袁正洲，李作孝※，李經(jīng)倫，楊　波，林　洋，黎　蘭

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)科，b.介入科，四川 瀘州 646000； 2.瀘州醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，四川 瀘州 646000)

論著

來氟米特對實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎小鼠Th1/Th2平衡的影響

袁正洲1a，李作孝1a※，李經(jīng)倫1a，楊波1b，林洋1b，黎蘭2△

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)科，b.介入科，四川 瀘州 646000； 2.瀘州醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，四川 瀘州 646000)

摘要：目的探討來氟米特(LEF)對實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)的防治作用及其可能的免疫學(xué)機制。方法將36只雌性C57BL/6小鼠依據(jù)隨機數(shù)字表法分為大、小劑量LEF防治組及EAE對照組，每組12只。采用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55構(gòu)建EAE模型。從造模前3 d開始起EAE對照組及大、小劑量LEF防治組分別予以生理鹽水、LEF 8 mg/(kg·d)、2 mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)10 d。觀察小鼠發(fā)病情況及外周血中白細(xì)胞介素4(IL-4)、γ干擾素(IFN-γ)水平及其比值變化。結(jié)果與EAE對照組相比，LEF各防治組小鼠臨床癥狀較輕，且外周血中IL-4、IL-4/INF-γ值增高(P<0.01)，INF-γ水平顯著降低(P<0.01)，且與小劑量相比大劑量降低更明顯。結(jié)論LEF對EAE具有防治作用，且效果呈劑量依賴性。其防治作用可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2比例平衡，Th0分化向Th1漂移有關(guān)。

關(guān)鍵詞：實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎；多發(fā)性硬化；來氟米特；Th1/Th2平衡

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同部位及不同程度白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特征的自身免疫性疾病[1]。該病好發(fā)于青壯年女性，全球約250萬患者。來氟米特(leflunomide,LEF)是人工合成的嗯唑類化合物，作為一種新型的免疫抑制劑最早應(yīng)用于器官移植[2]。LEF在自身免疫性疾病中也取得了較好的療效，且藥物不良反應(yīng)較小[3]。目前國內(nèi)還未見報道其用于防治MS或?qū)嶒炐宰儜B(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental allergic encephalitis,EAE)的研究，本研究探討LEF對EAE是否具有防治作用及其對Th1、Th2型細(xì)胞因子的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物雌性C57BL/6小鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量為18～22 g，合格證號：201303523，2013年3月購自四川大學(xué)華西實驗動物中心，為一級合格動物。實驗前在瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.2實驗藥品及試劑LEF片購自蘇州長征-欣凱制藥有限公司(批號:X20012550)。髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55)由上海強耀生物科技有限公司合成，純度>95%；結(jié)核分枝桿菌H37RaMT購自美國BD公司(批號:25177-549)；百日咳毒素(PTx)購自瑞士Alexis公司(批號:12687-177)；福氏不完全佐劑(incomplete Freundls adjuvant,IFA)購自美國Sigma公司。白細(xì)胞介素4(interleukin 4,IL-4)檢測試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所產(chǎn)品(批號：20120625)；干擾素γ (interferon γ,INF-γ) 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自晶美生物工程有限公司(批號：20121076)。

1.3方法

1.3.1EAE模型制作將36只小鼠依據(jù)隨機數(shù)字表法分為3組：EAE對照組及大、小劑量LEF防治組，每組12只。將MOG35-55及結(jié)核分枝桿菌H37RaMT溶解于IFA中制成免疫抗原，其中每毫升抗原含1 mg MOG35-55及4 mg結(jié)核分枝桿菌。在小鼠后背中線兩側(cè)分四點注入免疫抗原，每只注入0.2 mL。在造模后當(dāng)天及第2日，每只小鼠腹腔注射PTx 200 ng 加強免疫反應(yīng)。

1.3.2模型干預(yù)從造模前3 d起每日大、小劑量LEF組分別予以LEF片8 mg/(kg·d)、2 mg/(kg·d) (用2 mL注射用生理鹽水溶解)灌胃；EAE對照組每日2 mL生理鹽水灌胃，連續(xù)10 d。

