許靜，王娜，孔德洋，孔祥吉，單正軍

環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042

磺胺類抗生素在斑馬魚(yú)體內(nèi)的生物富集性及模型預(yù)測(cè)評(píng)估

許靜*，王娜，孔德洋，孔祥吉，單正軍

環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042

針對(duì)磺胺類抗生素在魚(yú)體內(nèi)的生物富集特性，采用半靜態(tài)生物富集測(cè)試法，研究磺胺二甲嘧啶(SMT)和磺胺甲惡唑(SMX)在斑馬魚(yú)(Brachydanio rerio)體內(nèi)的生物富集規(guī)律及生物富集系數(shù)(bio-concentration factor, BCF)，并選用3種常用預(yù)測(cè)模型對(duì)2種磺胺類抗生素的BCF值進(jìn)行估算，比較了估算值與實(shí)際測(cè)定值，為磺胺類抗生素生物富集性的預(yù)測(cè)提供依據(jù)。研究結(jié)果表明，當(dāng)暴露濃度為0.01 mg·L-1～1.00 mg·L-1時(shí)，魚(yú)體對(duì)SMT的最大生物富集系數(shù)BCF值為1.11，最大富集量出現(xiàn)在暴露24～48 h期間；SMX的最大BCF值為1.15，最大富集量處于暴露96～168 h之間。根據(jù)磺胺類抗生素的理化性質(zhì)，通過(guò)比較3種生物富集預(yù)測(cè)模型獲得SMT和SMX的BCF值，發(fā)現(xiàn)其中Kow預(yù)測(cè)模型所得估算值最為接近實(shí)測(cè)值。因此可利用該模型作為磺胺類抗生素富集性的預(yù)測(cè)工具，為我國(guó)獸藥抗生素的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

磺胺二甲嘧啶；磺胺甲惡唑；斑馬魚(yú)；生物富集

磺胺類藥物是具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，通常作為添加劑以亞治療劑量添加到動(dòng)物飼料中，長(zhǎng)期以來(lái)被用于動(dòng)物疾病的治療和預(yù)防。在歐洲，磺胺類藥物是使用量第二大的獸藥抗生素，在我國(guó)磺胺類藥物的產(chǎn)量增長(zhǎng)迅速，1998年為10 164 t，2003年產(chǎn)量突破20 000 t，是我國(guó)使用最廣泛的獸藥抗生素之一[1-4]。隨著磺胺類抗生素的大量生產(chǎn)和廣泛使用，磺胺類母體化合物通過(guò)多種途徑進(jìn)入環(huán)境，主要污染途徑包括藥物生產(chǎn)過(guò)程中損失和廢棄，后經(jīng)雨水淋洗進(jìn)入河流或湖泊等污染水體；除此之外，污染途徑還包括水產(chǎn)養(yǎng)殖中藥物的直接施用，以及畜禽養(yǎng)殖中疾病的治療和預(yù)防等[5-6]。由于磺胺類抗生素應(yīng)用廣泛、使用劑量大，因此在水體中殘留濃度逐年提高[7]，導(dǎo)致磺胺類藥物在生物體內(nèi)的富集風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大，進(jìn)而通過(guò)食物鏈的傳遞，進(jìn)入人體，并且因?yàn)槿梭w代謝時(shí)間長(zhǎng)，在體內(nèi)蓄積并產(chǎn)生耐藥性的可能性增大，嚴(yán)重危害人類健康[8-9]。因此，開(kāi)展磺胺類藥物在生物體內(nèi)的富集特性研究是十分必要的。

