章強(qiáng)，辛琦，強(qiáng)麗媛，程金平,*

1. 華東師范大學(xué)河口海岸學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200062 2. 香港城市大學(xué)深圳研究院，深圳 518057

銅及其與四環(huán)素的聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng)

章強(qiáng)1,2，辛琦1,2，強(qiáng)麗媛1，程金平1,2,*

1. 華東師范大學(xué)河口海岸學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200062 2. 香港城市大學(xué)深圳研究院，深圳 518057

近年來(lái)工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中銅和四環(huán)素的濫用，導(dǎo)致了一定程度的水環(huán)境污染問(wèn)題。為探究銅與四環(huán)素對(duì)水生生物的毒害作用，選擇斑馬魚作為受試生物，研究了銅及其與四環(huán)素的聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng)，并進(jìn)一步探索了其中可能的致毒機(jī)制。結(jié)果表明：銅在低濃度下(10%致死濃度LC10=2.5 μg·L-1，10%效應(yīng)濃度EC10=0.1 μg·L-1)明顯延遲了斑馬魚胚胎的孵化、卵黃囊吸收、頭部、魚鰾和體長(zhǎng)等生長(zhǎng)指標(biāo)的發(fā)育，同時(shí)在心臟區(qū)域引起了明顯的細(xì)胞凋亡效應(yīng)。幼魚體內(nèi)總銅含量檢測(cè)結(jié)果顯示低濃度下銅的生物利用度相對(duì)更高?；虮磉_(dá)結(jié)果顯示環(huán)境濃度的銅可能通過(guò)影響神經(jīng)和心臟相關(guān)基因的表達(dá)引起斑馬魚胚胎的神經(jīng)發(fā)育和心臟發(fā)育異常。銅和四環(huán)素的聯(lián)合暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二者的復(fù)合污染類型為拮抗作用，且兩者相互作用可以形成絡(luò)合物。綜合以上結(jié)論，說(shuō)明環(huán)境濃度的銅可能通過(guò)細(xì)胞凋亡、分子水平的變化等方式對(duì)水生生物的早期生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生危害，如延遲生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)及心臟發(fā)育異常，另外銅可通過(guò)和四環(huán)素等環(huán)境中其他污染物的結(jié)合改變銅的生物有效性和毒性。

銅；四環(huán)素；絡(luò)合物；斑馬魚胚胎；神經(jīng)發(fā)育；心臟發(fā)育

銅是自然環(huán)境中大量存在的一種過(guò)渡元素。天然水體中的銅主要來(lái)自于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生活廢水的污染和水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中高銅和魚藥硫酸銅的大量使用。在現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)中，銅被廣泛應(yīng)用于機(jī)械、電子、能源、石化和養(yǎng)殖等行業(yè)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年全球的精銅消費(fèi)量為19.9百萬(wàn)t，而中國(guó)的精銅消費(fèi)量更是從2001年的2.2百萬(wàn)t增長(zhǎng)到2011年的7.8百萬(wàn)t，年平均增長(zhǎng)率約為13%[1]。如此大的消費(fèi)量必然會(huì)日益增加自然環(huán)境的承載量。全球范圍內(nèi)，銅在天然海水和淡水中的濃度水平分別為0.03～0.23 μg·L-1和0.20～30 μg·L-1[2]。近年在我國(guó)很多水環(huán)境中已檢測(cè)到高濃度銅的存在，如在渤海灣水域中最高濃度甚至能達(dá)到2.8 mg·L-1[3]。另外銅作為一種重金屬元素，它在生態(tài)系統(tǒng)中既不能被分解，也不能被消除[4]，所以沉積相中的銅也會(huì)成為水體中銅的污染源之一，導(dǎo)致銅的水體污染具有持久性，因此受到環(huán)境科學(xué)界的廣泛關(guān)注。

