小擬南芥HDG12基因的克隆、生物信息學(xué)分析及植物表達(dá)載體的構(gòu)建及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

梁志強(qiáng)　孔德真　李輝玲　裴娟　祝建波　王愛(ài)英

摘要：以小擬南芥基因組DNA為模板，運(yùn)用同源克隆法獲得小擬南芥HDG12基因，命名為ApHDG12。運(yùn)用生物信息學(xué)方法，對(duì)ApHDG12基因的理化性質(zhì)、保守序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位等進(jìn)行了分析，并進(jìn)行同源建模。經(jīng)測(cè)序和生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，ApHDG12基因由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成，mRNA長(zhǎng)度為2 064 bp，編碼687個(gè)氨基酸，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示ApHDG12與Capsella rubella遺傳距離最近，CDD保守序列分析結(jié)果顯示ApHDG12有18～79位的同源異型域和206～436位的START結(jié)構(gòu)域，屬于HD-zipⅣ類(lèi)基因家族，同時(shí)構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121：：HDG12，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，為進(jìn)一步研究基因功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小擬南芥；HDG12基因；克?。簧镄畔W(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0033-05

收稿日期：2014-03-19

基金項(xiàng)目：石河子大學(xué)“自然科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新”團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號(hào)：2011ZRKXTD-0605）。

作者簡(jiǎn)介：梁志強(qiáng)（1988—），男，甘肅武威人，碩士，主要從事植物基因工程研究。E-mail：514326242@qq.com。

通信作者：王愛(ài)英，副研究員，主要從事植物基因工程與轉(zhuǎn)基因生物安全性評(píng)價(jià)研究。E-mail：way-sh@126.com。全球正面臨著水資源日益短缺的境況，由干旱造成的農(nóng)作物減產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)損失逐漸加劇，因此甄別利用具有耐旱性的基因，提高作物的耐旱性，發(fā)展生物節(jié)水農(nóng)業(yè)，對(duì)于緩解水資源危機(jī)，保障國(guó)家的糧食安全、生態(tài)安全和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

擬南芥HD-zipⅣ類(lèi)基因家族有16個(gè)成員，其中大部分在植物表皮層中表達(dá)，控制表皮細(xì)胞的分化、色素的合成、表皮毛和根毛的發(fā)育[1-2]。GL2在表皮毛部位表達(dá)，控制種皮、根毛以及莖葉表皮毛的發(fā)育[3]；ATML1和PDF2共同調(diào)節(jié)表皮的發(fā)育，若PDF2過(guò)量表達(dá)則影響花的形態(tài)以及開(kāi)花時(shí)間[4]；ANTHOCYANINLESS2（ANL2）控制表皮層花青素的積累[5]；HDG11基因過(guò)量表達(dá)則會(huì)抑制表皮毛的分叉，且HDG11和HDG12基因共突變時(shí)這種現(xiàn)象更為明顯[1]，HDG11基因的過(guò)表達(dá)能夠提高植物的耐旱性[6]。前人針對(duì)HD-zip基因家族的研究結(jié)果表明，該家族內(nèi)成員的功能較為復(fù)雜，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用，因此更深層次的研究其基因家族內(nèi)成員的功能并加以合理利用具有十分重要的意義。

近年來(lái)，對(duì)擬南芥近緣種的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)，而新疆是擬南芥近緣種的分布中心[7]，小擬南芥（Arabidopsis pumila）是雙子葉模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的近緣種，為十字花科擬南芥屬的短命植物，在適應(yīng)新疆特殊干旱氣候方面，小擬南芥表現(xiàn)出更為優(yōu)異的適應(yīng)特性[8-9]。目前從小擬南芥中克隆得到了一些抗逆基因，與擬南芥有較高的同源性，如黃先忠等利用同源克隆法克隆的ApCBF1和AtCBF1編碼的氨基酸序列一致[10]；院海英等利用同源克隆法得到的ApNHX1與AtNHX1編碼的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果為99%[9]；劉瑞娜等利用同源克隆法以AtHRD基因序列為模板設(shè)計(jì)同源引物克隆得到了小擬南芥ApHRD[11]。本研究以小擬南芥基因組DNA為模板，根據(jù)NCBI上HDG12基因序列設(shè)計(jì)同源引物，克隆得到了ApHDG12基因，并利用生物信息學(xué)軟件及在線序列分析工具，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)，以期為后續(xù)開(kāi)展的ApHDG12基因功能和作用機(jī)理研究提供一定的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

