崔寶林，寧曉娥

(陜西省寶雞市婦幼保健院：1.乳腺科；2.計劃生育科 721000)

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·論 著·

不同溫度熱療聯(lián)合多西紫杉醇對人乳腺癌細(xì)胞株增殖的影響

崔寶林1，寧曉娥2

(陜西省寶雞市婦幼保健院：1.乳腺科；2.計劃生育科 721000)

目的 探討亞高溫?zé)岑熉?lián)合多西紫杉醇對人乳腺癌增殖的影響及其相關(guān)機制。方法 采取四甲基偶氮唑鹽法觀察多西紫杉醇對人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞增殖的影響，且篩選出有效濃度。將體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞分為空白對照組、多西紫杉醇組及熱療與多西紫杉醇聯(lián)合組，熱療與多西紫杉醇聯(lián)合組依據(jù)不同溫度(39.0 ℃、39.5 ℃、40.0 ℃、40.5 ℃、41.0 ℃)分為5個亞組。對各組細(xì)胞予以相應(yīng)干預(yù)后，采取流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡狀況及細(xì)胞生長周期變化。結(jié)果 隨著熱療溫度上升，細(xì)胞凋亡比例漸漸增高，41.0 ℃熱療時凋亡率[(38.90±6.88)%]最高，顯著高于單一應(yīng)用多西紫杉醇與其他各亞組；c-Jun氨基末端激酶在熱療溫度為41.0 ℃時達(dá)到最高值，而細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2、p-p38蛋白表達(dá)在熱療溫度為40.0 ℃達(dá)到最高值，同其余亞組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；熱療與多西紫杉醇聯(lián)合等亞組G2/M期細(xì)胞比例明顯多于單一使用多西紫杉醇組，抑制MCF-7細(xì)胞周期進程的效應(yīng)明顯強于多西紫杉醇，且隨著熱療溫度增加，G2/M期細(xì)胞比例增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。熱療與多西紫杉醇聯(lián)合組絲裂原活化蛋白激酶通路蛋白表達(dá)較多西紫杉醇組顯著增強，Bcl-2蛋白表達(dá)則明顯降低，而Bax蛋白表達(dá)有輕微升高。結(jié)論 亞高溫?zé)岑熉?lián)合多西紫杉醇干預(yù)能抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，其治療機制可能與激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、p38蛋白有關(guān)。

熱療；多西紫杉醇；乳腺癌

迄今為止，臨床治療乳腺癌的主要方法有手術(shù)切除、術(shù)后化學(xué)治療、放射治療、熱療及內(nèi)分泌治療等[1]。有報道指出，熱療能夠提高化療藥物的細(xì)胞毒性，與化學(xué)治療聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抗腫瘤的作用[2-3]。臨床上認(rèn)為，低于41.0 ℃的亞高溫?zé)岑熤饕墙?jīng)過調(diào)理免疫功能而起到抗腫瘤作用，不能夠協(xié)同化學(xué)治療藥物殺滅腫瘤細(xì)胞，然而也有報道提出，一些乳腺癌患者在溫度為39.0 ℃時，化療效果比較顯著[4]。鑒于此，本研究主要探討不同溫度熱療聯(lián)合化療是否對乳腺癌細(xì)胞株的增殖產(chǎn)生影響及其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供，多西紫杉醇注射液(20毫升/支)由上海復(fù)興醫(yī)藥有限公司提供，胎牛血清、高糖DMEM(DMEM)培養(yǎng)基、兔抗p-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、ERK 1/2、p-c-Jun氨基末端激酶(JNK)/SAPK、JNK/SAPK、甘油醛-3-磷酸脫氫酶一抗、四甲基偶氮唑鹽、p-p38一抗、鼠抗Bcl-2、Bax一抗均由美國Sigma公司提供，F(xiàn)ACSort流式細(xì)胞儀由日本Beeton Dickson公司提供。

1.2 乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng) 在10%濃度小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞，將培養(yǎng)基置于CO2體積分?jǐn)?shù)為0.05的37.0 ℃培養(yǎng)箱中孵育，選取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞用于試驗。