銅是許多酶類(如賴氨酰氧化酶、超氧化物歧化酶和細(xì)胞色素C氧化酶等)的主要構(gòu)成成分之一[5]，所以它是水生動(dòng)物必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，但高濃度的銅將變成一種抑制物或毒性物質(zhì)[6]，銅超過(guò)一定濃度就會(huì)成為環(huán)境污染物。因此調(diào)查銅在環(huán)境中的濃度和生物可利用性非常重要。生物體內(nèi)的銅含量往往能較好地反映水環(huán)境中銅的污染程度。近年來(lái)有多篇文獻(xiàn)記載了我國(guó)多地牡蠣中的銅含量。Wang等[7]首次報(bào)道了我國(guó)的“藍(lán)牡蠣”現(xiàn)象，調(diào)查發(fā)現(xiàn)福建省九龍江口香港巨牡蠣(Crassostrea hongkongensis)的銅濃度為14.4 mg·g-1，肉組織呈現(xiàn)藍(lán)色。一般水環(huán)境中銅的存在形態(tài)包括溶解態(tài)(溶解于水中)和顆粒態(tài)(存在于懸移質(zhì)中的懸移態(tài)及存在于表層沉積物中的沉積態(tài))。溶解態(tài)的銅又可以以自由離子、顆粒態(tài)、有機(jī)物或無(wú)機(jī)離子的結(jié)合態(tài)存在，其中自由銅離子(Cu2+)被認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的形態(tài)。已有的毒理學(xué)研究表明一定濃度的銅離子會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生毒害作用[8-9]。魚類早期發(fā)育階段(胚胎和仔、稚、幼魚)是對(duì)各種污染物最為敏感的階段之一[10]。較低劑量的銅離子就可抑制胚胎的發(fā)育[11]，且銅離子可穿過(guò)絨毛膜在胚胎內(nèi)的不斷積累，對(duì)胚胎造成較強(qiáng)的致畸作用[12-14]，如胚胎尾巴彎曲、孵化失敗和胚胎死亡等[12]。大多數(shù)重金屬都有生殖毒性，銅也不例外。銅離子可以通過(guò)延緩性成熟[15]、降低受精率[16]、產(chǎn)卵量減少[17]等方式來(lái)抑制水生動(dòng)物的繁殖。銅離子對(duì)斑馬魚胚胎早期發(fā)育的影響主要表現(xiàn)在抑制孵化、抑制生長(zhǎng)發(fā)育和心率加快等方面[9]。但目前銅對(duì)水生生物的毒理機(jī)制研究還不完善，本文主要針對(duì)銅對(duì)魚類胚胎的毒性效應(yīng)及其分子機(jī)制展開研究。

在天然水體環(huán)境中，顆粒態(tài)銅的存在形態(tài)可分為離子交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、鐵錳水合氧化物結(jié)合態(tài)、有機(jī)硫化物結(jié)合態(tài)及殘?jiān)鼞B(tài)，前3種形態(tài)對(duì)生物有潛在有效性，后2種不易被生物吸收利用。而水體中存在大量的陰離子配位體、膠體及有機(jī)顆粒，易與自由態(tài)的銅離子結(jié)合形成不易被生物吸收的形態(tài)[18]。在自然環(huán)境特別是水環(huán)境中，重金屬污染往往以復(fù)合污染的形式出現(xiàn)，復(fù)合污染的多樣性使得污染物的形態(tài)和毒性效應(yīng)更為復(fù)雜。鑒于在養(yǎng)殖業(yè)中四環(huán)素也常作為治療藥物和飼料添加劑，我們通過(guò)文獻(xiàn)資料的調(diào)研，發(fā)現(xiàn)目前我國(guó)的部分水域中同時(shí)存在高濃度的溶解性銅和四環(huán)素。如在黃浦江水域，檢測(cè)出溶解性銅的濃度能達(dá)到22.9 μg·L-1[19]，并且四環(huán)素最高能達(dá)到1 000.0 μg·L-1[20]。因此，我們進(jìn)一步研究了銅離子與四環(huán)素的復(fù)合污染。

現(xiàn)有的文獻(xiàn)研究也表明四環(huán)素類抗生素能夠抑制水生動(dòng)物多種酶的活性，如乙氧基試鹵靈-O-去乙基酶、β-半乳糖苷酶等，并可能產(chǎn)生免疫毒性和基因毒性[21-23]，這說(shuō)明四環(huán)素類抗生素對(duì)水生生物產(chǎn)生的環(huán)境效應(yīng)不容忽視。此前也有研究表明，相比于銅的單一毒性，銅和四環(huán)素的聯(lián)合毒性變?nèi)趿薣24]。但目前對(duì)此類復(fù)合污染的毒性研究還十分有限。本文選取斑馬魚胚胎作為模式生物開展了銅對(duì)斑馬魚胚胎的毒性機(jī)制研究及銅和四環(huán)素復(fù)合污染的初步探索。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

四環(huán)素(tetracycline，純度90%)購(gòu)自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司，CuSO4·5H2O(純度98%)、麻醉劑(tricaine)和RNA later試劑購(gòu)于西格瑪奧爾德里奇公司，其他試劑(分析純)均購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

多功能光照培養(yǎng)箱(BSP-100，上海，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)、體視顯微鏡(SMZ168，廈門，Motic)、Leica熒光體視鏡(M165FC，德國(guó)，Leica)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI-7500，美國(guó)，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 斑馬魚胚胎的收集和急性暴露實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

