黎俊宏，徐曉怡，王鳳鳴，姚 萍，李 瓊，徐 輝，何明禎

手足口?。╤and,footandmouth disease,HFMD）是一種好發(fā)于幼兒的疾病，常以發(fā)熱為首發(fā)癥狀，主要特征為皮膚和口腔黏膜的損傷。皮膚損傷多為斑丘疹或水泡樣皮疹，多見(jiàn)于以患兒的手掌、腳足部為代表性的身體部位，有時(shí)亦出現(xiàn)于患兒的臀部、手肘和腳膝處；口腔黏膜損傷多為口腔潰瘍，有些患兒表現(xiàn)為皰疹性咽峽炎，也有些患兒不出現(xiàn)口腔損傷[1]。

引起HFMD的病毒很多，主要為小RNA病毒科腸道病毒屬，包括柯薩奇病毒A組（coxasckievirus A,CoxA）的 2、4、5、6、7、9、10、16 型等、B 組的1、2、3、4、5 型等、腸道病毒（enterovirus,EV）71 型及埃可病毒等。其中以EV71及CoxA16型較為常見(jiàn)[2－3]。EV71 感染不僅能引起 HFMD，還可引起腦膜炎、腦炎、急性遲緩性癱瘓等嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[4]；CoxA16感染初期引起的HFMD臨床癥狀與EV71難以區(qū)別，但對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的侵襲及其嚴(yán)重并發(fā)癥卻較后者少見(jiàn)[5]。

由于EV71與CoxA16引起HFMD有著相似的臨床癥狀及體征，其病原學(xué)型別必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)來(lái)確診。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR），對(duì) 2010年 1月—2013年12月常州地區(qū)HFMD患兒進(jìn)行病原學(xué)分析，并分析患者年齡、性別及標(biāo)本類型等因素對(duì)型別分布及陽(yáng)性率的影響，為把握HFMD的防控工作提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 常州市2010年1月—2013年12月HFMD監(jiān)測(cè)網(wǎng)疫報(bào)總病例數(shù)為25 644例，選取其中HFMD患兒1945例。各醫(yī)療單位均以《手足口病診療指南（2010版）》[6]為臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，并嚴(yán)格規(guī)范采樣，每病例采集咽拭子和肛拭子各一份，冷藏送檢，24 h內(nèi) 4°C 保存，超過(guò) 24 h的－20°C 保存。

1.2 儀器及試劑 ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、MME－24提取儀和MagMAX－96病毒核酸抽提試劑盒均系美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；無(wú)菌病毒采樣管系友康基業(yè)生物科技有限公司產(chǎn)品；HFMD腸道病毒通用引物、EV71和CoxA16病毒RNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒系碩世生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 檢測(cè)方法 核酸提?。翰蓸庸軠u旋震蕩2min，取50μl混勻液，利用病毒核酸抽提試劑盒和MME－24磁珠處理儀，獲得50μl病毒RNA洗脫液。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：按照試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)液。反應(yīng)條件：50℃，30min，1個(gè)循環(huán)；95℃，5min，1個(gè)循環(huán)；95℃，10 s，55℃，40 s，45個(gè)循環(huán)。陰陽(yáng)對(duì)照和標(biāo)本結(jié)果判斷以說(shuō)明書為準(zhǔn)。同一例患兒肛拭子或咽拭子任意一項(xiàng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果即判為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組病原體型別分布差異性檢驗(yàn)用R×Cχ2檢驗(yàn)，多組陽(yáng)性率比較用R×Cχ2檢驗(yàn)，2組陽(yáng)性率比較用四格表χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同年份病原體型別分布及陽(yáng)性率 4個(gè)年份病原體型別分布不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2010和2012年以CoxA16型最多，EV71次之；2011年以EV71最多，CoxA16型次之，非EV71、CoxA16的其他EV型（指腸道病毒通用引物檢測(cè)陽(yáng)性而EV71和 CoxA16檢測(cè)陰性）均為最少；2013年以非EV71、CoxA16其他 EV 型最多，EV71型次之，Cox－A16最少。見(jiàn)表1。

2.2 不同年齡患兒病原體型別分布及陽(yáng)性率 在總陽(yáng)性率方面，除1～歲組的總陽(yáng)性率高于0～歲組外，其余各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同年齡段3種病原體型別分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中0～歲組和1～歲組均以非EV71、CoxA16的其他EV型最多，EV71 次之，CoxA16 最少；3～歲組和 6～歲組均以EV71最多，CoxA16次之，非 EV71、CoxA16的其他EV型最少。見(jiàn)表2。

表1 不同年份病原體型別分布及陽(yáng)性率［陽(yáng)性例數(shù)(%)］Table 1 Genotype distribution from 2010 to 2013[positives(%)]

表2 不同年齡患兒病原體型別分布及陽(yáng)性率［陽(yáng)性例數(shù)(%)］Table2 Genotype distribution in differentage groups[positives(%)]