1.3 檢測MCF-7細(xì)胞的凋亡率 選取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞用于試驗，將其分為對照組(不作任何處理)、熱療與多西紫杉醇聯(lián)合組、多西紫杉醇組，熱療與多西紫杉醇聯(lián)合組又依據(jù)不同熱療溫度，將其分為39.0、39.5、40.0、40.5、41.0 ℃等5個亞組，與多西紫杉醇在對應(yīng)溫度的恒溫水浴箱中共同作用2 h后，接著培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)后的細(xì)胞，每組細(xì)胞以4.0 ℃ 磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，制備成單細(xì)胞懸浮液；將細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升1×106個,另取100 μL細(xì)胞懸浮液，加入10 μL PI溶液與5 μL Annexin V/FITC后，充分混勻，避光常溫培養(yǎng)15 min，再加入400 μL PBS應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.4 檢測MCF-7細(xì)胞周期 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞分組情況及處理方法同上，操作結(jié)束后將每組細(xì)胞置于CO2體積分?jǐn)?shù)為0.05的37.0 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以4.0 ℃PBS清洗培養(yǎng)過的細(xì)胞后，再經(jīng)80%乙醇固定，置于-20.0 ℃環(huán)境下，隔日再用。用PBS清洗各組固定細(xì)胞后，在遮光常溫環(huán)境下應(yīng)用PI染色，30 min后再上樣，采取Modfit 3軟件對每組細(xì)胞生長周期狀況進行檢測。

1.5 多藥耐藥基因產(chǎn)物P糖蛋白、絲裂原活化蛋白激酶、Bcl-2、Bax及MCF-7細(xì)胞熱休克因子檢測 各組細(xì)胞處理方法同上，結(jié)束后應(yīng)用蛋白裂解緩沖液(含苯甲磺酰氟1 mmol/L、正釩酸鈉1 mmol/L、十二烷基磺酸鈉0.1%、去氧膽酸鈉1%、NP-40.1%、氯化鈉150 mmol/L)分別水解每組細(xì)胞，獲得總蛋白，檢測總蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清蛋白。按照蛋白定量試劑盒說明書擬定蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，采取紫外分光光度計測定吸光度A值(595 nm處)，算出蛋白濃度。將全部蛋白樣品的濃度調(diào)節(jié)成等濃度后，經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，密閉后加入一抗，培養(yǎng)后滴加對應(yīng)過氧化物酶結(jié)合的二抗。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒測定雜交信號，分別檢測各樣品中ERK1/2、JNK、p38及Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)狀況。

2 結(jié) 果

2.1 不同溫度熱療與多西紫杉醇聯(lián)合對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 見圖1。通過顯微鏡觀察MCF-7細(xì)胞凋亡狀態(tài)，細(xì)胞發(fā)生皺縮，體積變小，變圓，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞透明度減小，呈棕黑色。隨著熱療溫度上升，細(xì)胞凋亡比例漸漸增高，41.0 ℃熱療時凋亡率[(38.90±6.88)%]最高，顯著高于單一應(yīng)用多西紫杉醇與其他各亞組的細(xì)胞凋亡率。

注：與對照組相比，aP<0.05；與多西紫杉醇組相比，bP<0.05。

圖1 熱療聯(lián)合多西紫杉醇對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

2.2 熱療聯(lián)合多西紫杉醇對MCF-7細(xì)胞生長周期的影響 見表1。熱療與多西紫杉醇聯(lián)合等亞組G2/M期細(xì)胞比例明顯多于單一使用多西紫杉醇組，抑制MCF-7細(xì)胞周期進程的效應(yīng)明顯強于多西紫杉醇，且隨著熱療溫度增加，G2/M期細(xì)胞比例增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 熱療與多西紫杉醇聯(lián)合對MCF-7細(xì)胞生長周期影響

注：與多西紫杉醇組相比，aP<0.05。

2.3 熱療與多西紫杉醇聯(lián)合對MCF-7細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)表達(dá)的影響 見圖2。熱療與多西紫杉醇聯(lián)合會導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞中MAPK p-ERK1/2、p-JNK、p-p38蛋白表達(dá)顯著增強，其中p-JNK蛋白在熱療溫度為41.0 ℃時達(dá)最高值，p-ERK1/2、p-p38蛋白表達(dá)在熱療溫度為40.0 ℃達(dá)最高值，同其余亞組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 熱療與多西紫杉醇聯(lián)合對MCF-7細(xì)胞MAPK表達(dá)的影響

2.4 MCF-7細(xì)胞凋亡蛋白Bax及Bcl-2表達(dá)的影響 見圖3。MCF-7細(xì)胞經(jīng)過熱療與多西紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用后，Bax蛋白表達(dá)較空白對照組及多西紫杉醇組略有增多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,不同熱療溫度亞組組間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。多西紫杉醇可導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，熱療與多西紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)較單一應(yīng)用多西紫杉醇進一步減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，不同熱療溫度亞組組間Bcl-2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 熱療與多西紫杉醇聯(lián)合對MCF-7細(xì)胞Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