健康良好的野生型斑馬魚成魚購(gòu)于花鳥市場(chǎng)。本次用于魚卵采集的成魚已在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)3個(gè)月以上，光周期為14 h/10 h(晝/夜)。每天喂食豐年蝦幼蟲2次，每天清理殘餌和糞便。養(yǎng)殖水為充分曝氣、除氯24 h以上的自來(lái)水。水質(zhì)條件為：pH(7±0.5)，溶解氧為(8±0.5) mg·L-1，硬度(230±0.5) mg·L-1(以CaCO3計(jì))，水溫控制在(28±0.5) ℃。胚胎培養(yǎng)水(ISO 6341-1982)：稱取0.294 g CaCl2·2H2O，0.123 g MgSO4·7H2O，0.065 g NaHCO3和0.006 g KCl溶于充分曝氣的1 L去離子水中，作為實(shí)驗(yàn)稀釋液和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)用水。選用飼養(yǎng)3個(gè)月以上的成魚用于產(chǎn)卵。在繁殖前1天，將雌魚和雄魚以1:2的比例放入孵化盒中。設(shè)定好開燈時(shí)間，第2天開燈30 min內(nèi)斑馬魚產(chǎn)卵完成。用胚胎培養(yǎng)水沖洗胚胎，在體視鏡下挑取受精正常的胚胎用于暴露實(shí)驗(yàn)。

斑馬魚胚胎毒性實(shí)驗(yàn)根據(jù)斑馬魚實(shí)驗(yàn)用書[25]進(jìn)行。在體視顯微鏡下挑選受精后正常發(fā)育4 hpf(hours post-fertilization，hpf)的胚胎進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)選用的是12孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為染毒器具，每個(gè)孔中盛4 mL的溶液和20顆正常發(fā)育的受精卵，每個(gè)濃度4個(gè)平行，共80枚胚胎，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)四環(huán)素設(shè)置3個(gè)濃度(10，100，1 000 μg·L-1)，銅設(shè)置4個(gè)濃度(2.56 μg·L-1，25.6 μg·L-1，128 μg·L-1，256 μg·L-1)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，銅單一毒性及其和四環(huán)素的聯(lián)合毒性暴露同時(shí)進(jìn)行，濃度組成分別為0，銅(2.56 μg·L-1，25.6 μg·L-1，128 μg·L-1，256 μg·L-1)，銅和四環(huán)素(2.56+10，2.56+100，2.56+1000；25.6+10，25.6+100，25.6+1000；128+10，128+100，128+1000；256+10，256+100，256+1000)μg·L-1。

為避免藥物因?yàn)楣庹斩到?，將受試胚胎置于黑暗培養(yǎng)箱中，溫度為(28±1)℃。24 h更換1次溶液。暴露過(guò)程中的死亡胚胎和幼魚及時(shí)丟棄，避免對(duì)其他的胚胎和幼魚產(chǎn)生影響。暴露周期為96 hpf，記錄了24 hpf、48 hpf、72 hpf、96 hpf的死亡率、72 hpf孵化率。其中暴露96 hpf后的胚胎用0.016 mol·L-1的Tricaine進(jìn)行麻醉，之后在顯微鏡下拍照，用于統(tǒng)計(jì)96 hpf的畸形率和表型。其中死亡率為死亡數(shù)與胚胎總數(shù)之比，孵化率為72 hpf的總孵化數(shù)與胚胎總數(shù)之比，用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)斑馬魚幼魚的體長(zhǎng)、卵黃囊以及腦部面積。

1.3 暴露溶液和魚體內(nèi)吸收的總銅含量分析

將暴露96 h后的斑馬魚幼魚用胚胎培養(yǎng)水清洗2次后，在體視鏡下將斑馬魚幼魚的頭部和軀干分開，收集進(jìn)行稱重，然后參照文獻(xiàn)[26]的方法進(jìn)行樣品的前處理。首先，用2 mL濃硝酸對(duì)斑馬魚進(jìn)行消解2 h(180 ℃)，之后再加入1 mL的30% H2O2持續(xù)1 h(120 ℃)。然后在樣品中加入去離子水，使硝酸濃度稀釋到體積分?jǐn)?shù)為2%，最后用ICP-MS(Element 2，美國(guó)，賽默飛世爾科技公司)檢測(cè)魚體內(nèi)的總銅含量。在檢測(cè)暴露溶液中的銅元素前，應(yīng)用孔徑為2.0 nm的超濾管進(jìn)行過(guò)濾，以去除溶液中絡(luò)合物等形態(tài)的銅，過(guò)濾后的溶液中基本上都是銅離子，然后再應(yīng)用ICP-MS進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 Acridine orange (AO)染色

本文應(yīng)用AO染色來(lái)反映銅離子是否導(dǎo)致斑馬魚胚胎產(chǎn)生細(xì)胞凋亡，及產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的區(qū)域。參考其他文獻(xiàn)的方法[27]，經(jīng)過(guò)不同濃度的銅暴露96 h后，每個(gè)濃度隨機(jī)取10條幼魚，在質(zhì)量百分比為30%的Danieau溶液(58 mmol·L-1NaCl, 0.7 mmol·L-1KCl, 0.4 mmol·L-1MgSO4, 0.6 mmol·L-1Ca(NO3)2, 5 mmol·L-1HEPES, pH 7.4)中清洗2次，再轉(zhuǎn)移到含有5 μg·mL-1AO的30%Danieau溶液中，在室溫下避光振蕩20 min。然后再于30% Danieau溶液中清洗3次，每次5 min。之后用0.016 mol·L-1的Tricaine麻醉胚胎3 min，然后用Leica熒光體視鏡進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，有凋亡的細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)明顯的亮點(diǎn)。

