高正琴，岳秉飛

四翼無刺線蟲形態(tài)和分子鑒定

高正琴，岳秉飛

目的 四翼無刺線蟲是一種重要的人獸共患寄生蟲病的病原，其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的感染危害嚴(yán)重。然而，缺乏有效檢測(cè)鑒定四翼無刺線蟲的技術(shù)。本研究目的是建立四翼無刺線蟲診斷方法，為國家標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供科學(xué)依據(jù)。方法 應(yīng)用直接鏡檢法對(duì)腸道中的四翼無刺線蟲進(jìn)行篩查。應(yīng)用多重PCR和測(cè)序技術(shù)鑒定四翼無刺線蟲特定基因nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA。結(jié)果 采用直接鏡檢實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視頻技術(shù)在腸道中檢出數(shù)量眾多的四翼無刺線蟲蟲卵、幼蟲和成蟲。根據(jù)四翼無刺線蟲的卵細(xì)胞、幼蟲、雌雄成蟲的大小和形態(tài)來鑒定蟲種。應(yīng)用多重PCR和測(cè)序技術(shù)從分離獲得的四翼無刺線蟲中鑒定出特定基因nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA，與其他不同種寄生蟲無交叉反應(yīng)。SPF和清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲感染率分別為41.5%和40.8%。結(jié)論 直接鏡檢法和多重PCR結(jié)合測(cè)序技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)鑒定出四翼無刺線蟲。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在四翼無刺線蟲的傳播中可能起著重要的儲(chǔ)存作用。因此，需要考慮該寄生蟲的潛在健康危害，以防傳染人類。

四翼無刺線蟲；直接鏡檢；多重PCR；測(cè)序

四翼無刺線蟲(Aspiculuristetraptera)隸屬于線蟲綱(Class Nematoda)、尖尾目(Order Oxyurida)、尖尾科(Family Oxyuroidea)、無刺屬(Genus Aspiculuris)，又稱蟯蟲(Pinworm)，可引起蟯蟲病(enterobiasis)，呈世界性分布，寄生于腸道，生活史屬直接型，輕度感染時(shí)無明顯癥狀，嚴(yán)重時(shí)引起糞便嵌塞、直腸脫垂、腸套疊和腸炎等疾病，糞檢發(fā)現(xiàn)蟲卵或尸檢發(fā)現(xiàn)蟲體即可確診[1-3]。

近年來，SPF(Specific Pathogen-Free，無特定病原體)和清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已廣泛應(yīng)用于食品藥品生物制品醫(yī)療器械的檢定和研究。中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 14922.1-2001)規(guī)定：蠕蟲是SPF和清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均應(yīng)排除的寄生蟲項(xiàng)目之一，但國家標(biāo)準(zhǔn)中未見四翼無刺線蟲的檢測(cè)方法[4-5]。因此，快速準(zhǔn)確檢測(cè)四翼無刺線蟲是一個(gè)重要問題。目前，尚未見不同方法檢測(cè)鑒定SPF和清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲的報(bào)道和有效數(shù)據(jù)。本研究應(yīng)用直接鏡檢和多重PCR(multiple-PCR)結(jié)合多基因測(cè)序技術(shù)，對(duì)SPF和清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲感染進(jìn)行檢測(cè)鑒定和調(diào)查研究，為國家標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供技術(shù)支撐和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備 生物安全柜(Thermo Fisher Scientific，美國)；LEICA DM2500生物顯微鏡(Leica Microsystems，德國)；倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)(Nikon，日本)；二氧化碳培養(yǎng)箱(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；基因擴(kuò)增儀(Applied Biosystyem，美國)；凝膠成像分析系統(tǒng)(東樂自然基因生命科學(xué)公司)。

1.2 樣品來源 293只SPF和清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來自18個(gè)生產(chǎn)廠家。安樂死后采腸樣本待檢。

1.3 直接鏡檢 取待測(cè)樣本，放入潔凈離心管中，加入生理鹽水，輕輕吹打混勻，室溫孵育30 min；棄上清，沉淀以生理鹽水重新懸浮，室溫孵育20 min；棄上清，沉淀以生理鹽水重新懸浮，室溫孵育15 min；棄上清，沉淀以生理鹽水充分混勻，吸取混合液滴片，直接鏡檢，采用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視頻攝錄結(jié)果。根據(jù)蠕蟲的蟲卵、幼蟲、成蟲的形態(tài)和大小來進(jìn)行蟲種的鑒定。

