白粉菌誘導小麥葉片全長cDNA文庫的構建及質量評價

衛(wèi)曉靜　王華忠　岳潔瑜

摘要：小麥白粉病是由小麥白粉菌（Blumeria graminis f. sp. Tritici，Bgt）侵染引起的小麥（Triticum aestivum L.）生產(chǎn)上的主要病害之一，克隆小麥抗白粉病相關基因并研究其生物學功能具有重要的應用價值和現(xiàn)實意義。以白粉菌Bgt 侵染誘導的攜帶小麥抗白粉病基因Pm21（廣譜抗白粉病基因）“92R137/揚麥1587”為材料，利用SMART（switching mechanism at 5′ end of the RNA transcript）技術構建小麥葉片全長cDNA 文庫。結果表明，所獲得的原始文庫滴度為1.08×107 CFU/mL，擴展文庫滴度為3.24×107 CFU/mL，重組率98%，插入片段在0.5～2.0 kb 之間，多在1.0 kb左右。該文庫的構建為進一步開展小麥抗白粉病相關基因的克隆及分子生物學研究奠定基礎。

關鍵詞：小麥白粉病；cDNA文庫；構建；質量分析

中圖分類號： S435.121.4+6文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0038-03

收稿日期：2014-03-23

基金項目：天津市應用基礎計劃青年項目（編號：12JCQNJC09700）；天津師范大學科研基金（編號：52XB1105、52XS1210）。

作者簡介：衛(wèi)曉靜（1989—），女，山西太原人，碩士，研究方向為植物分子生物學。Tel：（022）23766823；E-mail：xiaojing19890404@126.com。

通信作者：岳潔瑜，博士，講師，主要從事逆境植物學研究。Tel：（022）23766823；E-mail：yueshan1982@163.com。小麥白粉菌（Blumeria graminis f.sp. tritici，Bgt）引起的小麥白粉病是世界上小麥主產(chǎn)區(qū)的主要病害之一[1]。白粉菌通過侵染小麥的葉片部位，嚴重時侵染葉鞘、莖稈和穗部，形成覆蓋整個植株的霉層，可導致葉片早枯，光合作用降低，呼吸作用加強，分蘗數(shù)減少，成穗率降低，千粒質量下降，可減產(chǎn)5%～10%，重病田減產(chǎn)可達20%以上[2]。白粉菌生理小種較多，常因基因重組和突變而產(chǎn)生具致病力的遺傳變異，導致單一抗病性品種的抗病性易喪失，因此發(fā)現(xiàn)與利用新的抗病基因，選育具有多個抗病基因聚合的持久抗病品種，從根本上制定有效的抗病策略，為研究白粉菌誘導的特異基因的表達提供了新途徑。目前克隆抗病基因常用的方法有轉座子標簽法和圖位克隆等方法，并已從擬南芥、煙草、玉米、水稻、小麥、番茄、亞麻等植物中克隆得到 50 多個抗病基因[3-5]。但用轉座子標簽法分離抗病基因受到轉座子的轉化效率、突變體產(chǎn)生后篩選的難易程度和突變體的表型是否穩(wěn)定遺傳等因素的限制；圖位克隆法前期工作量大、耗時長，準確性高，一般只適合基因組小的物種采用。cDNA 全長文庫在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態(tài)以及表達基因功能鑒定方面具有特殊優(yōu)勢，因此cDNA 全長文庫的構建和篩選是基因克隆的重要方法之一，也是目前發(fā)掘新基因和研究基因功能的基本工具[6]。Ma 等構建條銹菌誘導的小麥葉片cDNA 文庫，經(jīng)EST 分析發(fā)現(xiàn)ABC轉運子、金屬硫因子、泛素、質膜H+-ATPase 和氨基酸透酶等可能參與了寄主與病原菌互作過程[7]。陳玉婷等建立小麥葉銹菌與小麥非親和互作的基因表達數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)多個抗病防御基因及信號轉導相關基因[8]。姜寶杰等采用SMART（switching mechanism at 5′ end of the RNA transcript） 技術構建了花生受低溫、干旱、各種激素、缺鈣及黃曲霉等脅迫誘導的混合全長cDNA 文庫，用于花生抗逆基因的發(fā)掘[9]。本研究運用SMART 技術構建了白粉菌誘導的小麥葉片全長cDNA 文庫，并對文庫質量進行初步鑒定，為大規(guī)模表達序列標簽（ expressed sequence tag，EST） 測序，開展基因表達譜分析，克隆和鑒定一批小麥響應白粉菌侵染的功能基因奠定了分子基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試小麥材料為攜帶廣譜抗白粉病基因Pm21的“92R137/揚麥1587”。將小麥種子播種于盆缽中，罩以卷成筒狀的透明投影膠片，上覆3層濾紙，防止空氣中白粉菌孢子及其他雜菌落入，然后置于25 ℃人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)（光照16 h/黑暗8 h）。以北方地區(qū)流行的小麥白粉菌15號生理小種E09為供試菌種，白粉菌在密植盆栽的感病品種蘇麥3號上繁殖，接種前24 h抖去老孢子，“92R137/揚麥1587” 苗期對該小種表現(xiàn)免疫（反應型為0級）。采用抖落法接種，用蘇麥3號擴繁的E09菌種高密度抖落于第2張葉完全展開的供試材料上。接種后在25 ℃人工培養(yǎng)箱中黑暗保濕，分別在接種后3、6、12、16、24、30、36、48、72 h剪取接種的第2張葉，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2RNA提取