1.5 基因表達(dá)分析

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)研究了銅對(duì)斑馬魚在分子水平上是否影響神經(jīng)和心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。96 hpf后收集保存于-20 ℃的RNA later中的胚胎，每個(gè)濃度有3個(gè)平行，每個(gè)平行20個(gè)胚胎。然后用Qiagen的RNA提取試劑盒(Qiagen，China Co., Ltd，上海，中國(guó))提取總RNA，再用紫外熒光分光光度計(jì)(SMA4000，Merioton)進(jìn)行總RNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)，參照說(shuō)明書再使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，Dalian，Japan)合成cDNA。斑馬魚β-actin基因被選為參照基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的歸一化。在NCBI官網(wǎng)上進(jìn)行引物序列的設(shè)計(jì)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)(表1)。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI-7500)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用2-△△CT方法進(jìn)行基因表達(dá)倍數(shù)的分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 17.0軟件 (SPSS, Chicago, IL, USA)計(jì)算EC10和LC10，顯著性分析之前用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊次檢驗(yàn)，然后用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行對(duì)照組和處理組的顯著性分析。百分比的數(shù)據(jù)先轉(zhuǎn)換為平方根的反正弦，再進(jìn)行ANOVA分析。采用雙因子方差分析法來(lái)評(píng)價(jià)銅和四環(huán)素的聯(lián)合作用。當(dāng)P<0.05時(shí)，說(shuō)明2個(gè)因素具有協(xié)同或者拮抗作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示。當(dāng)P<0.05時(shí)具有顯著性差異。用Graphpad Prism 5.0作圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 銅對(duì)斑馬魚胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的影響

生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)指標(biāo)的表型和數(shù)據(jù)如圖1和表2所示。96 h周期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，濃度大于25.6 μg·L-1的銅可以顯著增加斑馬魚胚胎的死亡，其中在25.6 μg·L-1、128 μg·L-1和256 μg·L-1下的死亡率分別為31.5%、34.8%和46.7%。從亞致死效應(yīng)方面來(lái)看，銅能夠顯著抑制斑馬魚胚胎的發(fā)育，主要表現(xiàn)在抑制孵化、體長(zhǎng)、腦部發(fā)育、卵黃囊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和魚鰾的生成等效應(yīng)。當(dāng)銅濃度達(dá)到2.56 μg·L-1就顯著抑制了這些生長(zhǎng)指標(biāo)的發(fā)育，其中孵化率在對(duì)照組能達(dá)到97.7%，而2.56 μg·L-1處理組的孵化率只有23.0%，更高濃度組沒(méi)有幼魚孵化。96 h正常發(fā)育的幼魚體長(zhǎng)為3.8 mm，銅的4個(gè)濃度處理組的體長(zhǎng)都顯著受到了抑制，分別為3.5，3.5，3.4，3.4 mm。另外，經(jīng)銅處理后的幼魚的卵黃囊吸收明顯受到抑制，卵黃囊面積明顯比對(duì)照組大。銅的急性暴露結(jié)果表明，高于2.56 μg·L-1的銅顯著抑制了幼魚魚鰾的發(fā)育，256 μg·L-1處理組無(wú)魚鰾形成。有研究表明銅離子對(duì)斑馬魚胚胎的24 h的LC50為319.4 μg·L-1[28]，硫酸銅對(duì)斑馬魚成魚96 h的LC50為375.0 μg·L-1[29]。本文數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明銅對(duì)斑馬魚胚胎的96 h的LC10和EC10分別為2.5 μg·L-1和0.1 μg·L-1。

表1 應(yīng)用在本研究中的基因的引物序列Table 1 Gene and sequence of forward (Fw) and reverse (Rv) primers used in this study

圖1 銅處理96 hpf后，斑馬魚幼魚的表型圖

表2 銅對(duì)斑馬魚胚胎各指標(biāo)的影響Table 2 Effects of Cu on the total mortality, hatching and morphologies of zebrafish embryos/larvae

注: a, 數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=4); b, 顯著性分析使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001。

Note: a, All values were presented as the mean ± standard error; b, Significant differences between mean values were determined using one-way analysis of variance (ANOVA),*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

2.2 AO染色

AO染色是一種核酸染色技術(shù)，已有文獻(xiàn)表明AO染色可以反映細(xì)胞凋亡情況[27,30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：發(fā)育到96 hpf時(shí)，在正常胚胎中無(wú)明顯的凋亡信號(hào)，但是有大量的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)在處理組的胚胎(銅，2.56，25.6和128 μg·L-1)的心臟區(qū)域(圖2b，2c，2d)。另外，還有少量的凋亡細(xì)胞集中在幼魚的尾部，尤其是在2.56 μg·L-1的銅處理組。