2.3 不同性別病原體型別分布及總陽(yáng)性率 男童與女童病原體型別分布及總陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 男童與女童病原體型別分布及陽(yáng)性率［陽(yáng)性例數(shù)(%)］Table 3 Genotype distribution in boys and girls[positives(%)]

2.4 不同標(biāo)本來(lái)源病原體型別分布及總陽(yáng)性率 肛拭子組和咽拭子組病原體型別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但肛拭子組總陽(yáng)性檢出率高于咽拭子組（P＜0.05）。見(jiàn)表 4。

3 討 論

HFMD是一種常見(jiàn)的腸道傳染病，全球均有流行。在過(guò)去的幾十年里，隨著醫(yī)療衛(wèi)生水平和社會(huì)關(guān)注的提高，我國(guó)多個(gè)省市多次報(bào)道了HFMD流行狀況；2008年安徽省阜陽(yáng)市EV71型HFMD暴發(fā)致多起死亡病例的疫情[7]，更是引起國(guó)內(nèi)的高度重視。

表4 肛拭子和咽拭子病原體型別分布及陽(yáng)性率［陽(yáng)性例數(shù)(%)］Table 4 Genotype distribution in rectal and throat swab samp les[positives(%)]

本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)2010年1月—2013年12月我市1945例HFMD病例的病原體進(jìn)行檢測(cè)并分析，結(jié)果表明：EV71和CoxA16型是我市HFMD主要感染型別，這與國(guó)內(nèi)其他省市和周邊城市報(bào)道[8－11]相符；而非 EV71、CoxA16 其他EV型感染率呈逐年上升趨勢(shì)，4年間感染型別差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此提示，未來(lái)的HFMD病原體型別分布亦有可能發(fā)生變化。對(duì)476例非EV71、CoxA16其他EV型繼續(xù)分型發(fā)現(xiàn)，CoxA6型348例，CoxA10型41例，CoxB 4型19例，仍有68例待分型，這與現(xiàn)有報(bào)道基本相符[12]。按照年齡將HFMD病例分為4個(gè)組，分析發(fā)現(xiàn)：在總體陽(yáng)性率方面，除1～歲組的總體陽(yáng)性率高于0～歲組外，其余各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同年齡段3種病原體型別分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中0～歲組和1～歲組均以非EV71、CoxA16型最多，EV71次之，CoxA16最少；3～歲組和6～歲組均以EV71最多，CoxA16型次之，非EV71、CoxA16的其他EV型最少。

按照性別分組，發(fā)現(xiàn)男童組和女童組病原體感染型別及總陽(yáng)性率無(wú)顯著差異。由此提示，在HFMD的日常防控工作中，對(duì)于各個(gè)年齡階段的男童與女童均須加強(qiáng)兒童衛(wèi)生意識(shí)的培養(yǎng)，重視良好的衛(wèi)生生活習(xí)慣的養(yǎng)成，多運(yùn)動(dòng)以增強(qiáng)機(jī)體免疫力，重視生活環(huán)境的消毒，在高發(fā)季節(jié)堅(jiān)持每日檢查體溫及皮膚黏膜的損傷情況等。HFMD防控工作應(yīng)緊抓不放，以杜絕聚集性感染的發(fā)生。

目前，用于HFMD臨床診斷標(biāo)本有皰疹液、血清、腦脊液、糞便、肛拭子、咽拭子等?；鶎俞t(yī)療機(jī)構(gòu)較易獲取的則為肛拭子和咽拭子，而國(guó)內(nèi)外有關(guān)這2種標(biāo)本檢測(cè)差異的文獻(xiàn)較少。對(duì)二者進(jìn)行HFMD檢出評(píng)價(jià)，有利于實(shí)驗(yàn)室診斷和了解HFMD病原學(xué)特征，并對(duì)基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)采集樣本有指導(dǎo)作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肛拭子組和咽拭子組病原體型別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但肛拭子組總陽(yáng)性檢出率高于咽拭子組，這可能與兩種標(biāo)本采集時(shí)機(jī)和HFMD發(fā)病病程有關(guān)[13]，提示樣本取材應(yīng)該采取以肛拭子為主和咽拭子為輔的采集方案，建議在基層醫(yī)療單位中推廣。而對(duì)于仍有部分標(biāo)本檢測(cè)為陰性，應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面[14]：臨床上將相似HFMD病例誤診為HFMD病例；采集樣本時(shí)，操作不規(guī)范，未采集到或采集量不夠；運(yùn)輸和保存樣本是否不當(dāng)，病毒采樣液反復(fù)凍融導(dǎo)致核酸降解。這些都有待于今后工作中進(jìn)一步調(diào)查研究。

本研究為我市對(duì)HFMD病原學(xué)流行趨勢(shì)的判斷和預(yù)測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，并為有針對(duì)性地制定HFMD預(yù)防與控制的策略提供了思路，同時(shí)為經(jīng)濟(jì)有效地開(kāi)展工作提供了幫助。

志謝 南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院郭雪江

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