聯(lián)合應(yīng)用泛素分子基因的漢灘病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定

張 亮，于 瀾，葉 偉，李璞媛，張芳琳，程林峰

漢灘病毒（Hantaan virus,HTNV）隸屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬。1976年，韓國(guó)學(xué)者李鎬汪于該國(guó)疫區(qū)漢灘河流域黑線姬鼠的肺組織中首次成功分離該病毒[1]。該病毒主要宿主為鼠類等嚙齒類動(dòng)物，一般通過(guò)動(dòng)物排泄物污染而經(jīng)由呼吸道、消化道及破損的皮膚等途徑傳播給人類，引起腎綜合征出血熱（hemorrhagic feverwith renalsyndrome,HFRS）[2]，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、出血和急性腎損傷[3]。我國(guó)是世界上HFRS疫情最嚴(yán)重的國(guó)家之一，具有流行范圍廣、發(fā)病人數(shù)多、病死率高等特點(diǎn)[4-5]。由于HFRS的宿主廣泛，傳播途徑多，到目前為止臨床上尚缺乏特異有效的治療藥物，因此其防治任務(wù)十分艱巨。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外雖已研制出HFRS的滅活疫苗，但從應(yīng)用情況來(lái)看，該類疫苗仍存在一些不足：主要是其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力較弱，刺激機(jī)體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答欠佳以及存在一定的安全性隱患等缺點(diǎn)[6]。因此，HFRS新型基因工程疫苗的研發(fā)一直是HFRS預(yù)防領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

在HFRS基因工程疫苗的研究中，目前主要是利用HTNV包膜糖蛋白（glycoprotein,GP）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein,NP）作為抗原組分[7]。GP是HTNVM基因編碼的重要結(jié)構(gòu)蛋白，由Gn和Gc兩個(gè)糖蛋白組成，研究表明，HTNV的多數(shù)中和抗原位點(diǎn)集中在GP上，但是GP的免疫原性相對(duì)較弱，刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體出現(xiàn)較晚，且滴度不高，而中和抗體在抗HTNV感染中至關(guān)重要[8]；NP由病毒S基因編碼，雖然免疫原性強(qiáng)，但其中和抗原位點(diǎn)少，主要刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答[9-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NP的抗原位點(diǎn)主要位于HTNVS基因0.7 kb片段（即編碼NP氨基端aa1～274片段，S0.7）上，且該截短片段與完整NP對(duì)機(jī)體的免疫效果基本相同[11]。在此基礎(chǔ)上，本課題組前期構(gòu)建了含HTNV S基因0.7 kb片段與Gn或Gc基因的嵌合基因重組腺病毒（rAd－GnS0.7和rAd－GcS0.7），并對(duì)腺病毒載體進(jìn)行了改建，即將其啟動(dòng)子替換為CAG［人巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）增強(qiáng)子和β－actin啟動(dòng)子的雜合體］，構(gòu)建了新的重組腺病毒（rAd－pCAG－GnS0.7和 rAd－pCAGGcS0.7），并證明了新構(gòu)建的重組腺病毒能顯著提高HTNV嵌合基因GnS0.7和GcS0.7的表達(dá)水平[12]。

本研究擬在前期已優(yōu)化轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建含有抗原加工提呈分子泛素（ubiquitin,Ub）基因的HTNV嵌合基因GnS0.7和GcS0.7重組腺病毒，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定，以期進(jìn)一步提高嵌合基因表達(dá)抗原的加工和提呈，特別是進(jìn)一步提高刺激體液以及細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。