圖2 銅處理96 hpf后，斑馬魚幼魚的AO染色圖

2.3 斑馬魚幼魚體內(nèi)總銅含量

ICP-MS的結(jié)果顯示包括對(duì)照組的所有幼魚體內(nèi)都有檢測(cè)到銅的存在(圖3)，這可能是因?yàn)樽匀凰w中也存在一定濃度的銅。魚體內(nèi)總銅含量隨著銅暴露濃度的升高而增加，對(duì)照組幼魚體內(nèi)總銅平均含量為0.08 μg·g-1，處理組分別為0.14，0.16，0.20，0.26 μg·g-1。其中，25.6 μg·L-1，128 μg·L-1和256 μg·L-1處理組的幼魚體內(nèi)總銅含量有顯著性提高。然而，斑馬魚胚胎體內(nèi)總銅含量并沒(méi)有隨暴露濃度的升高而成比例增加。即銅在較低濃度時(shí)生物可利用性相對(duì)更高，高濃度時(shí)雖然體內(nèi)總量增多，但是吸收率反而較低。

斑馬魚幼魚不同部位的總銅含量如圖4所示。

圖3 暴露96 hpf后，幼魚體內(nèi)總銅的檢測(cè)含量

圖4 斑馬魚胚胎暴露于Cu 96 hpf后，幼魚不同部位總銅的檢測(cè)含量

結(jié)果顯示，在銅處理組的幼魚的腦部和軀干部位的總銅含量是隨著銅暴露濃度升高而增加；在對(duì)照組和所有處理組的幼魚腦部的總銅的含量都比軀干部位要高，說(shuō)明斑馬魚胚胎吸收銅后主要富集于腦部。

2.4 對(duì)胚胎神經(jīng)和心臟發(fā)育相關(guān)基因的影響

斑馬魚胚胎早期發(fā)育的前96 hpf是斑馬魚神經(jīng)和心臟發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期。從表型圖可以看出銅導(dǎo)致幼魚的頭部變小(圖1和表2)，而神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是頭部發(fā)育過(guò)程中重要的組成部分，因此本文選取了神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因來(lái)研究銅在分子水平上對(duì)斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育的影響(圖5)。結(jié)果表明，Gfap基因在2.56 μg·L-1的銅處理組下的表達(dá)顯著被抑制，而在25.6 μg·L-1和128 μg·L-1下顯著上調(diào)表達(dá)；2.56 μg·L-1的銅顯著刺激了HuC基因的表達(dá)量；Ngn1基因在銅的低濃度組(2.56 μg·L-1和25.6 μg·L-1)下表達(dá)顯著上調(diào)。

圖5 銅暴露96 hpf后，斑馬魚胚胎神經(jīng)和心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況

在心臟發(fā)育方面，斑馬魚胚胎的心率加快[9]和心臟區(qū)域的細(xì)胞凋亡說(shuō)明了銅可能導(dǎo)致斑馬魚胚胎心臟發(fā)育異常?；虮磉_(dá)結(jié)果也證實(shí)了銅可以顯著改變心臟相關(guān)基因的表達(dá)，25.6 μg·L-1的銅能顯著刺激Nkx2.5和Bmp2b基因的表達(dá)，而Gata5基因在銅所有濃度組都顯著下調(diào)了。

2.5 銅和四環(huán)素的聯(lián)合毒性效應(yīng)及作用機(jī)制

銅和四環(huán)素的聯(lián)合暴露毒性數(shù)據(jù)如圖6顯示，死亡率(圖6a)的結(jié)果顯示，在沒(méi)有加入四環(huán)素時(shí)，256 μg·L-1的銅對(duì)斑馬魚胚胎96 h的死亡率為46.7%，但加入1 000 μg·L-1的四環(huán)素后，死亡率降低為36.7%。在孵化率方面(圖6b)，2.56 μg·L-1處理組的孵化率為23.0%，當(dāng)加入不同濃度的四環(huán)素后，聯(lián)合暴露組的孵化率都顯著性地上升，分別為50.6%，63.9%和64.4%。其他指標(biāo)如頭部面積和卵黃囊面積(圖6c,6d)方面，四環(huán)素的加入明顯在不同程度上顯著促進(jìn)了這些指標(biāo)的發(fā)育。

ICP-MS檢測(cè)結(jié)果顯示在聯(lián)合暴露組中，2.56、25.6和128 μg·L-1銅處理組的幼魚體內(nèi)總銅含量并沒(méi)有受到四環(huán)素的影響，但已經(jīng)顯示出總銅含量降低的趨勢(shì)，在銅的最高濃度組(256 μg·L-1)中，加入四環(huán)素(100 μg·L-1和1 000 μg·L-1)后顯著降低了幼魚體內(nèi)吸收的總銅含量(圖7)。