1.3.3動物模型評價每日定時對實驗C57BL/6小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，未發(fā)??；1分，后肢輕度無力(包括尾巴無力)；2分，中度后肢無力或者輕度共濟失調(diào)；3分，中至重度后肢無力；4分，嚴(yán)重后肢無力；5分，中度以下四肢無力的截癱；6分，四肢全癱或嚴(yán)重共濟失調(diào)或者死亡[4]。EAE C57BL/6小鼠在發(fā)病高峰期，即連續(xù)3 d癥狀評分無加重、四肢癱瘓或死亡時處死動物。

1.3.4IL-2、IL-4、INF-γ、TNF-α水平測定實驗終止時取小鼠心臟動脈血2 mL，ELISA法檢測IL-4及INF-γ水平，檢測方法依試劑說明書，通過標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線再計算各樣本值。

2結(jié)果

2.1EAE對照組及LEF各防治組發(fā)病潛伏期、進(jìn)展期及臨床表現(xiàn)C57BL/6小鼠造模后主要表現(xiàn)為精神萎靡、活動減少、食欲減弱、體質(zhì)量下降等。注射抗原17 d左右EAE小鼠逐漸出現(xiàn)單后肢或雙后肢或伴前肢不同程度的無力、共濟失調(diào)及癱瘓；潛伏期、進(jìn)展期及神經(jīng)功能障礙評分組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，且與EAE對照組相比，小、大劑量LEF組癥狀明顯減輕，表現(xiàn)為潛伏期天數(shù)延長、進(jìn)展期縮短、神經(jīng)功能障礙評分降低(均P<0.05)。與小劑量LEF組比較，大劑量LEF防治組發(fā)病潛伏期延長、進(jìn)展期縮短、神經(jīng)功能障礙評分降低(均P<0.05)。見表1。

表1　EAE對照組及LEF各防治組發(fā)病潛伏期和

EAE：實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎；LEF：來氟米特；a與EAE對照組比較，P<0.05；b與小劑量LEF防治組比較，P<0.05

2.2EAE對照組及LEF各防治組C57BL/6小鼠發(fā)病高峰期IL-4、INF-γ水平及其比值3組IL-4、INF-γ水平及其比值組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，且LEF各防治組Th2型細(xì)胞因子IL-4水平、IL-4/INF-γ值較EAE對照組明顯增高，Th1型細(xì)胞因子 INF-γ水平較EAE對照組明顯降低(均P<0.05)。與小劑量LEF防治組比較，大劑量LEF防治組C57BL/6小鼠發(fā)病高峰期IL-4水平增高、INF-γ水平降低，IL-4/INF-γ值增高(均P<0.05)。見表2。

表2EAE對照組及LEF各防治組發(fā)病高峰期

組別只數(shù)IL-4(ng/L)INF-γ(μg/L)IL-4/INF-γ(×1000)EAE對照組1211.66±1.2315.35±1.050.78±0.10小劑量LEF防治組1216.24±0.84a12.86±0.47a1.32±0.80a大劑量LEF防治組1220.24±0.56ab11.42±0.86ab1.80±0.13abF236.4350.15279.78P<0.01<0.01<0.01

EAE：實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎；LEF：來氟米特；IL-4：白細(xì)胞介素4；INF-γ：干擾素γ；a與EAE對照組比較，P<0.05；b與小劑量LEF防治組比較，P<0.05

3討論

LEF是美國食品藥品管理局于1998年批準(zhǔn)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的一種新型免疫抑制劑，最早應(yīng)用于器官移植，LEF同時也已用于自身免疫性疾病的治療。LEF通過抑制二氫乳酸脫氫酶及酪氨酸激酶以減少嘧啶的形成，致使DNA合成障礙，進(jìn)而抑制淋巴細(xì)胞活化及由此而致的免疫反應(yīng)[5]。

MS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，是神經(jīng)病學(xué)中自身免疫介導(dǎo)的典型疾病之一。MS可能是遺傳易患個體與環(huán)境因素相互作用而發(fā)生的自身免疫所介導(dǎo)的疾病。MS的理想動物模型EAE造模動物發(fā)展種類繁多，猴、Wistar大鼠、SJL/J小鼠、C57BL/6小鼠均有報道[6-8]。C57BL/6小鼠是用來建立MS模型的理想品系，但由于其價格較高等原因，國內(nèi)較少使用，而國際上普遍采用C57BL/6小鼠構(gòu)建穩(wěn)定的模型[6]。本實驗選擇8 mg/(kg·d)、2 mg/(kg·d)兩種劑量LEF對EAE小鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，LEF通過發(fā)揮其抗炎功能，能延長EAE發(fā)病潛伏期、縮短進(jìn)展期、降低神經(jīng)功能障礙評分，對EAE有保護(hù)作用且呈劑量依賴關(guān)系。