1 材料與方法

1.1 材料 pShuttle腺病毒轉(zhuǎn)移載體及Adeno－XTM ExpressionSystem購(gòu)自Clontech公司（Mountain View，CA，USA）。Teasy載體購(gòu)自Promega公司（Madison，WI，USA）。 pShuttle－pCAG －GnS0.7 和 pShuttlepCAG－GcS0.7重組轉(zhuǎn)移載體由本室李璞媛博士構(gòu)建[12]。pCMV－F3Ub質(zhì)粒（含泛素基因）由 J.LindsayWhitton博士（Scripps Research Institute）惠贈(zèng)。限制性內(nèi)切酶PI－SceⅠ和I－CeuⅠ購(gòu)自New England Biolabs公司。LipofectamineTM2000 Reagent購(gòu)自Invitrogen公司（Carlsbad，CA，USA）。膠回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司（大連，遼寧，中國(guó)），腺病毒滴度測(cè)定試劑盒Adeno－XTMRapid Titer Kit購(gòu)自Clontech公司。HEK293細(xì)胞由本室保存。小鼠源性mAb 6F7（抗HTNV Gn）由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心贈(zèng)送，LV48（抗HTNV Gc）由病毒病預(yù)防控制所贈(zèng)送，1A8（抗 HTNVNP）由本室制備[13]。小鼠源性的抗Ub抗體購(gòu)自億欣生物科技有限公司（上海，中國(guó)）。FITC標(biāo)記的兔抗小鼠二抗購(gòu)自中杉生物科技公司（西安，陜西，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 PCR 擴(kuò)增獲得Ub基因 依據(jù)GenBank中的Ub序列設(shè)計(jì)引物，送至金斯瑞生物科技有限公司合成（南京，江蘇，中國(guó)）。Ub forward primer：（含SfiⅠ位點(diǎn)）5'－GACGGCCTCGACGGCCATGCAGATTTTCGTGAAG－3'；Ub reverse primer：（含 Nhe Ⅰ位點(diǎn)）5'－GACGCTAGCCTACTTACTTAAGATCTG －3'。以Ub forward primer和Ub reverse primer為引物，以pCMV－F3Ub為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物與T easy載體14℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化E.coli JM109后涂布含Amp抗性的瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12 h，挑選單菌落增菌，提取質(zhì)粒后以Ub forward primer和Ub reverse primer為引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得陽(yáng)性克隆，命名為T(mén) easy－Ub，并送金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 構(gòu)建重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體 使用SfiⅠ及Nhe Ⅰ雙酶切 pShuttle－pCAG－GnS0.7、pShuttlepCAG－GcS0.7重組轉(zhuǎn)移載體和T easy－Ub質(zhì)粒，分別膠回收目的片段和載體。將載體與片段14℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化E.coli JM109后涂布含Kan抗性的瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12 h，挑單菌落增菌，提取質(zhì)粒后用SfiⅠ及NheⅠ雙酶切鑒定，獲得陽(yáng)性克隆，分別命名為pShuttle－pCAG－Ub－GnS0.7和 pShuttle－pCAG－Ub－GcS0.7（Ub 基因位于 GnS0.7和GcS0.7嵌合基因的上游）。

1.2.3 構(gòu)建重組腺病毒載體 利用限制性內(nèi)切酶PI－SceⅠ和 I－Ceu Ⅰ分別雙酶切 pShuttle－pCAGUb－GnS0.7、pShuttle－pCAG－Ub－GcS0.7 和 Adeno－XTM ViralDNA。膠回收酶切后的目的片段pCAGUb－GnS0.7、pCAG－Ub－GcS0.7 和載體 Adeno－XTMViral DNA。將載體與片段14℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化E.coli JM109后涂布含Amp抗性的瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12 h，挑單菌落增菌，提取重組腺病毒DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分別以Ub forward primer和S0.7 reverse primer（5'－GACACGCGTTTAGAGTTT －AAAGGCT－3'）為引物，對(duì)重組腺病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析得到陽(yáng)性克隆，分別命名為 rAd－pCAG－Ub－GnS0.7 和 rAd－pCAGUb－GcS0.7。