利用雙因子方差對(duì)聯(lián)合暴露的數(shù)據(jù)分析后，本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合暴露的毒性指標(biāo)，如死亡率、孵化率、卵黃囊和頭部面積等效應(yīng)都顯著低于銅的單獨(dú)暴露組(P<0.05)，斑馬魚幼魚體內(nèi)吸收的總銅含量顯示了四環(huán)素的加入明顯降低了斑馬魚幼魚體內(nèi)吸收的總銅含量，這些聯(lián)合暴露的數(shù)據(jù)表明四環(huán)素的加入明顯緩解了銅對(duì)斑馬魚胚胎的毒性，因此推測(cè)銅和四環(huán)素的復(fù)合污染效應(yīng)屬于拮抗作用。已有文獻(xiàn)通過(guò)紅外光譜技術(shù)證實(shí)了土霉素和銅離子相互作用可以形成一種新的化學(xué)結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物[31]，我們根據(jù)聯(lián)合毒性的表型效應(yīng)和幼魚體內(nèi)吸收的總銅含量，推測(cè)銅離子和四環(huán)素相互作用可能形成如圖8所示的絡(luò)合物，而這種絡(luò)合物形態(tài)的銅降低了銅的生物可利用性，其毒性比銅離子的毒性要低。

為了驗(yàn)證四環(huán)素和銅離子相互作用形成絡(luò)合物的假設(shè)，本文進(jìn)一步檢測(cè)了銅的單獨(dú)及復(fù)合污染的生物可利用濃度(圖9)。檢測(cè)結(jié)果顯示2.56和25.6 μg·L-1的銅的暴露溶液中銅的實(shí)際濃度為3.8和24.8 μg·L-1，當(dāng)加入100 μg·L-1的四環(huán)素后，兩者混合溶液中銅的實(shí)際濃度為2.3和21.9 μg·L-1，分別下降了44.2%和11.7%。聯(lián)合暴露溶液比銅的單獨(dú)暴露溶液中的銅濃度低，表明四環(huán)素明顯降低了銅的生物可利用濃度，即降低了溶液中的銅離子濃度，從而證實(shí)了四環(huán)素和銅相互作用形成了新的絡(luò)合物。并且檢測(cè)結(jié)果與聯(lián)合毒性的表型效應(yīng)以及斑馬魚幼魚體內(nèi)吸收的總銅含量是相吻合的。以孵化率為例，100 μg·L-1的四環(huán)素和2.56及25.6 μg·L-1銅的聯(lián)合暴露組的孵化率明顯比銅的單獨(dú)暴露組的孵化率要高。

3 討論(Discussion)

本研究選取了受精后4 h的斑馬魚胚胎用于銅的暴露試驗(yàn)，在致死毒性方面，不同時(shí)間段的死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明銅對(duì)胚胎的致死率在4～24 hpf時(shí)間段最高，因?yàn)榇藭r(shí)間段是斑馬魚胚胎的原腸胚期和細(xì)胞分裂階段，相關(guān)研究表明此階段是魚類發(fā)育的關(guān)鍵期[32]，選取發(fā)育初期階段的斑馬魚胚胎用于水體污染物的毒性效應(yīng)研究更為靈敏。

銅對(duì)斑馬魚胚胎的亞致死毒性效應(yīng)方面，主要表現(xiàn)為孵化延遲、體長(zhǎng)變短、卵黃囊吸收不全和魚鰾缺失等效應(yīng)，本文的研究結(jié)果在其他文獻(xiàn)中也有報(bào)道[9,33]。孵化是斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中最明顯的發(fā)育指標(biāo)之一，本文結(jié)果顯示2.56 μg·L-1的銅就可以明顯抑制斑馬魚胚胎的孵化。斑馬魚胚胎的孵化主要是由生物酶、滲透作用和機(jī)械過(guò)程的結(jié)合導(dǎo)致的[34]，因此銅引起的孵化延遲和失敗可能是這些機(jī)制中的一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致的。卵黃囊是斑馬魚胚胎前期發(fā)育的唯一營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，一般卵黃囊體積是隨著胚胎的發(fā)育而減小的，當(dāng)斑馬魚胚胎卵黃囊中的營(yíng)養(yǎng)吸收受到影響后，就會(huì)抑制斑馬魚胚胎的發(fā)育，本文的結(jié)果顯示環(huán)境濃度的銅可以顯著抑制斑馬魚的營(yíng)養(yǎng)吸收，卵黃囊的面積明顯比正常發(fā)育胚胎的卵黃囊大。魚鰾在斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)斑馬魚游泳和保持平衡方面起著很重要的作用[35]。在本研究中，環(huán)境濃度的銅明顯抑制了斑馬魚胚胎魚鰾的形成。本研究統(tǒng)計(jì)以上毒性數(shù)據(jù)分析得到銅對(duì)斑馬魚胚胎的96 h-LC10和EC10分別為2.5 μg·L-1和0.1 μg·L-1，再結(jié)合環(huán)境中銅的濃度，說(shuō)明目前水環(huán)境中存在的銅可以影響較為敏感的小型魚類早期的生長(zhǎng)發(fā)育，并可能對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一定的風(fēng)險(xiǎn)。而ICP-MS的結(jié)果說(shuō)明我們需要進(jìn)一步研究污染物對(duì)生物體的生物有效濃度和生物利用度，這對(duì)于明確污染物安全濃度是非常重要的。

