石嘉懌 張檬達(dá) 鞠興榮

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210046)

稻谷是世界上最重要的谷物之一，也是中國(guó)的主要糧種［1］，年產(chǎn)量可達(dá) 1.8 億 t［2］。稻谷在儲(chǔ)藏期間，由于呼吸氧化作用和各種酶的作用，其品質(zhì)必然會(huì)隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生變化，甚至劣變［3］，Kaminski等［4］和 Michael等［5］利用分光光度法對(duì)谷物中的揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，表明稻谷的揮發(fā)性成分會(huì)隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生變化，但該分析方法并未對(duì)各個(gè)揮發(fā)性組分進(jìn)行鑒定。

頂空固相微萃取(SPME)具有操作簡(jiǎn)單、樣品制備時(shí)間短、精確性高、成本低及安全等特點(diǎn)，特別適合萃取含量微小的揮發(fā)、半揮發(fā)性物質(zhì)［6］。趙峰等［7］，吳繼紅等［8］分別采用此方法分析蘋果中的芳香成分，測(cè)得了含量較少的醇類和酯類物質(zhì)。近年來(lái)，利用頂空固相微萃取技術(shù)研究糧油中揮發(fā)性成分也引起了廣泛興趣和重視［9］:張玉榮等［10］采用SPME技術(shù)對(duì)不同儲(chǔ)藏時(shí)間弱(強(qiáng))筋小麥中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行提取、鑒定和分析;林家永等［11］采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同稻谷中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析。但這些分析方法僅僅只對(duì)SPME的萃取條件進(jìn)行單因素的研究，并沒(méi)有進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，因此本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化秈稻中揮發(fā)性成分的SPME萃取條件，并采用SPME－GC－MS對(duì)儲(chǔ)藏期間秈稻谷所產(chǎn)生的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，以期為確定秈稻谷在儲(chǔ)藏期間揮發(fā)性成分變化規(guī)律以及篩選特征標(biāo)識(shí)物提供科學(xué)、客觀的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

晚秈稻:2011年入庫(kù)，浙江省嘉興糧庫(kù)提供。

1.2 主要儀器

手動(dòng)SPME進(jìn)樣器:南京大滬公司;GC(7890A)－MS(5975C)分析儀:美國(guó)Agilent公司;萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS):美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 固相微萃取頭的老化

首次使用萃取頭時(shí)，插入GC－MS進(jìn)樣口老化，老化時(shí)間120 min，老化溫度250℃;萃取頭每次使用前老化30 min，樣品與樣品之間老化5 min。

1.3.2 萃取

將20 g試樣置于頂空萃取瓶中，以錫紙作隔墊，用橡膠塞封口，混合均勻樣品后置于恒溫水浴鍋中加熱平衡，一段時(shí)間后，將固相微萃取頭插入瓶中萃取樣品揮發(fā)性成分，完畢后立即將萃取頭插入GCMS進(jìn)樣口，在250℃不分流模式下解析。

1.3.3 GC－MS參數(shù)條件及分析

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱為HP－5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);升溫程序?yàn)?起始柱溫50℃，保持5 min，以12℃/min上升到125℃，保持3 min，然后以1℃/min上升到165℃，保持3 min后以14℃/min上升到230℃，保持2 min，運(yùn)行結(jié)束后冷卻2 min，溫度降為50℃。載氣為氦氣，流速為1 mL/min，不分流模式，進(jìn)樣口溫度為250℃。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為EI，離子源溫度為230℃，電子能量為70 ev，質(zhì)量掃描范圍(m/z)為35～400 amu。

1.3.4 定性與定量分析

定性方法:未知揮發(fā)性成分經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索與NIST08標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)匹配得到，選擇匹配度大于80的揮發(fā)性組分進(jìn)行分析。

定量方法:相對(duì)百分含量按峰面積歸一化計(jì)算。

1.3.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5.1 單因素試驗(yàn)

選取50/30μmDVB/CAR/PDMS規(guī)格的萃取頭，對(duì)萃取量、萃取溫度、平衡時(shí)間、萃取時(shí)間、解析時(shí)間5個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，分析各因素對(duì)離子色譜圖峰面積的影響。

1.3.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Behnken Design方案的設(shè)計(jì)原理，以離子色譜圖峰面積為響應(yīng)值，單因素試驗(yàn)最佳值為中心點(diǎn)，進(jìn)行四因素三水平的組合設(shè)計(jì)，最后通過(guò)響應(yīng)面分析得到最佳萃取條件。

1.3.5.3 樣品檢測(cè)

根據(jù)響應(yīng)面分析得到的最佳萃取條件對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取量的選擇

選取50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭，固定萃取溫度70℃，平衡時(shí)間60 min，萃取時(shí)間60 min，解析時(shí)間4 min，萃取量分別為10、15、20、25、30 g，考察萃取量對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 萃取量對(duì)萃取效果的影響