1.2.4 重組腺病毒的包裝及鑒定 利用限制性內(nèi)切酶 PacⅠ消化 rAd－pCAG－Ub－GnS0.7和 rAdpCAG－Ub－GcS0.7，使其線性化。測(cè)定濃度后與LipofectamineTM2000混合轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變（cytopathic effect,CPE）后收細(xì)胞，離心后將沉淀重懸于高壓滅菌的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution,PBS）。反復(fù)凍融3次后離心收集上清，即為重組腺病毒rAd－pCAG－Ub－GnS0.7和rAd－pCAG－Ub－GcS0.7。將重組腺病毒利用蛋白酶K消化后作為PCR的模板，以Ub forward primer和S0.7 reverse primer為引物，對(duì)重組腺病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.2.5 重組腺病毒滴度測(cè)定及表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè) 系列稀釋重組腺病毒，進(jìn)行單斑實(shí)驗(yàn)，挑單斑擴(kuò)增病毒利用Adeno-XTMRapid Titer Kit測(cè)定各重組腺病毒的滴度。感染前24 h取HEK293細(xì)胞接種于24孔板中，6×105細(xì)胞/孔。第2天以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）=100的病毒量感染細(xì)胞，1 h后吸棄病毒液，每孔加入1ml新鮮的10%新生牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)液，37℃CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸棄上清，用PBS輕柔洗滌后，加入200μl4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫放置10min。吸去多聚甲醛，用PBS輕柔洗滌3次后，加入200μl 0.5%Triton X-100室溫作用10min。吸去Triton X-100，用PBS輕柔洗滌3次后，加入200μl 3%的BSA-PBS室溫封閉30min，吸去封閉液。每孔加入200μl稀釋好的一抗（mAb Gn-4及Gc-10分別檢測(cè)Gn和Gc的表達(dá)，mAb 1A8檢測(cè)S0.7的表達(dá)，抗Ub抗體檢測(cè)Ub的表達(dá)），4℃孵育過(guò)夜。吸棄抗體，用PBS輕柔洗滌3次后分別加入FITC標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫避光孵育1 h。用PBS輕柔洗滌6次后，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 Ub基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序 以Ub forward primer和Ub reverse primer為引物，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，在約250 bp處出現(xiàn)特異條帶，與預(yù)期符合（圖1）。將陽(yáng)性克隆命名為T(mén) easy-Ub并送至金斯瑞生物科技進(jìn)行測(cè)序，利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的BLAST工具與預(yù)先獲得的Ub序列信息進(jìn)行比對(duì)，一致性達(dá)100%。

圖1 重組質(zhì)粒T easy-Ub的PCR鑒定結(jié)果A.DL2000 DNAmaker；B.Teasy-Ub PCR 產(chǎn)物Figure 1 PCR products of recombinant plasm id T easy-Ub

2.2 重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體的鑒定 使用限制性內(nèi)切酶SfiⅠ及NheⅠ雙酶切重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體pShuttle-pCAG-Ub-GnS0.7和pShuttle-pCAG-Ub-GcS0.7。如載體構(gòu)建正確，可將Ub基因（長(zhǎng)度250bp）從載體中切下。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，在約250 bp處可見(jiàn)特異條帶，與預(yù)期相符（圖2）。

圖2 重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體酶切鑒定結(jié)果A.DL2000 DNAmaker；B.pShuttle-pCAG-Ub-GnS0.7；C.pShuttle-pCAG-Ub-GcS0.7Figure 2 Restriction enzyme analysis of recombinant adenoviral transfer vectors

2.3 重組腺病毒載體的鑒定 重組腺病毒載體rAd-pCAG-Ub-GnS0.7和rAd-pCAG-Ub-GcS0.7分別以 Ub forward primer和 S0.7 reverse primer為引物進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增Ub-GnS0.7和Ub-GcS0.7片段，理論長(zhǎng)度為2880 bp和2580 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約3000 bp和2500 bp處出現(xiàn)特異條帶，與預(yù)期相符（圖3）。

圖3 重組腺病毒DNA PCR鑒定結(jié)果A.DNA wide range maker；B.rAd-pCAG-Ub-GcS0.7；C.rAdpCAG-Ub-GnS0.7Figure 3 PCR products of recombinant adenoviral DNA