小擬南芥種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，種植于“營(yíng)養(yǎng)土 ∶蛭石=1 ∶2”的培養(yǎng)土中，置于20 ℃、16 h光照、8 h黑暗條件下培養(yǎng)。大腸桿菌TOP10、農(nóng)桿菌GV3101，Taq DNA聚合酶購(gòu)自天根公司，PMD18-T simple vector kit、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1小擬南芥基因組DNA的提取采用CTAB優(yōu)化法[12]提取小擬南芥基因組DNA。

1.2.2小擬南芥ApHDG12克隆及測(cè)序根據(jù)NCBI上已提交的擬南芥HDG12基因（NM_101655.2）cDNA序列，運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計(jì)同源引物（F：5′-AGTTGTGTGATGGTCCAGAGTTAGC-3′，R：5′-GATTTCTTACACTCTTTGCAGGCAT-3′），以小擬南芥基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系參考Taq DNA Polymerase說(shuō)明書(shū)。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58.0 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸3 min 10 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，與PMD18-T simple vector于16 ℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素（50 μg/mL）、X-gal（20 mg/mL）、IPTG（200 mg/mL）的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，對(duì)重組克隆進(jìn)行PCR鑒定。陽(yáng)性克隆交由北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3序列分析測(cè)序結(jié)果用DNAMAN 6.0進(jìn)行拼接，用FGENESH（http：//linux1.sof tberry.com/berry.phtml）進(jìn)行分析并預(yù)測(cè)蛋白的氨基酸序列，蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析，蛋白質(zhì)親疏水性預(yù)測(cè)用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析，蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分別采用WolfPsort（http：//wolfpsort.org/）[13]、BaCelLO（http：//gpcr.biocomp.unibo.it/bacello）、Cello（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）3種工具分析。

通過(guò)NCBI的CDD（Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/Str ucture/cdd/cddsrv.cgi）對(duì)ApHDG12蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。運(yùn)用NCBI的BlastP搜索與HDG12蛋白同源的其他植物序列，DNAMAN分析其相似性，使用MEGA5.2軟件Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap分析次數(shù)為1 000次[14]。

利用在線工具HNN （http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa _gor4.ht ml）對(duì)ApHDG12蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，螺旋卷曲（coiled-coil）預(yù)測(cè)用COILS（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）分析。選擇同源建模SWISS-MODEL CPHMODELS對(duì)ApHDG12蛋白構(gòu)建三級(jí)結(jié)構(gòu)模型[15]。

1.2.4植物表達(dá)載體構(gòu)建測(cè)序正確的PMD18-T：：HDG12用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切得到的目的基因片段，同時(shí)用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切pBI121質(zhì)粒，切除GUS基因片段，回收表達(dá)載體大片段。將載體、片斷按1 ∶1比例，經(jīng)T4連接酶4 ℃過(guò)夜連接，產(chǎn)物經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10感受態(tài)細(xì)胞。挑取菌斑在含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于 37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)5～6 h，進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。BamHⅠ/SacⅠ酶切鑒定后得重組的植物表達(dá)載體命名為pBI121：：HDG12。

將酶切正確的質(zhì)粒，電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，保存鑒定正確的單克隆菌液。

2結(jié)果與分析

2.1小擬南芥HDG12基因的克隆和測(cè)序

經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)得到3 000 bp左右的條帶（圖1），挑選其中2個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序，小擬南芥HDG12基因2條測(cè)序序列重復(fù)率為99.67%，與擬南芥HDG12基因比對(duì)，重復(fù)率為94.37%。測(cè)序分析PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為3 034 bp，與預(yù)期結(jié)果相一致，命名為ApHDG12。

使用在線工具FGENESH對(duì)克隆到的ApHDG12基因組序列進(jìn)行分析，得出ApHDG12基因包含10個(gè)外顯子、9個(gè)內(nèi)含子（圖2），并預(yù)測(cè)ApHDG12基因mRNA的長(zhǎng)度為2 064 bp，編碼687個(gè)氨基酸。