隨著我國(guó)對(duì)磺胺類抗生素的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入，其在生態(tài)毒理學(xué)方面的研究也越來(lái)越受到重視。目前，已有研究者發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物的生態(tài)毒性較大，林濤等[10]的研究結(jié)果顯示，磺胺嘧啶對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的孵化、心率和自主運(yùn)動(dòng)均產(chǎn)生了不利影響。Sanderson等[11]發(fā)現(xiàn)1/3的抗生素對(duì)魚(yú)類有顯著毒性作用，超過(guò)1/2的抗生素對(duì)魚(yú)類有毒。在人體中磺胺抗生素的蓄積亦可能會(huì)導(dǎo)致各種器官的病變[12]，所以研究磺胺類抗生素在生物體內(nèi)的富集性將直接關(guān)系到人類健康。目前，已有磺胺類抗生素在魚(yú)體內(nèi)富集性的相關(guān)研究[13-14]，但研究的生物體多集中在中大型魚(yú)體上，而對(duì)于國(guó)內(nèi)外常用于急性毒性試驗(yàn)的斑馬魚(yú)的生物富集性研究較少。由于斑馬魚(yú)生命周期短，基因信息與人類接近，研究磺胺類抗生素在其體內(nèi)的富集性具有重要意義，因此本文選用斑馬魚(yú)作為試驗(yàn)生物，采用了半靜態(tài)試驗(yàn)法，研究二甲嘧啶(SMT)和磺胺甲惡唑(SMX) 2種磺胺類藥物在斑馬體內(nèi)的生物富集性，并采用模型估算方式推算2種磺胺類藥物的生物富集系數(shù)(bio-concentration factor, BCF)。為我國(guó)獸藥抗生素的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)，尤其是對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 供試材料

供試藥物選用2種典型磺胺類抗生素，磺胺二甲嘧啶(純度99.0%, sulfamethazine, SMT)、磺胺甲惡唑(純度99.0%, sulfamethoxazole, SMX)，均由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。

內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為氘代SMX-d4(純度98.0%，sulfamethoxazole-d4, SMX-d4)，購(gòu)于多倫多研究化學(xué)品公司(North York, Ontario)。

受試生物為斑馬魚(yú)(Brachydanio rerio)，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)魚(yú)體長(zhǎng)(連尾)2～3 cm，體重約為0.27～0.30 g/尾，脂肪平均含量3.48%。試驗(yàn)前在室內(nèi)馴養(yǎng)1周，馴養(yǎng)期間正常喂養(yǎng)，晝夜充氧，水溫(23±1) ℃，pH值7～8。預(yù)養(yǎng)期間斑馬魚(yú)生長(zhǎng)正常，無(wú)疾病、肉眼可見(jiàn)畸形及死亡。

供試儀器：ACQUITYTM超高效液相色譜儀-Quattro Premier XE質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS，Waters公司，美國(guó))；Excella E24R全溫度振蕩器(New Brunsuick Scientific公司，美國(guó))；VCX500超聲破碎儀(Sonics公司，美國(guó))；CR 22GⅡ離心機(jī)(HITACHI，日本)；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI公司，瑞士)。

供試試劑有硫酸、氨水、無(wú)水硫酸鈉(均為分析純，南京化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))；甲醇、丙酮、乙腈(均為色譜純，Merck公司，德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本試驗(yàn)主要依據(jù)化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則OECD 305[15]魚(yú)類生物富集試驗(yàn)方法，并參考US EPA的《Ecological Effects Test Guidelines》(OPPTS 850.1730)[16]和我國(guó)《化學(xué)藥物環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[17]，采用半靜態(tài)法對(duì)2種典型磺胺類抗生素進(jìn)行生物富集效應(yīng)研究。

半靜態(tài)試驗(yàn)法：試驗(yàn)期間每隔24 h更換1次藥液，以保持試驗(yàn)藥液的濃度不低于初始濃度的80%。

試驗(yàn)用水為經(jīng)曝氣去氯處理24 h的自來(lái)水。試驗(yàn)容器為口徑29 cm、容積15 L的玻璃缸。本試驗(yàn)設(shè)置了0.01 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1共5組濃度處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。在每個(gè)試驗(yàn)缸中配制14 L藥液，投入斑馬魚(yú)70尾，試驗(yàn)溫度控制在(23±2) ℃之間。水樣和魚(yú)樣的采樣頻次為藥物暴露0 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h、168 h和192 h，每次水樣采集100 mL，魚(yú)樣采集8尾(約2.0 g)。

由于磺胺類抗生素在水中的溶解度較小，進(jìn)行魚(yú)類生物富集試驗(yàn)時(shí)，采用了助溶劑助溶，同時(shí)要避免助溶劑對(duì)魚(yú)類的影響。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置一組僅加助溶劑不加藥的對(duì)照組，助溶劑為丙酮，加入量小于0.1%(V/V)，結(jié)果顯示，加助溶劑不加藥的對(duì)照組中斑馬魚(yú)未出現(xiàn)不良癥狀或死亡情況，因此可選用丙酮作為試驗(yàn)中的助溶劑。

