et al.Aquaporin 4 expression in control and epileptic human cerebral cortex［J］.Brain Res，2011，1367:330-339.

［17］Lee T S，Eid T，Mane S，et al.Aquaporin-4 is increased in the sclerotic hippocampus in human temporal lobe epilepsy［J］.Acta Neuropathol，2004，108(6):493-502.

［18］Ikeshima-Kataoka H，Abe Y，Abe T，et al.Immunological function of aquaporin-4 in stab-wounded mouse brain in concert with a pro-inflammatory cytokine inducer，osteopontin［J］.Mol Cell Neurosci，2013，56:65-75.

［19］Wetherington J，Serrano G，Dingledine R.Astrocytes in the epileptic brain［J］.Neuron，2008，58(2):168-178.

［20］Asai H，Kakita H，Aoyama M，et al.Diclofenac enhances proinflammatory cytokine-induced aquaporin-4 expression in cultured astrocyte［J］.Cell Mol Neurobiol，2013，33(3):393-400.

［21］Ito H，Yamamoto N，Arima H，et al.Interleukin-1beta induces the expression of aquaporin-4 through a nuclear factor-kappaB pathway in rat astrocytes［J］.J Neurochem，2006，99(1):107-118.

［22］肖 倩，趙永波.癲癇與炎性因子［J］.中國神經免疫學和神經病學雜志，2011，1:48-50.

［23］Vezzani A，Balosso S，Ravizza T.The role of cytokines in the pathophysiology of epilepsy［J］.Brain Behav Immun，2008，22(6):797-803.