2.4 重組腺病毒的鑒定 包裝獲得的重組腺病毒rAd-pCAG-Ub-GnS0.7和rAd-pCAG-Ub-GcS0.7經(jīng)過(guò)蛋白酶K消化后分別以Ub forward primer和S0.7 reverse primer為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約3000 bp和2500 bp處出現(xiàn)特異條帶，與預(yù)期相符（圖4）。

2.5 HEK293細(xì)胞的CPE現(xiàn)象 重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞1周后，細(xì)胞皺縮變圓并逐漸脫落，隨著病毒的增殖，細(xì)胞核占據(jù)了細(xì)胞的大部分，此時(shí)出現(xiàn)明顯CPE（圖5）。

圖4 重組腺病毒PCR鑒定結(jié)果A.DNA wide rangemaker；B.rAd－pCAG－Ub－GcS0.7；C.rAdpCAG－Ub－GnS0.7Figure 4 PCR products of recombinant adenovirus

圖6 重組腺病毒rAd-pCAG-Ub-GnS0.7的免疫熒光鑒定結(jié)果（×200）A.mAb Gn－4檢測(cè)結(jié)果；B.mAb 1A8檢測(cè)結(jié)果；C.抗Ub抗體檢測(cè)結(jié)果；D.正常對(duì)照（采用上述3種抗體混合物檢測(cè)）Figure 6 Indirect immunofluorescence assay of HEK 293 cells infected w ith recombinant adenoviruses rAd-pCAGUb-GnS0.7 （×200）

圖7 重組腺病毒rAd-pCAG-Ub-GcS0.7的免疫熒光鑒定結(jié)果（×200）A.mAb Gc－10檢測(cè)結(jié)果；B.mAb 1A8檢測(cè)結(jié)果；C.抗 Ub抗體檢測(cè)結(jié)果；D.正常對(duì)照（采用上述3種抗體混合物檢測(cè)）Figure 7 Indirect immunofluorescence assay of HEK 293 cells infected w ith recombinant adenoviruses rAd-pCAGUb-GcS0.7 （×200）

圖5 HEK 293細(xì)胞的CPE現(xiàn)象（×40）A.未轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞對(duì)照；B.轉(zhuǎn)染1周后細(xì)胞出現(xiàn)CPE；C.單獨(dú)添加轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照Figure 5 CPE of HEK 293 transfected w ith recombinant adenoviral DNA （×40）

2.6 表達(dá)產(chǎn)物的免疫熒光檢測(cè) 采用免疫熒光法，對(duì)重組腺病毒 rAd－pCAG－Ub－GnS0.7 和 rAdpCAG－Ub－GcS0.7感染HEK293細(xì)胞后目的蛋白（Gn、Gc、S0.7和Ub）的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示均可見(jiàn)特異性綠色熒光，證明重組腺病毒rAdpCAG－Ub－GnS0.7 和 rAd－pCAG－Ub－GcS0.7 成功表達(dá)了各目的蛋白（圖6～7）。

3 討 論

Ub－蛋白酶復(fù)合體通路是細(xì)胞內(nèi)源性蛋白降解的主要途徑，同時(shí)也是內(nèi)源性抗原加工、處理和提呈的主要途徑。Ub是一種由76個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)分子，其C端為Gly。當(dāng)要降解的底物蛋白被識(shí)別后，Ub末位Gly與靶蛋白上的Lys殘基共價(jià)結(jié)合，形成多聚Ub－底物蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物最終被蛋白酶體降解。細(xì)胞內(nèi)蛋白降解時(shí)須連接Ub分子。Ub－蛋白酶體系統(tǒng)（Ub－proteasome system,UPS）參與免疫反應(yīng)的直接體現(xiàn)是UPS在APC通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex,MHC）－Ⅰ途徑提呈抗原的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在抗原肽的提呈過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的肽段密度是決定MHC－Ⅰ類復(fù)合物成熟的重要因素。增強(qiáng)肽段的遞送可加快細(xì)胞表面成熟的MHC－Ⅰ類復(fù)合物的表達(dá)。目前已確定通過(guò)MHC－Ⅰ類途徑提呈的肽段大部分都是通過(guò)UPS產(chǎn)生的[14]。UPS中的一種環(huán)狀多片層結(jié)構(gòu)蛋白PA28，可結(jié)合到UPS的核心蛋白酶－20S的末端，極大地增強(qiáng)UPS水解寡肽的能力，從而產(chǎn)生適合MHC－Ⅰ提呈的低聚肽[15]。UPS系統(tǒng)還可使寡肽產(chǎn)生MHC－Ⅰ提呈所需的特異的C末端，之后由細(xì)胞質(zhì)中的氨基肽酶對(duì)寡肽的N末端進(jìn)行修飾使其適合與MHC－Ⅰ結(jié)合。