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果（圖3）顯示，ApHDG12與AtHDG12氨基酸序列相似性為93.18%。共計(jì)45位氨基酸發(fā)生了變異。這些發(fā)生變異的氨基酸位點(diǎn)是否是小擬南芥特有，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。在幾個(gè)擬南芥近緣物種中的Homeodomain結(jié)構(gòu)域中，ApHDG12第5位氨基酸突變?yōu)榫彼酭，在擬南芥及其近源物種中HDG12第5位為賴(lài)氨酸K，表明該結(jié)構(gòu)域第5位的R是小擬南芥特有位點(diǎn)，預(yù)示著這一位的氨基酸在同源異型域中起著重要的作用。

2.2HDG12蛋白保守序列預(yù)測(cè)

使用NCBI 的 CDD（Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)FGENESH預(yù)測(cè)的ApHDG12氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該序列具有典型的HD-zip轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（圖4），氨基酸序列18～79位是同源異型域（Homeodomain）；206～436位是START結(jié)構(gòu)域（START domain）。

2.3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

使用Portparam分析小擬南芥ApHDG12基因編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，該序列的分子量為76 426.8 u，理論等電點(diǎn)為6.43，總負(fù)電荷殘基數(shù)目為74，總正電荷殘基數(shù)目為69，分子式為C3330H5304N950O1033S39，不穩(wěn)定指數(shù)為5252，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為81.32。

3種在線工具對(duì)ApHDG12亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。WolfPsort預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白定位于細(xì)胞核，Cello結(jié)果預(yù)測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞核，可靠指數(shù)為2.694，BaCelLO預(yù)測(cè)結(jié)果該蛋白定位于細(xì)胞核，定位順序?yàn)椋杭?xì)胞內(nèi)>細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)>細(xì)胞核。

2.4ApHDG12蛋白疏水性分析

用在線工具PortScale對(duì)小擬南芥ApHDG12基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析，窗口大小選擇9（圖5），結(jié)果表明，20位賴(lài)氨酸疏水性最弱，疏水指數(shù)為-3.944；341/342位半胱氨酸C/谷氨酸E 疏水性最強(qiáng)，疏水指數(shù)為1.956，多肽鏈整體表現(xiàn)為親水性，平均疏水性為-0.330。

2.5同源性和進(jìn)化樹(shù)分析

在GenBank中輸入ApHDG12氨基酸序列，運(yùn)行BlastP，結(jié)果顯示，該氨基酸序列已在蓖麻、毛果楊、Capsella rubella（與擬南芥近緣的薺菜屬一個(gè)自交物種）、Eutrema salsuginuem、擬南芥、陸地棉、葡萄、玉米、可可、高粱、山羊草、碧桃等物種里報(bào)道過(guò)。運(yùn)行DNAMAN對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，AtHDG12基因編碼的氨基酸序列與高粱（Sorghum bicolor；XP_002438026.1）的同源性是50.48%；與碧桃（Prunus persica；EMJ18783.1）的同源性是43.34%；與山羊草（Aegilops tauschii；EMT05677.1）的同源性是45.60%；與Eutrema salsugineum（ESQ35009.1）的同源性是85.71%；與無(wú)油樟（Amborella trichopoda；ERN11049.1）的同源性是56.88%；與玉米（Zea mays；AFW73676.1）的同源性是49.93%；與可可（Theobroma cacao；EOY01444.1）的同源性是44.43%；與葡萄（Vitis vinifera；CAN83483.1）的同源性是63.64%；與毛果楊（Populus trichocarpa；ERP52009.1）的同源性是62.92%；與陸地棉（Gossypium hirsutum；AAU12247.1）的同源性是65.33%；與蓖麻（Ricinus communis；XP_002527933.1）的同源性是62.15%；與擬南芥（Arabidopsis thaliana；NP_564041.2）的同源性是9318%；與Capsella rubella（EOA39819.1）的同源性是93.03%。

應(yīng)用MEGA5.2軟件對(duì)13個(gè)物種的HDG12氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，小擬南芥與Capsella rubella、 Eutrema salsuginuem、擬南芥遺傳關(guān)系最近，與Capsella rubella聚為一類(lèi)（圖6）。

2.6ApHDG12蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線工具HNN對(duì)ApHDG12蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，ApHDG12多肽鏈有α螺旋殘基206個(gè)，占二級(jí)結(jié)構(gòu)29.99%；β折疊殘基133個(gè)，占19.36%；無(wú)規(guī)則卷曲殘基348個(gè)，占50.66%。利用PSIPRED分析顯示該蛋白擁有19個(gè)α螺旋，15個(gè)β折疊，無(wú)規(guī)則卷曲34個(gè)（圖7）。運(yùn)用COILS對(duì)ApHDG12編碼的氨基酸序列進(jìn)行卷曲螺旋（coiled-coil）預(yù)測(cè)（圖8），結(jié)果顯示，第一個(gè)coiled-coil模式序列位于31～45區(qū)域；第二個(gè)coiled-coil模式序列位于47～61區(qū)域；第三個(gè)coiled-coil模式序列位于69～111區(qū)域。