1.3 分析方法

水樣處理：取水樣加入含2.0 mL甲醇的具塞磨口10 mL試管中至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm濾膜，待UPLC-MS/MS進(jìn)行分析。上述方法的水體回收率為SMT 99.8%、SMX 99.0%。

魚(yú)樣處理：取魚(yú)樣(全魚(yú)8尾，約2.0 g)，先用吸水紙吸干魚(yú)體表面水分，再置于瑪瑙研缽中加入2 g無(wú)水硫酸鈉碾磨，將魚(yú)樣磨碎脫水，加入30 mL乙腈，勻漿2 min，以6 000 r·min-1離心，過(guò)濾后，再加乙腈20 mL用上述方法提取1次，合并提取液，將提取液轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中，加入30 mL預(yù)先用乙腈飽和過(guò)的正已烷進(jìn)行萃取凈化，收集下層乙腈層，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，N2吹干后用甲醇水溶液(V(甲醇)∶V(水)=1∶4)定容至1 mL，渦旋振蕩1 min，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待UPLC-MS/MS進(jìn)行分析。

表1 檢測(cè)磺胺類抗生素超高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 The gradient elution conditions of mobile phases for ultra performance liquid chromatography analysis of sulfonamide antibiotics

注：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸/水(V/V)。

Note: Acetonitrile as mobile phase A, 0.1% formic acid/water (V/V) as mobile phase B.

質(zhì)量控制：SMT和SMX在水體中的加標(biāo)回收率分別為99.7%～99.9%、98.9%～99.1%，在魚(yú)體中的加標(biāo)回收率分別為81.9%～84.0%、79.8%～83.2%，均符合本試驗(yàn)檢測(cè)要求。

超高效液相色譜條件: ACQUITY UPLC BEH C18柱，1.7 μ m，2.1 mm×50 mm，Waters；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸/水(V/V)，梯度洗脫條件見(jiàn)表1；流速0.1 mL·min-1；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；離子源溫度為120 ℃ ；脫溶劑溫度為350 ℃ ；脫溶劑氣和錐孔氣為氮?dú)?；碰撞氣為高純氬氣；脫溶劑氣流速?00 L·h-1；錐孔氣流速為50 L·h-1；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)；質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

若試驗(yàn)結(jié)束時(shí)水體及魚(yú)體中藥物含量變化已基本達(dá)到平衡，此時(shí)魚(yú)體對(duì)藥物的富集系數(shù)為：

BCF=Cfs/Cws

(1)

式中，Cfs，平衡時(shí)魚(yú)體藥物含量(mg·kg-1)；Cws，平衡時(shí)水中藥物含量(mg·L-1)。若試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，魚(yú)體中藥物濃度未達(dá)平衡，由用BCF8d表示。

2 結(jié)果(Results)

生物富集作用是指污染物從環(huán)境中進(jìn)入生物體內(nèi)蓄積，進(jìn)而在食物鏈中傳遞與富集的能力。污染物的生物富集作用越強(qiáng)，對(duì)生物的污染程度與慢性危害作用越大[18-20]。通常以生物富集系數(shù)(BCF)來(lái)度量污染物在生物體累積的趨勢(shì)，作為描述生物對(duì)污染物質(zhì)富集效應(yīng)的指標(biāo)，在污染物環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中占有非常重要的地位。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空白對(duì)照組和助溶劑對(duì)照組、以及正式試驗(yàn)組中斑馬魚(yú)的死亡率均為0%，說(shuō)明試驗(yàn)過(guò)程中生物體狀態(tài)良好，且助溶劑對(duì)魚(yú)體基本無(wú)影響，不影響本試驗(yàn)的富集結(jié)果。

2.1 SMT在斑馬魚(yú)體內(nèi)的生物富集

SMT的生物富集試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。結(jié)果顯示，試驗(yàn)8 d期間，當(dāng)暴露實(shí)際濃度為0.008 mg·L-1～0.845 mg·L-1，SMT在魚(yú)體內(nèi)的最大BCF為1.11。SMT在不同濃度組中的BCF8d均小于10，根據(jù)我國(guó)生物富集性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)[21]，屬低生物富集性。

表2 磺胺類抗生素的質(zhì)譜檢測(cè)條件Table 2 Mass-spectrometric detecting conditions of sulfonamide antibiotics