UPS還與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。核因子Kappa B（nuclear factor－kappa B,NF－κB） 是許多促炎癥細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)劑，NF－κB 的激活受 UPS 的調(diào)節(jié)，NF－κB的前體較大，須經(jīng)過(guò)UPS的降解修飾成為有功能的NF－κB。此外，NF－κB 由于在正常狀態(tài)下被 IκB 結(jié)合而活性受到抑制，UPS使IκB泛素化，使NF－κB的核定位信號(hào)暴露，NF－κB轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮特異性轉(zhuǎn)錄因子的作用，激活應(yīng)答炎癥與感染的基因，產(chǎn)生細(xì)胞因子、炎癥應(yīng)答蛋白、免疫受體等[16]。因此，Ub直接關(guān)系著MHC－Ⅰ類復(fù)合物的形成及免疫調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響著細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）途徑。Rodriguez 等[17]研究發(fā)現(xiàn)將Ub與淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒抗原共同表達(dá)，可提高該抗原在細(xì)胞內(nèi)的降解，使更多肽段進(jìn)入MHC-Ⅰ類抗原提呈途徑，增加進(jìn)入MHC-Ⅰ途徑的表位肽，從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的MHC-Ⅰ限制的CTL和Thl類細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞免疫反應(yīng)。Wang等[18]將結(jié)核分枝桿菌的ESAT-6基因與Ub基因融合后構(gòu)建DNA疫苗，測(cè)定其Th1型細(xì)胞因子的水平及T淋巴細(xì)胞增殖現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)其指標(biāo)均高于未融合Ub基因組，同時(shí)其IgG2a、IgG1及CTL的水平也得到提高。Brandsma等[19]將兔乳頭瘤病毒的早期基因與Ub基因構(gòu)建入真核表達(dá)載體，導(dǎo)入后可抑制無(wú)癥狀感染兔體內(nèi)乳頭瘤的發(fā)生，已感染并且產(chǎn)生乳頭瘤的兔體內(nèi)的腫瘤體積也可通過(guò)注射該載體而顯著減小。研究顯示將Ub基因與抗原基因融合表達(dá)時(shí)，須使Ub基因位于抗原基因的上游，在表達(dá)后即可形成穩(wěn)定的poly-Ub-antigen復(fù)合物，迅速被蛋白酶復(fù)合體識(shí)別，進(jìn)入降解與提呈階段。Tang等[20]將Ub基因和旋毛蟲(chóng)抗原基因構(gòu)建入pVAX載體，免疫機(jī)體后測(cè)定其Th1型細(xì)胞因子的水平，發(fā)現(xiàn)其指標(biāo)均高于未融合Ub基因組，且CTL的水平也得到有效提高。Ou等[21]構(gòu)建了含有Derp1基因與Ub基因的DNA疫苗，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)Ub可以大大提高該DNA疫苗的免疫效力。本研究基于上述研究結(jié)果將Ub基因構(gòu)建在HTNV嵌合抗原基因的上游，以期進(jìn)一步提高嵌合基因表達(dá)抗原的加工和提呈以及刺激機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答的能力。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)構(gòu)建的含有Ub基因的HTNV嵌合基因GnS0.7和GcS0.7重組腺病毒均能很好地表達(dá)融合蛋白，下一步我們將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證Ub是否能夠有效地促進(jìn)HTNV融合蛋白GnS0.7和GcS0.7刺激機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答。

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