乳腺癌對全球范圍內(nèi)女性健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，其發(fā)病率逐年增加[5]。隨著醫(yī)學(xué)研究的持續(xù)拓展，廣大臨床工作者已經(jīng)接受了乳腺癌為全身性疾病這一理念，治療方案也發(fā)生改變，手術(shù)切除不再是僅有的治療手段，治療重點由乳腺組織漸漸轉(zhuǎn)至全身，新的分子靶向治療、內(nèi)分泌治療、輔助治療、熱療及放射治療等成為醫(yī)治乳腺癌的重要方法[6-7]。因熱療具有不良反應(yīng)輕微，且與化療、放療聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)等優(yōu)勢，逐漸得到臨床關(guān)注。

3.1 不同熱療溫度聯(lián)合多西紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞株凋亡率的影響 臨床上關(guān)于熱療治療腫瘤的有效溫度一直都存在很大爭議[8]。大量基礎(chǔ)研究表明，不論是應(yīng)用水浴箱加熱、紅外線輻射，還是微波熱療等加熱方式，熱療發(fā)揮抗腫瘤作用的有效溫度范圍為42.0～45.0 ℃[9-11]。由于熱療對治療設(shè)備有較高要求及人體體溫限制，42.0～45.0 ℃熱療在臨床實踐中不能大量應(yīng)用，而且單一熱療殺滅腫瘤細(xì)胞存在局限性，總體治療效果欠佳。因而近年來，國內(nèi)外對熱療適宜溫度的研究重點主要集中于40.0～41.0 ℃。關(guān)于40.0～41.0 ℃熱療有無抗腫瘤效應(yīng)的臨床結(jié)論不一致。蔣東等[12]在對肺癌細(xì)胞予以加熱時，40.0 ℃即可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Yamada等[13]認(rèn)為，39.0～41.0 ℃可以進一步激活人體體液免疫及細(xì)胞免疫系統(tǒng)，進而提高人體的抗腫瘤免疫功能。

本研究結(jié)果顯示，41.0 ℃熱療與多西紫杉醇聯(lián)合組乳腺癌細(xì)胞株凋亡率明顯高于其他熱療亞組及多西紫杉醇組，說明與單一應(yīng)用多西紫杉醇相比，熱療與多西紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用可引起乳腺癌細(xì)胞株凋亡增加。提示亞高溫?zé)岑?41.0 ℃)聯(lián)合多西紫杉醇具有協(xié)同殺滅腫瘤細(xì)胞的作用。且隨著熱療溫度上升至41.0 ℃,凋亡的細(xì)胞數(shù)目持續(xù)增加。分析可能的原因有:(1)多西紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞株MCF-7比較敏感，抑制乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的效用與劑量相關(guān)，細(xì)胞毒性隨濃度提高而增強。(2)熱療溫度控制在40.5～43.0 ℃時，多種化療藥物的細(xì)胞毒性效應(yīng)達(dá)到最大。(3)MAPKs可經(jīng)一系列信號傳導(dǎo)途徑，將胞外刺激傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞內(nèi)最關(guān)鍵的一條信號傳導(dǎo)通路，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中有重大意義。有關(guān)研究指出，MAPK蛋白在乳腺癌發(fā)病機制中也有參與，哺乳動物細(xì)胞MAPK蛋白系族中多個成員(如ERK、JNK、p38等)均已證實同乳腺癌緊密相關(guān)[14]；MAPK通路被激活以后，ERK、JNK、p38等通路也會隨著激活。本研究結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞經(jīng)熱療及多西紫杉醇聯(lián)合處理后，細(xì)胞內(nèi)p-p38、p-JNK及p-ERK1/2蛋白表達(dá)均顯著增多，其中p38、JNK等通路活化產(chǎn)生的生物作用同細(xì)胞凋亡相關(guān)，這也可能是熱療與多西紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用促進腫瘤細(xì)胞凋亡作用優(yōu)于單一應(yīng)用多西紫杉醇的原因之一。另外，p-p38與p-ERK1/2蛋白表達(dá)在熱療溫度高于40.0 ℃時開始漸漸下降，具體機制尚不明確。