圖6 銅與四環(huán)素的聯(lián)合毒性表型效應(yīng)

此前已有文獻(xiàn)表明銅可以導(dǎo)致斑馬魚成魚的魚鰓產(chǎn)生細(xì)胞凋亡，并推測(cè)出可能的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路[36]。本文中應(yīng)用AO染色對(duì)銅是否對(duì)斑馬魚早期發(fā)育產(chǎn)生細(xì)胞凋亡進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，環(huán)境濃度的銅可以對(duì)斑馬魚胚胎產(chǎn)生細(xì)胞凋亡，主要集中于心臟區(qū)域，說(shuō)明了細(xì)胞凋亡是銅對(duì)斑馬魚產(chǎn)生毒性的主要途徑之一，而心臟可能是銅對(duì)斑馬魚產(chǎn)生毒性的潛在靶標(biāo)位置。相關(guān)研究還表明銅可以導(dǎo)致斑馬魚胚胎心率在28 hpf時(shí)加快[9]，并在120 hpf時(shí)會(huì)減少斑馬魚幼魚的功能性神經(jīng)丘(functional neuromasts)生成，而這一功能的缺失將會(huì)導(dǎo)致斑馬魚胚胎早期的定位能力下降[9]。根據(jù)上述結(jié)果，我們推測(cè)銅會(huì)影響斑馬魚胚胎的神經(jīng)和心臟發(fā)育。本研究中的表型數(shù)據(jù)也表明銅會(huì)導(dǎo)致斑馬魚幼魚的頭部變小，而頭部發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有直接聯(lián)系。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR對(duì)心臟和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，Gfap和Ngn1對(duì)于中胚層細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化、神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的形成和成熟、大腦皮層的發(fā)育等過(guò)程十分關(guān)鍵[37-38]。HuC屬于RNA結(jié)合蛋白家族，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育十分重要，在神經(jīng)分化和成熟過(guò)程中扮演重要角色，其可通過(guò)增加mRNA的穩(wěn)定性而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的功能有維持作用[39]。結(jié)果證實(shí)，低濃度(2.56～256 μg·L-1)的銅可以提高Gfap、HuC和Ngn1基因的表達(dá)量，說(shuō)明環(huán)境濃度的銅可能通過(guò)影響神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)斑馬魚胚胎造成了部分神經(jīng)發(fā)育的損害。在心臟發(fā)育過(guò)程中，Nkx2.5在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)、心房形成等方面起著重要作用[40]。在斑馬魚中，Gata5和Bmp2b是Nkx2.5的上游基因，本研究中低濃度銅的處理組(2.56和25.6μg·L-1)導(dǎo)致了Gata5的下調(diào)，但Bmp2b沒(méi)有顯著變化，這說(shuō)明銅可能通過(guò)Gata5基因來(lái)調(diào)控Nkx2.5的表達(dá)，而Nkx2.5的表達(dá)量上升表明銅可能影響了斑馬魚胚胎的心臟發(fā)育。這與芘(pyrene)導(dǎo)致的心臟毒性機(jī)制類似[41]。我們推測(cè)銅最終通過(guò)上調(diào)Nkx2.5基因表達(dá)從而引起了心臟發(fā)育異常，心率的改變可能和這些基因變化有關(guān)，這有待于后續(xù)研究的證實(shí)。

圖7 銅與四環(huán)素聯(lián)合暴露斑馬魚胚胎96 hpf后，幼魚體內(nèi)的總銅含量

圖9 單一銅溶液以及銅和四環(huán)素的混合溶液中銅的檢測(cè)濃度

圖8 銅離子與四環(huán)素可能形成的絡(luò)合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