圖1 不同濃度組SMT在斑馬魚(yú)體中含量的變化

圖2 不同濃度組SMT在斑馬魚(yú)體中的BCF值走勢(shì)圖

圖3 不同濃度組SMX在斑馬魚(yú)體中含量的變化

圖4 不同濃度組SMX在斑馬魚(yú)體中的BCF值走勢(shì)圖

2.2 SMX在斑馬魚(yú)體內(nèi)的生物富集

SMX的生物富集試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。結(jié)果顯示，至試驗(yàn)第8天，當(dāng)實(shí)測(cè)暴露濃度為0.01 mg·L-1～0.897 mg·L-1時(shí)，SMX在魚(yú)體內(nèi)的最大BCF達(dá)1.15。SMX在不同濃度組中的BCF8d均小于10，屬低生物富集性[21]。

2.3 SMT和SMX的BCF值估算

藥物在生物體內(nèi)的富集作用強(qiáng)弱與藥物的水溶性、脂溶性、辛醇/水分配系數(shù)、土壤吸附分配系數(shù)等密切相關(guān)，SMT和SMX的理化性質(zhì)[22-23]見(jiàn)表3，根據(jù)這些性質(zhì)可以推算出藥物的BCF值[24]。

根據(jù)Kow值估算，較著名的是Veith等[25]利用一系列不同魚(yú)種和84種不同的化合物經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到的估算式：

lgBCF=0.76lgKow-0.23

( 2 )

根據(jù)式(2)可計(jì)算求得SMT的生物富集系數(shù)BCF估算值為2.39；SMX的BCF估算值為2.80。

由水溶解度估算BCF：可以使用Kenaga和Goring[26]在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)不同魚(yú)種和36種有機(jī)物進(jìn)行研究后推得的估算式：

lgBCF= -0.564lgS+2.791

( 3 )

根據(jù)式(3)和SMT 29 ℃下的水溶解度可計(jì)算求得生物富集系數(shù)BCF值為9.99；因SMX的水溶解度低，因此該方程難以估算出SMX的BCF值。

由土壤吸附分配系數(shù)估算BCF：Koc和BCF之間是經(jīng)驗(yàn)性的關(guān)系，事實(shí)上，土壤對(duì)一定有機(jī)物的親和力可能同化合物與生態(tài)系統(tǒng)中某些部分的親和力有關(guān)，Kenaga和Goring[26]從少量土壤吸附分配系數(shù)

表3 磺胺類抗生素的理化性質(zhì)Table 3 Physical and chemical properties of sulfonamide antibiotics

測(cè)定值推導(dǎo)出了以下的估算式：

lgBCF=1.12lgKoc-1.58

( 4 )

根據(jù)式(4)可計(jì)算求得SMT的生物富集系數(shù)BCF估算值為7.59；SMX的BCF估算值為3.16。

3 討論(Discussion)

由圖1結(jié)果可見(jiàn)，至試驗(yàn)8 d時(shí)，在不同暴露濃度組下，魚(yú)體中的SMT蓄積含量與相應(yīng)水體中濃度沒(méi)有等比關(guān)系，不因暴露濃度增大而等比增大。圖2顯示，不同濃度組的最大富集時(shí)期均出現(xiàn)在富集暴露時(shí)間24～48 h段，即該時(shí)段是SMT在魚(yú)體生物富集性最強(qiáng)時(shí)段，SMT在魚(yú)體中富集作用較快，24 h即可能達(dá)富集最大量。其后富集系數(shù)開(kāi)始下降，顯示SMT在魚(yú)體內(nèi)存在自身消解過(guò)程，且消解速率較富集速率快，因此在試驗(yàn)的后半程(72～192 h)生物富集系數(shù)較高峰期有所下降。在5個(gè)濃度組中，0.01 mg·L-1濃度組(即最低濃度組)下生物富集系數(shù)BCF值最大，研究發(fā)現(xiàn)，藥物的生物富集系數(shù)與試驗(yàn)的濃度有一定的相關(guān)性，在低濃度的條件下所得BCF比高濃度條件下的BCF高。Franke[27]研究了苯酚在魚(yú)體內(nèi)的富集特性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)暴露濃度為60 mg·L-1時(shí)，其BCF值為1.9，當(dāng)暴露濃度降為32.7 μg·L-1時(shí)，BCF值上升為4 312，這一研究結(jié)果與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。