1.4 蟲體和蟲卵離體生存能力試驗(yàn) 取待測(cè)樣本，放入潔凈離心管中，加入磷酸鹽緩沖液，輕輕吹打混勻，室溫靜置5 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀重新以磷酸鹽緩沖液吹打懸浮，小心收集數(shù)條鮮活蟲體和數(shù)只蟲卵，放置于新鮮配制的含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃ 5% CO2實(shí)驗(yàn)條件下放置，倒置顯微鏡下觀察蟲體和蟲卵存活狀態(tài)，實(shí)時(shí)拍攝記錄結(jié)果。

1.5 多重PCR和測(cè)序 針對(duì)四翼無刺線蟲的特定基因nd1(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基1，NADH dehydrogenase subunit 1)、nd5(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基5，NADH dehydrogenase subunit 5)、cox1(細(xì)胞色素C過氧化物酶亞基1，cytochrome c oxidase subunit 1)、cytb(細(xì)胞色素b，cytochrome b)、ITS2(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2，internal transcribed spacer 2)和28S rRNA(28S核糖體核糖核酸，28S ribosomal RNA)設(shè)計(jì)六對(duì)引物。多重PCR引物名稱、序列和產(chǎn)物大小見表1。同上收集待測(cè)樣本中數(shù)條鮮活蟲體，放置于潔凈離心管中，用德國Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒，按說明書操作提取樣品基因組DNA。以抽提的待測(cè)蟲體樣本DNA為模板，同時(shí)用隱匿管狀線蟲(Syphaciaobvelata)、鼠管狀線蟲(Syphaciamuris)DNA作為多重PCR陰性對(duì)照。PCR總反應(yīng)體系為50 μL，包括10 × Buffer (Mg2+Plus) 5.0 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、正反向引物(1.0 μmol/μL)各0.5 μL、EX Taq(5 U/μL)0. 25 μL、模板DNA 5.0 μL、nuclease-free water 34.75 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 1 min 1 cycle；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 cycles；72 ℃ 10 min 1 cycle。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。陽性樣本作測(cè)序鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 直接鏡檢結(jié)果 吸取SPF和清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸樣本中鮮活蟲體，快速滴片，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視頻攝錄記載蟲體形態(tài)特征及運(yùn)動(dòng)方式：鏡下觀察，可見數(shù)量眾多的外觀略呈無色透明的鮮活蠕蟲蟲體游走蠕動(dòng)，處于不同分化時(shí)期的蟲卵和幼蟲數(shù)量較多。雌蟲長(zhǎng)2.86～3.97 mm，口孔在蟲體頭部頂端，有3個(gè)唇瓣環(huán)繞，口孔兩旁有明顯的半橢圓形的頭泡。頭部有寬的頸翼，頸翼膜起自頭泡、終于食道基部。食道前部呈棒狀，后為一卵圓形食道球(圖1)。卵巢2條，起始于食道基部。陰門開口于蟲體中部，子宮壁粗厚，子宮內(nèi)有成熟卵(圖2)。尾部呈圓錐狀(圖3)。雄蟲長(zhǎng)2.13～3.64 mm，有寬尾翼，無交合刺和引器(圖4)。蟲卵無色透明，呈對(duì)稱的橢圓形，大小為(86～97)μm×(37～49)μm，內(nèi)含物為桑椹期胚細(xì)胞，胚細(xì)胞與卵殼間有空隙，卵殼薄(圖5)。依據(jù)蠕蟲蟲體的形態(tài)、大小、構(gòu)造和蟲卵的形狀、大小、顏色、卵殼特征，鑒定為四翼無刺線蟲。

2.2蟲體和蟲卵離體生存能力試驗(yàn)結(jié)果 將從待測(cè)樣本中收集到的四翼無刺線蟲蟲體和蟲卵，37 ℃ 5% CO2實(shí)驗(yàn)條件下放置，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在37 ℃四翼無刺線蟲離體至少能夠存活兩周。第8 d時(shí)，四翼無刺線蟲蟲卵具胚胎(圖6)。第10 d時(shí)，四翼無刺線蟲雌蟲顯得倦怠行動(dòng)遲緩(圖7)，雄蟲活力減弱尚可運(yùn)動(dòng)(圖8)。第14 d后，四翼無刺線蟲蟲體已無自主運(yùn)動(dòng)能力，出現(xiàn)死亡。

表1 多重PCR引物

圖1 四翼無刺線蟲雌性成蟲前部

圖2 四翼無刺線蟲雌性成蟲腹部

2.3 多重PCR結(jié)果 在上述收集到的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)條鮮活蟲體樣品中均檢測(cè)出四翼無刺線蟲特定基因nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA基因特異性DNA片段(大小分別為405 bp、435 bp、561 bp、282 bp、397 bp和600 bp)，而作為陰性對(duì)照的隱匿管狀線蟲、鼠管狀線蟲樣本卻未觀察到目的基因片段擴(kuò)增。圖9顯示的是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲多重PCR擴(kuò)增獲得了清晰特異的nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA基因目的條帶。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA基因序列測(cè)定分析結(jié)果與國際上已公布的四翼無刺線蟲基因序列同源性為100%(GenBank登錄號(hào)為KF444331.1，KF444351.1，KF444311.1，KF444291.1，KJ143618.1和KF771644.1)。分子鑒定結(jié)果證明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自然感染的確實(shí)是四翼無刺線蟲。