取相同質量的白粉菌侵染過的及對照小麥葉片混合放入液氮預冷的研缽中，充分研磨。采用TRIZOL（Invitrogen）試劑提取總RNA，經(jīng)NandoDrop（ND-1000）Spectrophotometer檢測濃度及純度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.3cDNA 第一鏈和第二鏈合成

按照In-Fusion SMARTTM（Clonetech）試劑盒說明書，以1 μg 總RNA 為模板，以3′ In-Fusion SMARTer CDS Primer（5′-CGGGGTACGATGAGACACCA（T）20VN-3′；N=A、C、G、T，V=A、G、C）作為引物，按照SMART 文庫構建試劑盒操作合成cDNA 第一鏈。一鏈cDNA 合成體系總體積為10 μL，其中包括總RNA 1 μg，寡聚核苷酸（SMART Oligonucleotide）1 μL，CDS PCR 引物1 μL，一鏈合成緩沖液（5×First Strand Buffer）2 μL，二硫蘇糖醇（DTT）（100 mmol/L）0.25 μL，dNTP Mix （10 mmol/L）1 μL 和反轉錄酶SMARTScribETM Reverse Transcriptase 1 μL，混勻后42 ℃孵育1.5 h，68 ℃加熱10 min終止第一鏈反應。

以LD-PCR（long-distance PCR，LD-PCR） 法合成cDNA第二條鏈，向PCR 管中加入2 μL 一鏈模板、10 μL PCR緩沖液（10×Advantage 2 PCR buffer）、2 μL 50×dNTP Mix、2 μL 5′×PCR Primer ⅡA、2 μL In-Fusion SMARTer PCR Primer（5′-CGGGGTACGATGAGACACCA-3′）和2 μL 聚合酶（50×Advantage 2 Polymerase Mix），雙蒸水補足至100 μL。PCR 反應條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，66 ℃ 30 s，68 ℃ 6 min，17個循環(huán)。取2 μL雙鏈產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4雙鏈cDNA 純化

按試劑盒說明書要求準備好16 個1.5 mL 離心管及CHROMA SPIN+TE-1000 分級分離柱。將柱內(nèi)基質搖勻，消除柱內(nèi)氣泡，移除底蓋使柱內(nèi)緩沖液流盡。加入過柱緩沖液700 μL 使其自然流盡。將混有二甲苯氰的cDNA 加入到柱中，待cDNA滲入基質后加入過柱緩沖液100 μL。待自然流盡后加入過柱緩沖液600 μL，將制備好的16 個離心管迅速放在柱下方，每管1 滴，直到緩沖液流盡為止。每管取 3 μL 進行1.1% 瓊脂糖凝膠電泳，150 V 電泳10 min。選擇符合試驗要求的3～4 管，收集到新的離心管中，加入1/10體積醋酸鈉（3 mol/L，pH值4. 8）、糖原（20 mg/mL）1.3 μL、25倍體積的 95% 乙醇 （-20 ℃），-20 ℃過夜，14 000 r/min 離心 20 min，小心移除上清后用去離子水 10 μL 重懸沉淀。

1.5cDNA 與載體的連接轉化及菌落PCR 鑒定

取600 ng 的cDNA 與pSMART21FD 質粒連接，連接產(chǎn)物經(jīng)QuickClean Resin處理除去連接酶后，電擊法轉化到50 μL 大腸桿菌HST08 中，涂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，計算平板上的庫容數(shù)及文庫滴度。從文庫中隨機挑取15 個克隆進行菌落PCR，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2.1總RNA 的提取與質量檢測

采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的小麥葉片總RNA質量，結果（圖1）顯示，28S 和18S 2個條帶均完整清晰，亮度強弱對比適宜，總RNA 沒有明顯降解，完整性良好。D260 nm/D280 nm=1.86，D260 nm/D230 nm=2.02，表明RNA 的均一性較好，純度較高，沒有蛋白質的污染，滿足建庫要求。