由圖3可見(jiàn)，至試驗(yàn)第8天，在SMX的不同暴露濃度組下，斑馬魚(yú)體內(nèi)的藥物富積含量隨水體暴露濃度增大而增大，但魚(yú)體和水體濃度間并不呈等比關(guān)系，因此SMX在斑馬魚(yú)體內(nèi)的生物富集系數(shù)與暴露濃度水平不呈線性關(guān)系，在0.01 mg·L-1～1.00 mg·L-1濃度區(qū)間下，0.01 mg·L-1濃度組(即最低濃度組)的生物富集系數(shù)為最大。該結(jié)果表明生物對(duì)環(huán)境中藥物的富集并非無(wú)止境，而是有一定的限度，當(dāng)達(dá)到一定閾值時(shí)，藥物在生物體內(nèi)的消解(或排出)速度與吸收速度相當(dāng)，即達(dá)到富集平衡[28]，這時(shí)暴露濃度大小對(duì)富集系數(shù)影響不大，這一結(jié)果與SMT的研究結(jié)果相一致。同時(shí)由圖3和圖4結(jié)果可見(jiàn)，不同濃度組的最大富集量時(shí)期均出現(xiàn)在富集暴露時(shí)間96～168 h段，該時(shí)段是SMX生物富集性的高峰時(shí)段，富集性最強(qiáng)，而不同的藥物濃度影響不大。168 h后富集系數(shù)開(kāi)始下降，SMX在魚(yú)體內(nèi)的富集量降低，此時(shí)在魚(yú)體中發(fā)生了自身消解作用，且消解速率快于富集速率。

由本試驗(yàn)中3種預(yù)測(cè)模型計(jì)算出的結(jié)果可見(jiàn)，以Kow值估算的BCF值結(jié)果與實(shí)際試驗(yàn)值最為接近，而其他2種公式計(jì)算結(jié)果與之偏差較大，說(shuō)明SMT和SMX在魚(yú)體的生物富集性與Kow值最為相關(guān)，而與水溶解度和Koc相關(guān)性不大。模型(2)為疏水性模型[25]，說(shuō)明磺胺類抗生素在生物體內(nèi)的富集性遵從疏水性模型特征，即藥物向生物體內(nèi)遷移過(guò)程的對(duì)數(shù)值隨藥物疏水性的增加而增加。綜上，在目前化合物的生物富集預(yù)測(cè)方程繁多的情況下，針對(duì)磺胺類抗生素藥物的生物富集特性進(jìn)行預(yù)估測(cè)時(shí)，選擇模型(2)進(jìn)行預(yù)測(cè)可靠性更強(qiáng)。

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Bioconcentration of Sulfonamide Antibiotics in Zebrafish (Brachydanio rerio) and Model Prediction Assessment

Xu Jing*, Wang Na, Kong Deyang, Kong Xiangji, Shan Zhengjun

Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection of the People’s Republic of China, Nanjing 210042, China

Received 24 June 2015 accepted 26 September 2015

Bioconcentration assessment is very important in the scientific evaluation of ecological risks. As sulfonamide antibiotics might threaten the environment and human health by being delivered and accumulated, sulfamethazine (SMT) and sulfamethoxazole (SMX) were chosen as testing substances to study their bioconcentration in zebra fish (Brachydanio rerio) by semi-static test method. Three kinds of commonly used prediction models for BCF estimation were selected to compare the proximity of the estimated value with the test results. The results showed that exposed to concentrations of 0.01 mg·L-1to 1.00 mg·L-1of SMT and SMX for 8 days, the maximum bioconcentration factor (BCF) of SMT in zebrafish was 1.11, and the period of most bioaccumulation appeared in exposure time of 24 to 48 hours; the maximum BCF of SMX was 1.15, and maximum enrichment period was 96 to 168 hours. The estimating values of BCF with the Kow’s equation was closest to the measured values, and it can be used to predict the bioaccumulation of sulfonamide antibiotics.

sulfamethazine; sulfamethoxazole; zebrafish; Brachydanio rerio; bioconcentration

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(有機(jī)肥中抗生素對(duì)作物的污染與影響研究)；環(huán)保公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(No.201309031)

許靜(1982-)，女，助理研究員，研究方向?yàn)橛卸居泻瘜W(xué)品的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)研究, E-mail: moon9722@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150624002

2015-06-24錄用日期：2015-09-26

1673-5897(2015)5-082-07

X171.5

A

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