MS患者具有多個異常的免疫環(huán)節(jié)，包括自身抗體破壞髓鞘以及自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活，同時MS患者腦脊液、外周血以及腦組織中出現(xiàn)多種活化反應(yīng)性T細(xì)胞[9]。CD4+T細(xì)胞在遇到特定的抗原時分化成兩類能夠分泌不同細(xì)胞因子的細(xì)胞如Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞與細(xì)胞免疫有關(guān)，Th2細(xì)胞通常與體液免疫有關(guān)[10]。IFN-γ、TNF-α是典型的與Th1細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的功能：激活巨噬細(xì)胞、增強抗原遞呈和誘導(dǎo)T細(xì)胞的反應(yīng)，是致使EAE發(fā)病(復(fù)發(fā))的重要因子[11]。典型的Th2細(xì)胞促進(jìn)抗體產(chǎn)生，包括IL-4等，對EAE的病情惡化起抑制功能。研究顯示，將促進(jìn)IL-4表達(dá)的重組基因注入EAE大鼠腦脊液中，可使IL-4表達(dá)增加，減輕EAE的病情[12]。研究顯示，在EAE急性期IL-4水平低于正常，無法抑制INF-γ促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫反應(yīng)及其脫髓鞘作用，但在恢復(fù)期中它可通過增強Th2細(xì)胞功能，抑制Th1細(xì)胞炎性細(xì)胞因子分泌及其活化，從而促使EAE的恢復(fù)[13]。敲除IL-4基因的小鼠，T細(xì)胞及其亞群發(fā)育雖正常，但不能誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生，說明IL-4作為免疫調(diào)節(jié)因子能抑制EAE發(fā)生、發(fā)展，其作為Th2細(xì)胞因子可抑制Thl型細(xì)胞因子的相關(guān)作用及下調(diào)Thl細(xì)胞的活性[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Thl類反應(yīng)在MS與EAE體內(nèi)反應(yīng)程度增強，Th1類炎性細(xì)胞因子由于過度表達(dá)因而募集淋巴細(xì)胞進(jìn)而激活巨噬細(xì)胞并刺激產(chǎn)生氧自由基、白三烯、蛋白溶解酶TNF-α等，并且抑制如IL-4等的抗炎性作用的細(xì)胞因子分泌，最終導(dǎo)致B細(xì)胞增殖活躍，產(chǎn)生自身抗體造成髓鞘的損傷而誘發(fā)MS[15]。免疫系統(tǒng)正常運轉(zhuǎn)中，Th1與Th2細(xì)胞的平衡性是基礎(chǔ)，其失衡導(dǎo)致疾病發(fā)生，EAE病情在Th1類細(xì)胞反應(yīng)向Th2類細(xì)胞反應(yīng)漂移時有緩解趨勢。本研究結(jié)果顯示，LEF防治組小鼠發(fā)病高峰期IL-4水平、IL-4/INF-γ值較EAE對照組增強，分泌INF-γ能力較EAE對照組減弱，說明LEF能使EAE小鼠外周血Th1/Th2恢復(fù)平衡，促使Th0分化向Th2漂移而發(fā)揮對EAE的保護(hù)作用。

總之，LEF能對EAE發(fā)揮防治作用：延長EAE發(fā)病潛伏

期、縮短進(jìn)展期、降低神經(jīng)功能障礙評分，且劑量依賴關(guān)系作用效果明顯。其保護(hù)作用可能與促使Th0分化向Th2漂移，促使Th1/Th2恢復(fù)平衡有關(guān)。LEF為防治MS提供了新的研究方向，而LEF對Th1及Th2細(xì)胞水平產(chǎn)生影響的具體機制有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Pimentel ML.Natalizumab and multiple sclerosis[J].Arq Neuropsiquiatr,2013,71(3):135-136.

[2]Jahan A,Dewan V,Yadav TP.Leflunomide in systemic onset Juvenile idiopathic arthritis[J].Indian pediatrics,2012,49(9):750-752.

[3]Tomos P,Lachanas E,Agathos EA,etal.Pulmonary aspergillosis in chronic leflunomide treatment[J].Surg Infect(Larchmt),2012,13(4):282-283.