2.7ApHDG12蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模

選擇同源建模SWISS-MODEL CPHMODELS對(duì)ApHDG12蛋白建模，用DeepView觀察其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該蛋白由兩部分結(jié)構(gòu)域組成（圖9），第一部分由18～79位氨基酸組成的同源異型結(jié)構(gòu)域（homeodomain）（圖10-A），以雞engrailed 2 homeodomain蛋白同源異型結(jié)構(gòu)域?yàn)槟０?；第二部分?06～436位氨基酸組成的START結(jié)構(gòu)域，以人類(lèi)類(lèi)固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白（human phosphatidylcho line transfer protein）START結(jié)構(gòu)域?yàn)槟０澹▓D10-B）。

2.8植物表達(dá)載體的構(gòu)建

為模板，克隆得到兩端帶有酶切位點(diǎn)的基因片段，克隆方法同上。將該質(zhì)粒用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切回收基因片段，同時(shí)BamHⅠ/SacⅠ雙酶切pBI121質(zhì)粒，回收載體大片段，經(jīng)T4連接酶連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)，PCR鑒定后，質(zhì)粒用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定，酶切產(chǎn)物在3kb處，即為插入的目的基因片段（圖11），表明植物過(guò)表達(dá)載體已構(gòu)建成功。該植物表達(dá)載體包括完整的NPTⅡ篩選標(biāo)記，CaMV 35S啟動(dòng)子，NOS終止子（圖12）。

2.9pBI121：：HDG12轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

將酶切驗(yàn)證正確的pBI121：：HDG12質(zhì)粒，電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)

桿菌GV3101細(xì)胞，涂布于含有利福平（100 mg/L）、慶大霉素（50 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L）的固體LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)36 h后，挑取單克隆，PCR鑒定，擴(kuò)增片段與PMD18-T：：HDG12擴(kuò)增條帶一致（圖13），證明pBI121：：HDG12植物表達(dá)載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入了農(nóng)桿菌GV3101中。

3結(jié)論與討論

干旱是影響全世界農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要問(wèn)題。利

用轉(zhuǎn)基因方法培育耐旱作物品種是實(shí)施農(nóng)業(yè)節(jié)水的一個(gè)重要途徑，具有周期短、資源豐富的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，越來(lái)越多的同源異型域——亮氨酸拉鏈基因被克隆，并證實(shí)具有特殊的功能。

棉花GbML1屬于HD-zipⅣ基因家族，NM端的同源異型域（HD）和不完整的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（LZL）專(zhuān)一的L1盒，控制LI層相關(guān)基因的表達(dá)。START結(jié)構(gòu)域和SAD結(jié)構(gòu)域共同完成與GbMYB25蛋白的結(jié)合，經(jīng)采用片段缺失法，通過(guò)酵母雙雜交手段驗(yàn)證，只有完整的START結(jié)構(gòu)域和SAD結(jié)構(gòu)域存在時(shí)，GbML1蛋白和GbMYB25蛋白才能相互作用[16]，說(shuō)明HD-zipⅣ蛋白的HD-LZL結(jié)構(gòu)專(zhuān)一結(jié)合DNA結(jié)合位點(diǎn)，START-SAD結(jié)構(gòu)與相關(guān)蛋白結(jié)合，行使特定功能。

AtHDG12基因在突變時(shí)，擬南芥表現(xiàn)出與野生型相同的表型，表明了AtHDG12為冗余基因；與AtHDG11基因雙突變時(shí)表現(xiàn)出了比野生型和AtHDG11單突變時(shí)更為顯著的表型—表皮毛分支數(shù)明顯增加，多于野生型和HDG11基因單突變時(shí)的表皮毛分支數(shù)[2]，有可能暗示著HDG12基因與HDG11基因在植物中表達(dá)調(diào)控時(shí)具有相互作用。AtHDG11過(guò)表達(dá)使得擬南芥和煙草都表現(xiàn)出氣孔密度降低、主根增長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)量增加的表型，提高了擬南芥和煙草的耐旱性[6]。AtHDG12和AtHDG11為一對(duì)等位基因，是否AtHDG12也具有類(lèi)似于AtHDG11一樣的功能尚不明確，有待于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