萃取量對(duì)萃取時(shí)間及效果影響很大［12］。萃取量越大，萃取頭吸附的物質(zhì)越多，總峰面積越大;但萃取量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致堆積過(guò)厚，水浴平衡時(shí)受熱不均勻，物質(zhì)不能很好地?fù)]發(fā)出來(lái)，同時(shí)萃取頭纖維吸附會(huì)出現(xiàn)飽和狀態(tài)，不利于更好地萃取物質(zhì)。由圖1可知，隨著萃取量的增加，總峰面積也隨之增大，當(dāng)萃取量為20 g時(shí)，總峰面積達(dá)到最大，之后有所減小，說(shuō)明萃取量存在最佳點(diǎn)，因此選擇20 g為最佳萃取量。

2.1.2 萃取溫度的選擇

選取50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭，固定萃取量為20 g，平衡時(shí)間60 min，萃取時(shí)間60 min，解析時(shí)間4 min，萃取溫度分別為 50、60、70、80、90 ℃，考察萃取溫度對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

頂空固相微萃取是比較敏感的樣品處理方法，萃取溫度對(duì)結(jié)果影響較大［6］。隨著溫度升高，氣體分子運(yùn)動(dòng)加快，有利于物質(zhì)更好地?fù)]發(fā)出來(lái)，縮短達(dá)到吸附平衡的時(shí)間;但溫度過(guò)高又會(huì)使揮發(fā)性物質(zhì)與涂層之間的分配系數(shù)下降［13］，降低纖維頭的吸附量。由圖2可知，萃取溫度對(duì)總峰面積的影響效果顯著，萃取溫度為70℃時(shí)總峰面積達(dá)到最大，因此存在最佳值。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響

2.1.3 平衡時(shí)間和萃取時(shí)間的選擇

選擇50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭，在萃取量20 g，萃取溫度70℃，萃取時(shí)間60 min，解析時(shí)間4 min 的條件下，平衡時(shí)間分別30、40、50、60、70 min，考察平衡時(shí)間對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

平衡時(shí)間決定揮發(fā)性成分和樣品之間達(dá)到兩相平衡的效果，同時(shí)影響萃取纖維頭的吸附量和達(dá)到吸附平衡的時(shí)間［14］。由圖3可知，總峰面積隨著平衡時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在60 min時(shí)達(dá)到最大值，隨后趨于平緩，存在最佳值。

選擇50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭，在萃取量為20 g，萃取溫度70℃，平衡時(shí)間60 min，解析時(shí)間4 min的條件下，選擇萃取時(shí)間為 30、40、50、60、70 min，考察萃取時(shí)間對(duì)總峰面積的影響，結(jié)果如圖4所示。

固相微萃取的最佳萃取時(shí)間應(yīng)該是揮發(fā)性成分在氣相和涂層兩相之間達(dá)到平衡的時(shí)間［13］，由圖4可知，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，總峰面積也隨之增大，在60 min時(shí)達(dá)到最大，存在最佳值，隨后開(kāi)始減小，這是由于萃取頭纖維涂層吸附已經(jīng)飽和，萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致熱穩(wěn)定性低的物質(zhì)分解，因此總峰面積減小。

圖3 平衡時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

圖4 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

2.1.4 解析時(shí)間的選擇

選擇50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在萃取量20 g，平衡時(shí)間60 min，萃取溫度70℃，萃取時(shí)間60 min 的條件下，解析時(shí)間選擇 1、2、3、4、5 min，考察解析時(shí)間對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

解析時(shí)間對(duì)萃取效果的影響表現(xiàn)為:若解析時(shí)間短，會(huì)導(dǎo)致物質(zhì)沒(méi)有完全解析出來(lái);若解析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使色譜峰變寬，保留時(shí)間發(fā)生變化［15］。由圖5可知，總峰面積隨著解析時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，4 min過(guò)后趨于平緩，總峰面積基本不變，考慮到解析時(shí)間長(zhǎng)會(huì)影響萃取頭壽命，選擇4 min為最佳值。

圖5 解吸時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化萃取條件

2.2.1 響應(yīng)面因素的確定及試驗(yàn)方案

根據(jù) Box－ Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［16－17］，再綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，固定萃取量為20 g，以萃取溫度、平衡時(shí)間、萃取時(shí)間、解析時(shí)間為響應(yīng)面因素，離子色譜總峰面積為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的分析試驗(yàn)，響應(yīng)面因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表

2.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸分析

以離子色譜總峰面積為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)為24個(gè)析因點(diǎn)和5個(gè)零點(diǎn)，零點(diǎn)處重復(fù)5次以估計(jì)試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸結(jié)果分析見(jiàn)表3。通過(guò)Design Expert軟件對(duì)表3中的結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型:

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

Y=2.94+0.66A－0.051B+0.14C+0.14D+0.047AB+0.025AC－0.12AD－0.33BC－0.023BD－0.16CD－0.57A2－0.27B2－0.34C2－0.024D2

表3 回歸分析結(jié)果

回歸模型擬合度R2=0.900 3，表明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值具有較好的相關(guān)性，校正擬合度=0.800 7，表明該回歸模型可以解釋80.07%的響應(yīng)值的變化，19.93%左右的變異不能由回歸模型來(lái)解釋;殘差為實(shí)際觀測(cè)值與回歸估計(jì)值之間的差，它的平方和反應(yīng)了模型擬合程度，殘差越小，擬合程度越高，表3中殘差平方和為0.072，說(shuō)明回歸模型擬合程度較高;同時(shí)信噪比(Adeq precision)為9.163(通常大于4模型較好)，進(jìn)一步說(shuō)明模型設(shè)計(jì)具有較好的擬合性。

由表3可以看出，BC、B2對(duì)結(jié)果影響較顯著(P＜0.05)，回歸模型及其顯著(P＜0.01)，表明擬合程度較好，此試驗(yàn)具有很高的可信性和準(zhǔn)確性;失擬項(xiàng)極其不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)誤差較小;一次項(xiàng)中，A(萃取溫度)對(duì)結(jié)果的影響極其顯著(P＜0.01)，說(shuō)明萃取溫度是影響離子色譜總峰面積的關(guān)鍵因素，二次項(xiàng)A2、C2對(duì)結(jié)果的影響也是極其顯著的。同時(shí)，從F值的大小可以判斷，4個(gè)因素對(duì)總峰面積影響程度的排序?yàn)锳(萃取溫度)＞D(解析時(shí)間)＞C(萃取時(shí)間)＞B(平衡時(shí)間)。2.2.3 響應(yīng)面曲面分析

圖6 萃取溫度、平衡時(shí)間、萃取時(shí)間、解析時(shí)間兩兩交互作用對(duì)萃取效果的影響

圖6 反應(yīng)了萃取溫度、平衡時(shí)間、萃取時(shí)間、解析時(shí)間兩兩交互作用對(duì)響應(yīng)值總峰面積的影響，圖6中可以看出，萃取溫度和解析時(shí)間對(duì)總峰面積的影響最大，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面較陡，這與方差分析的結(jié)果一致，并且隨著溫度升高，時(shí)間延長(zhǎng)，響應(yīng)值都是先升高后降低，說(shuō)明存在極值點(diǎn)，根據(jù)萃取溫度和解析時(shí)間，萃取溫度和萃取時(shí)間，萃取時(shí)間和解析時(shí)間的響應(yīng)曲面可看出對(duì)總峰面積影響最大的因素是萃取溫度，其次是解析時(shí)間，然后是萃取時(shí)間，最后是平衡時(shí)間，這符合表3中得出的方差分析結(jié)果，結(jié)合響應(yīng)面分析圖和方差分析表得出最大響應(yīng)值(Y)所對(duì)應(yīng)的最佳的萃取條件為:萃取溫度74.69℃，平衡時(shí)間58.79 min，萃取時(shí)間60.48 min，解析時(shí)間為5 min，結(jié)合實(shí)際條件，選擇萃取溫度75℃，平衡時(shí)間59 min，萃取時(shí)間60 min，解析時(shí)間5 min。

2.3 樣品的檢測(cè)

按照最佳萃取條件，即萃取溫度75℃，平衡時(shí)間59 min，萃取時(shí)間60 min，解析時(shí)間5 min，對(duì)秈稻樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定分析，得到樣品揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積為3.203 6×109，與預(yù)測(cè)值3.181 3×109非常接近，相對(duì)誤差為0.69%，同時(shí)單因素試驗(yàn)得到樣品揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積為2.940 0×109，小于最佳萃取條件下得到的數(shù)值，說(shuō)明用響應(yīng)面法優(yōu)化固相微萃取條件是更加合理可行的，同時(shí)共檢測(cè)出烴類、醛類、酮類、醇類、酸酯類、含氮含氯含氧及雜環(huán)化合物84種，其中烴類物質(zhì)含量最高，其次為醛類、含氮含氯含氧及雜環(huán)類、酸酯類、酮類、醇類。樣品峰譜圖如圖7所示，測(cè)得的揮發(fā)性成分及相對(duì)含量如表4所示。

圖7 秈稻的分析譜圖

表4 秈稻中各類揮發(fā)性成分及相對(duì)含量

表4 (續(xù))

表4 (續(xù))

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面分析法應(yīng)用于固相微萃取條件，回歸分析模型顯著，試驗(yàn)設(shè)計(jì)具有可行性，同時(shí)4個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，方差分析和響應(yīng)曲面結(jié)果顯示，對(duì)總峰面積影響最大的2個(gè)因素為萃取溫度和解析時(shí)間，其次是萃取時(shí)間，最后是平衡時(shí)間，響應(yīng)面法優(yōu)化固相微萃取稻谷揮發(fā)性成分的最佳處理?xiàng)l件為:萃取溫度75℃，平衡時(shí)間59 min，萃取時(shí)間60 min，解析時(shí)間5 min，在此條件下得到的總峰面積為3.203 6×109，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.69%，共檢出烴類、醛類、酮類、醇類、酸酯類、化合物84種，其中烴類和醛類物質(zhì)含量最高、其次為含氮含氯含氧及雜環(huán)類、酸酯類、酮類、醇類。

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