[4]Brod SA,Hood ZM.Ingested (oral) SST inhibits EAE[J].Autoimmunity,2011,44(5):437-443.

[5]Lee SW,Park HJ,Kim BK,etal.Leflunomide increases the risk of silent liver fibrosis in patients with rheumatoid arthritis receiving methotrexate[J].Arthritis Res Ther,2012,14(5):R232.

[6]Ma X,Jiang Y,Wu A,etal.Berberine attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in C57 BL/6 mice[J].PLoS One,2010,5(10):e13489.

[7]Munari CC,Furtado RA,Santiago ML,etal.Inhibitory effects of Baccharis dracunculifolia on 1,2-dimethylhidrazine-induced genotoxicity and preneoplastic lesions in rat colon[J].Eur J Cancer Prev，2014,23(4):240-245.

[8]Jaini R,Altuntas CZ,Loya MG,etal.Disruption of estrous cycle homeostasis in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Neuroimmunol，2015,279:71-74.

[9]Becker H,Stuifbergen A,Morrison J.Promising New Approaches to Assess Cognitive Functioning in People with Multiple Sclerosis[J].Int J MS care,2012,14(2):71-76.

[10]Begg DJ,De Silva K,Carter N,etal.Does a Th1 over Th2 dominancy really exist in the early stages of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis infections?[J].Immunobiology,2011,216(7):840-846.

[11]Chen P,Zhang Z,Chen Q,etal.Expression of Th1 and Th2 cytokine-associated transcription factors,T-bet and GATA-3,in the eutopic endometrium of women with endometriosis[J].Acta Histochem,2012,114(8):779-784.

[12]Matejuk A,Dwyer J,Ito A,etal.Effects of cytokine deficiency on chemokine expression in CNS of mice with EAE[J].J Neurosci Res,2002,67(5):680-688.

[13]Gregory GD,Raju SS,Winandy S,etal.Mast cell IL-4 expression is regulated by Ikaros and influences encephalitogenic Th1 responses in EAE[J].J Clin Invest,2006,116(5):1327-1336.

[14]Kelly KA,Whitacre CC.Oral tolerance in EAE:reversal of tolerance by T helper cell cytokines[J].J Neuroimmunol,1996,66(1/2):77-84.

[15]Lukic ML,Mensah-Brown E,Galadari S,etal.Lack of apoptosis of infiltrating cells as the mechanism of high susceptibility to EAE in DA rats[J].Dev Immunol,2001,8(3/4):193-200.

Effect of Leflunomide on the Balance of Th1/Th2 in Experimental Allergic Encephalomyelitis MiceYUANZheng-zhou1a,LIZuo-xiao1a,LIJing-lun1a,YANGBo1b,LINYang1b,LILan2.(1a.DepartmentofNeurology,1b.DepartmentofInterventionalRadiology,AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China; 2.NursingSchoolofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of leflunomide(LEF) on experimental allergic encephalomyelitis(EAE) mice and the possible immunological mechanisms.MethodsTotal of 36 female C57BL/6 mice were randomly divided into large and small doses of LEF treatment group and the EAE control group,n=12.Myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 was used to build EAE model.From three days before the beginning of the control group and modeling large and small doses of LEF treatment group were fed saline,LEF 8 mg/(kg·d),LEF 2 mg/(kg·d) for 10 days.Incidence and peripheral blood interleukin 4 (IL-4),interferon γ(INF-γ) levels and ratios in the mice were observed.ResultsCompared with the control group,each LEF treatment group mice had mild clinical symptoms,and peripheral blood IL-4,IL-4/INF-γ values increased(P<0.01),INF-γ levels significantly reduced(P<0.01),and compared with the small doses LEF treatment group,high dose reduction was more significant.ConclusionLEF has preventive effect on EAE,and the effect is dose dependent.Its prevention and treatment may be associated with regulation of the balance of Th1/Th2,and Th0 differentiation into Th1 drift.

Key words:Experimental allergic encephalomyelitis; Multiple sclerosis; Leflunomide; Th1/Th2 balance

收稿日期：2014-07-17修回日期：2015-02-07編輯：伊姍

基金項目：瀘州市科技計劃項目[2013-R-51(8/18)]

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.048

中圖分類號：R744.51

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)17-3201-03