2.2cDNA 合成結果與分析

采用LD-PCR 法擴增獲得雙鏈cDNA，如圖2顯示，雙鏈cDNA的長度在0.25～5 kb分布，含有中高豐度基因帶，符合植物基因cDNA 的長度范圍。

2.3cDNA片段的回收與純化

雙鏈cDNA 經(jīng)分級后的15 管收集液電泳結果表明，過柱分離的大于0.4kb的cDNA 片段主要集中于第5～8管中

（圖3），因此收集合并、純化第5～8管的cDNA，用于連接試驗。

2.4cDNA 文庫的質量鑒定

原始文庫滴度為1.08×107 CFU/mL，擴增總文庫滴度為3.24×107 CFU/mL，重組率達到98%。從原始文庫中隨機挑選15個單克隆進行PCR鑒定，結果插入片段分布在0.5 ～2 kb 之間（圖4），以上各指標均表明已獲得較高質量的 cDNA 文庫。

3討論

構建高質量的cDNA文庫是高效篩選抗白粉病相關基因的前提，而獲得純度高和完整性好的總RNA是構建高質量全長cDNA文庫的關鍵[10-11]。本研究采用改良TRIZOL 法提取

小麥葉片RNA，操作簡便，減少RNase 污染的可能性[12]。在提取RNA 過程中，以幼嫩的小麥葉片為試驗材料，取樣后立即置于液氮中速凍，再于-80 ℃保存，保證了RNA 樣品不被降解。所有器具及藥品均嚴格按照操作步驟和規(guī)范進行，避免RNA 酶的滅活，并在無菌條件下操作。以往常用的cDNA 合成方法中，需要先從總RNA 中純化出mRNA，因此需要大量的試驗材料提取高純度的mRNA[13]，而本研究所采用的SMART 技術直接利用總RNA 來合成全長cDNA，起始材料用量較少，使用0.05～1.00 μg 的總RNA 就可以利用LD-PCR技術構建雙鏈cDNA，獲得一個大于106 PFU 的全長cDNA 文庫，對于稀有材料而言具有較高的應用價值，避免了在分離純化時的多步操作所造成的mRNA的降解[14-15]。通過LD-PCR方法，還避免了當mRNA內(nèi)部存在二級結構或mRNA 長度過長時不能反轉錄完全的現(xiàn)象發(fā)生。LD-PCR合成的雙鏈cDNA通過分級分離后，過濾掉了較小的cDNA 片段和酶切反應后DNA 片段的殘留物，不僅保證了大片段cDNA 的富集，還減少了后期篩選的工作量。

傳統(tǒng)cDNA 文庫存在克隆片段短等缺點，而全長cDNA 文庫能提供完整的mRNA 信息，且只需通過1 次陽性篩選，即可獲得基因的全長序列，可最大程度地縮短獲取全長基因所花費的時間[16]。文庫的完整性與覆蓋度是構建cDNA 文庫的關鍵性因素，構建高質量的cDNA 文庫體現(xiàn)在2個方面：代表性和滴度。cDNA 文庫的代表性可用一個量化的指標——文庫的庫容量來衡量[17]。但是合成雙鏈cDNA的LD-PCR易使高豐度表達基因和短片段cDNA優(yōu)先擴增，大片段（大于3 kb）及低豐度表達基因易于丟失，從而影響文庫的代表性。LD-PCR 的這種偏向性可通過減少循環(huán)數(shù)加以克服，但循環(huán)不足會降低文庫的滴度，使稀有 cDNA 的比例降低，從而降低文庫的質量。因此，成功構建SMART 文庫的關鍵因素之一是選出合適的LD-PCR 循環(huán)數(shù)，SMART 試劑盒操作說明書（Clontech 公司）中推薦的循環(huán)數(shù)是 18～20，本研究運用遞增循環(huán)數(shù)的方法將 LD-PCR 的循環(huán)數(shù)確定為 17，既兼顧了文庫的代表性，又兼顧了文庫滴度，盡可能將循環(huán)數(shù)的負面影響降到最低程度。此外，cDNA的量與載體的比例不僅影響連接效率，還關系到插入片段的大小和文庫的代表性，在相同條件下，與大片段cDNA相比，小片段cDNA 優(yōu)先與載體連接，因此在保證文庫滴度和代表性的前提下，減小cDNA 與載體的連接比例，據(jù)此，設定了 2 ∶1、2.25 ∶1、 2.5 ∶1 這3種連接比例，其中二者比例為2 ∶1 時獲得最多的陽性克隆。就一般文庫而言，未擴增文庫滴度大于1×106 PFU/mL，重組率高于85% 即為有效文庫[18-19]，本研究所構建的原始全長cDNA 文庫為1.08×107 CFU/mL個單克隆，插入cDNA 片段大多數(shù)在500 bp 以上，符合高質量文庫的標準，為篩選和研究小麥響應白粉菌侵染的關鍵基因奠定了基礎。

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