3.2 不同溫度熱療聯(lián)合多西紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞株增殖的影響 本研究結(jié)果顯示，多西紫杉醇能使MCF-7細(xì)胞的生長周期停滯于G2/M期，熱療聯(lián)合多西紫杉醇處理可促進G2期MCF-7細(xì)胞數(shù)量上升，且滯留在G2期的細(xì)胞比例隨熱療溫度升高而增多。此外，40.0、40.5、41.0 ℃熱療與多西紫杉醇聯(lián)合等亞組G2/M期細(xì)胞比例明顯多于單一使用多西紫杉醇組，抑制MCF-7細(xì)胞周期進程的效應(yīng)明顯強于多西紫杉醇，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著熱療溫度上升至41.0 ℃，G2/M期細(xì)胞比例逐漸增加。提示熱療可協(xié)同多西紫杉醇引起更多腫瘤細(xì)胞生長停滯于G2/M期,進而發(fā)揮阻礙腫瘤細(xì)胞分裂及增殖的作用。

有研究指出，腫瘤細(xì)胞中Bcl-2基因的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展緊密相關(guān)，Bcl-2基因表達(dá)缺失或者下調(diào)能夠提高MCF-7細(xì)胞對多西紫杉醇化療的敏感性，此現(xiàn)象可能與乳腺癌細(xì)胞株MCF-7雌激素受體的表達(dá)有關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，多西紫杉醇可導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，熱療與多西紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)較單一應(yīng)用多西紫杉醇進一步減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，不同熱療溫度亞組組間Bcl-2蛋白表達(dá)差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示熱療與多西紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制Bcl-2通路，促進細(xì)胞凋亡，進而抑制MCF-7細(xì)胞增殖。

綜上所述，亞高溫?zé)岑熉?lián)合多西紫杉醇干預(yù)能抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，其治療機制可能與p-ERK、JNK、p38蛋白有關(guān)。

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Synergistic effect of docetaxel plus hyperthermia of different temperatures on the proliferation of human breast carcinoma cells

CUIBao-lin1,NINGXiao-e2

(1.DepartmentofGalactophore;2.DepartmentofFamilyPlanning,MaternalandChildHealthHospitalofBaojiCity,Baoji,Shaanxi721000,China)

Objective To explore the synergistic effect of docetaxel plus mild hyperthermia on the proliferation of human breast carcinoma cells and its mechanism.Methods MTT assay was used to test the inhibitory effect of docetaxel on the proliferation of human breast carcinoma MCF-7 cells,and the effective concentration of docetaxel was screened.The human breast carcinoma MCF-7 cells cultured in vitro were divided into blank control group,docetaxel group and docetaxel plus hyperthermia group.The docetaxel plus hyperthermia group was divided into 5 subgroups (39.0 ℃ group,39.5 ℃ group,40.0 ℃ group,40.5 ℃ group and 41.0 ℃ group),according to the different temperatures of hyperthermia.Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis and the change of cell growth cycle in every group after intervention.Results The apoptosis rate of cells increased with the temperature of hyperthermia.41.0 ℃ group had the highest apoptosis rate of cells [(38.90±6.88)%],which was significantly higher than docetaxel group and other subgroups of docetaxel plus hyperthermia group.The activity of c-Jun amino-terminal kinase reached maximum when the hyperthermia temperature was 41.0 ℃,while the activities of ERK1/2 and p-p38 reached maximum when the hyperthermia temperature was 40.0 ℃,which was significantly different from other subgroups of docetaxel plus hyperthermia group(P<0.05).The proportions of cells at G2/M phase in the subgroups of docetaxel plus hyperthermia group were significantly higher than docetaxel group.The inhibitory effect of docetaxel plus hyperthermia on the MCF-7 cell cycle was stronger than docetaxel alone.The proportion of cells at G2/M phase increased with the hyperthermia temperature,with statistical difference(P<0.05).Compared with docetaxel group,the expression level of mitogen activated protein kinase pathway protein in docetaxel plus hyperthermia group was significantly higher,the expression level of Bcl-2 significantly reduced,and the expression level of Bax slightly increased.Conclusion Docetaxel plus hyperthermia could inhibit the proliferation of human breast carcinoma cells and induce the apoptosis,which showed a synergistic antitumor effect.The mechanism might relate with the activation of extracellular regulated protein kinase,c-Jun amino-terminal kinase and p38.

hyperthermia；docetaxel；breast carcinoma

崔寶林，男，本科，主治醫(yī)師，主要從事乳腺方面相關(guān)臨床研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.029

A

1672-9455(2015)23-3522-03

2015-03-25

2015-06-12)