在自然環(huán)境因素中，銅對(duì)水生生物的毒性以及生物有效性取決于銅的濃度及形態(tài)。在所有形態(tài)中，自由離子態(tài)銅的毒性最強(qiáng)，而絡(luò)合態(tài)或其他吸附形態(tài)的銅的毒性均比離子態(tài)銅的毒性低[42]。已有研究表明土霉素和銅離子形成一定結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物[31]，鑒于土霉素和四環(huán)素化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，所以我們推測(cè)銅離子和四環(huán)素相互作用可能形成如圖8所示化學(xué)結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物形態(tài)，這種形態(tài)銅的毒性要比銅離子要低，且不易被生物體吸收，即降低了銅的生物可利用濃度。銅的暴露溶液及四環(huán)素和銅的混合溶液中銅的檢測(cè)濃度證實(shí)了四環(huán)素和銅離子相互作用產(chǎn)生絡(luò)合物的假設(shè)。另外聯(lián)合暴露得到的表型指標(biāo)，如死亡率、孵化率、卵黃囊面積等(圖5)，也表明銅離子與一定量的四環(huán)素結(jié)合可以緩解銅對(duì)斑馬魚胚胎的毒性。而斑馬魚幼魚體內(nèi)總銅檢測(cè)含量顯示，聯(lián)合暴露的幼魚體內(nèi)的總銅含量要比單獨(dú)暴露的幼魚體內(nèi)的總銅含量要低，進(jìn)一步說(shuō)明四環(huán)素與銅的聯(lián)合暴露可能降低了銅的生物可利用性。利用雙因子方差分析法來(lái)評(píng)價(jià)銅和四環(huán)素的聯(lián)合作用類型，最終結(jié)果顯示銅和四環(huán)素的復(fù)合污染環(huán)境效應(yīng)屬于拮抗作用。

綜上所述，本文研究結(jié)果表明：1)環(huán)境濃度的銅(2.56、25.6、128和256 μg·L-1)對(duì)斑馬魚胚胎的亞致死效應(yīng)主要為延遲胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，表現(xiàn)在孵化延遲、體長(zhǎng)變短、頭部變小、卵黃囊吸收不全、魚鰾缺失等方面；銅對(duì)斑馬魚胚胎96 h的LC10和EC10分別為2.5 μg·L-1和0.1 μg·L-1。2)AO染色試驗(yàn)表明銅可以誘導(dǎo)斑馬魚的心臟區(qū)域產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。3)基因表達(dá)分析表明環(huán)境濃度的銅可能通過(guò)影響神經(jīng)和心臟相關(guān)基因的表達(dá)引起斑馬魚胚胎的神經(jīng)發(fā)育和心臟發(fā)育異常。4)斑馬魚幼魚對(duì)不同濃度銅的生物有效吸收并不相同，且低濃度銅的生物有效性更高，需更加重視低濃度銅導(dǎo)致的環(huán)境效應(yīng)。5)聯(lián)合暴露數(shù)據(jù)表明四環(huán)素可以緩解銅對(duì)斑馬魚胚胎的毒性，兩者的復(fù)合污染效應(yīng)為拮抗作用。6)四環(huán)素和銅相互作用形成一種絡(luò)合物,降低了銅離子的生物有效濃度和毒性。

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Developmental Toxicity of Cu and Tetracycline on Zebrafish Embryos (Daniorerio)

Zhang Qiang1,2, Xin Qi1,2, Qiang Liyuan1, Cheng Jinping1,2,*

1. State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research, East China Normal University, Shanghai 200062, China 2. City University of Hong Kong Shenzhen Research Institute, Shenzhen 518057, China

Received 26 December 2014 accepted 30 April 2015

With the increase use of copper and tetracycline in industry and agriculture, their aquatic environmental concentration increased greatly in recent years. This study aims to examine the developmental toxicity of Cu and tetracycline on zebrafish embryos (Danio rerio) and further explore its molecular mechanism. Cu shows high toxicity to zebrafish embryos (LC10=2.5 μg·L-1, EC10=0.1 μg·L-1), retarding the development and inducing apoptosis in the heart area of zebrafish larvae. The in vivo uptake of total Cu (96 h) in exposed embryos suggests that the uptake rate is relatively higher in low concentrations as compared to that of high concentrations. Gene expression study results showed that exposure to Cu upregulated gene expression level of Nkx2.5, which is responsible to cardiac development in zebrafish larvae. Exposure to Cu affected the gene expression level of several neuron development governing genes selected in this study. The results obtained in the co-exposure to Cu and tetracycline suggest that the combined toxicity is antagonism. This study suggests that exposure to Cu inhibits embryonic growth, induces the developmental anomaly of the nervous and heart in zebrafish embryos at environmental relevant concentrations. Co-exposure of Cu with other environmental contaminants such as tetracycline can change the bioavailability and the associated toxicity of Cu in aquatic organisms.

Cu; tetracycline; complex; zebrafish embryos; neurodevelopment; cardiac development

國(guó)家自然科學(xué)基金(41101489)；廣東省自然科學(xué)基金(s2012010010847)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃項(xiàng)目(NECT-12-0181)； 河口海岸學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主課題(2012RCDW-01)

章強(qiáng)(1990-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)，E-mail: zzggkobe@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jinpingcheng@gmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20141226001

2014-12-26錄用日期：2015-04-30

1673-5897(2015)5-035-12

X171.5

A

程金平(1978-)，女，博士，研究員，主要研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)。

章強(qiáng)，辛琦，強(qiáng)麗媛, 等. 銅及其與四環(huán)素的聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng)研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(5): 35-46

Zhang Q, Xin Q, Qiang L Y, et al. Developmental toxicity of Cu and tetracycline on zebrafish embryos (Danio rerio) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 35-46 (in Chinese)