我們從小擬南芥中克隆得到了ApHDG12，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)ApHDG12具有HD-zip基因家族的特征，在氨基酸的理化性質(zhì)方面二者存在明顯的差異，在homeodomain域中的第5位氨基酸發(fā)生了變異，是否是這一位的氨基酸突變會(huì)改變蛋白功能，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，同源性分析其與擬南芥近緣種Capsella rubella親緣關(guān)系最近，次之為擬南芥。卷曲螺旋預(yù)測(cè)，在homeodomain結(jié)構(gòu)域中存在3個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，與homeodomain結(jié)構(gòu)域功能相符合，ApHDG12氨基酸序列不論從保守序列預(yù)測(cè)還是三級(jí)結(jié)構(gòu)建模預(yù)測(cè)，只預(yù)測(cè)到了同源異型域和START結(jié)構(gòu)域，不完整亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（LZL）和SAD結(jié)構(gòu)域沒(méi)有預(yù)測(cè)到，也許是因?yàn)樯镄畔W(xué)在線分析工具存在一定局限性，不能完整預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)。同時(shí)我們構(gòu)建了pBI121：：HDG12植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化了農(nóng)桿菌GV3101，為我們后續(xù)將該基因轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥和煙草分析其功能提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ariel F D，Manavella P A，Dezar C A，et al. The true story of the HD-Zip family[J]. Trends in Plant Science，2007，12（9）：419-426.

[2]Nakamura M，Katsumata H，Abe M，et al. Characterization of the class IV homeodomain-Leucine Zipper gene family in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2006，141（4）：1363-1375.

[3]Ishida T，Kurata T，Okada K，et al. A genetic regulatory network in the development of trichomes and root hairs[J]. Annual Review of Plant Biology，2008，59：365-386.

[4]Abe M，Katsumata H，Komeda Y，et al. Regulation of shoot epidermal cell differentiation by a pair of homeodomain proteins in Arabidopsis[J]. Development，2003，130（4）：635-643.

[5]Kubo H，Peeters A J，Aarts M G，et al. ANTHOCYANINLESS2，a homeobox gene affecting anthocyanin distribution and root development in Arabidopsis[J]. The Plant Cell，1999，11（7）：1217-1226.

[6]Yu H，Chen X，Hong Y Y，et al. Activated expression of an Arabidopsis HD-START protein confers drought tolerance with improved root system and reduced stomatal density[J]. The Plant Cell，2008，20（4）：1134-1151.

[7]劉彤，趙新俊，崔運(yùn)河，等. 天山北麓中段擬南芥（Arabidopsis thaliana）與相鄰物種的分布格局及相互關(guān)系[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2008，28（4）：1842-1849.

[8]張海波，劉彭，劉立鴻，等. 新疆短命植物小擬南芥耐鹽性的初步研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（2）：286-290.

[9]院海英，顧超，徐芳，等. 小擬南芥Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，29（4）：401-407.

[10]黃先忠，張鵬，呂新華，等. 新疆小擬南芥ApCBF1基因的克隆及其過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因的研究[J]. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，27（3）：265-268.

[11]劉瑞娜，焦天奇，王愛(ài)英，等. 十字花科植物HRD基因的克隆及分析[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，48（3）：437-444.

[12]黃萱，高麗美，張永彥，等. 一種優(yōu)化的植物總DNA提取方法[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（6）：1103-1106.

[13]馮媛媛，侯佩，李穎楠，等. 番茄 ARF2 蛋白的生物信息學(xué)分析與亞細(xì)胞定位[J]. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)進(jìn)展，2012，39（1）：51-58.

[14]Kumar S，Nei M，Dudley J，et al. MEGA：a biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences[J]. Briefings in Bioinformatics，2008，9（4）：299-306.

[15]Peitsch M C. ProMod and Swiss-Model：internet-based tools for automated comparative protein modelling[J]. Biochemical Society Transactions，1996，24（1）：274-279.

[16]張飛. 棉纖維發(fā)育早期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究[D]. 上海：上海交通大學(xué)，2010.衛(wèi)曉靜，王華忠，岳潔瑜. 白粉菌誘導(dǎo)小麥葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及質(zhì)量評(píng)價(jià)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：38-40.