圖3 四翼無刺線蟲雌性成蟲尾部

圖4 四翼無刺線蟲雄性成蟲尾部

圖5 四翼無刺線蟲蟲卵

圖6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲蟲卵在37℃ 5% CO2第8 d鏡檢形態(tài)

Fig.6 Microscopy morphology ofAspiculuristetrapteraegg isolated from laboratory animal under 37℃ for 5% CO2on day 8

圖7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲雌性成蟲在37℃ 5% CO2第10 d鏡檢形態(tài)

Fig.7 Microscopy morphology ofAspiculuristetrapterafemale adult isolated from laboratory animal under 37℃ for 5% CO2on day 10

圖8 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲雄性成蟲在37 ℃ 5% CO2第10 d鏡檢形態(tài)

Fig.8 Microscopy morphology ofAspiculuristetrapteramale adult isolated from laboratory animal under 37℃ for 5% CO2on day 10

圖9 多重PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲nd1(405 bp)、nd5(435 bp)、cox1(561 bp)、cytb(282 bp)、ITS2(397 bp)和28S rRNA(600 bp)基因特異性DNA片段瓊脂糖凝膠電泳

Fig.9 Agarose gel electrophoresis of multiplex PCR products amplified by primers targeted nd1 (405 bp), nd5 (435 bp), cox1 (561 bp), cytb (282 bp), ITS2 (397 bp) and 28S rRNA (600 bp) genes specific DNA of genomic DNA extracted fromAspiculuristetrapteraisolated from laboratory animal

結(jié)果顯示，直接鏡檢法和多重PCR結(jié)合測(cè)序技術(shù)均能檢測(cè)出四翼無刺線蟲。在SPF和清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中檢出數(shù)量眾多的四翼無刺線蟲蟲體和蟲卵，鑒定出四翼無刺線蟲特定基因nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA基因。13個(gè)生產(chǎn)廠家31批195只SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲檢出率41.5%(81/195)。5個(gè)生產(chǎn)廠家10批98只清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲檢出率40.8%(40/98)。

3 討 論

Behnke[6]報(bào)道英國野鼠四翼無刺線蟲感染發(fā)病率達(dá)56%。Kia[7]報(bào)道伊朗野鼠四翼無刺線蟲感染率達(dá)11.8%。Pritchett[8]報(bào)道北美普通級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠四翼無刺線蟲感染率為0.19%。Bazzano[9]報(bào)道巴西普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲感染率達(dá)8.5%。Dole[10]報(bào)道美國SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠四翼無刺線蟲感染率達(dá)9.2%。我們的研究調(diào)查結(jié)果顯示我國SPF和清潔級(jí)動(dòng)物四翼無刺線蟲感染率分別為41.5%和40.8%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物寄生蟲感染可為人體感染寄生蟲病起到一定的儲(chǔ)存和傳播病原的作用，在流行病學(xué)上具有重要意義。人獸共患病名錄中人獸共患寄生蟲病69種，我國存在60種[11-13]。最近我國時(shí)有SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因人獸共患寄生蟲感染致死的報(bào)道[14-15]。由此可見，我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染人獸共患寄生蟲的現(xiàn)狀不容樂觀，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攜帶的人獸共患寄生蟲病原體，不僅污染環(huán)境、飲水、飼料、墊料、空氣，同時(shí)也對(duì)人類健康造成危害，已污染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于食品藥品生物制品醫(yī)療器械檢定后果不堪設(shè)想。因此，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)廠家和飼養(yǎng)繁育單位一定要重視人獸共患寄生蟲病原體的生物安全性問題，一定要及時(shí)對(duì)已污染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的糞便、墊料、籠器具等進(jìn)行徹底的滅菌消毒并作無害化處理，避免污染公共水源和周邊環(huán)境，強(qiáng)化公共衛(wèi)生安全防控意識(shí)，保護(hù)人民身體健康，保障人民用藥安全。

Hsieh[16]報(bào)道四翼無刺線蟲蟲卵能在水中具胚胎，這一特征可使其在宿主體外依然有生存力。Phillipson[17]報(bào)道四翼無刺線蟲感染潛伏期為21～25 d，幼蟲在結(jié)腸內(nèi)孵化，成蟲遷移到遠(yuǎn)端結(jié)腸前逗留3～5 d，一條成年雌性四翼無刺線蟲平均每天產(chǎn)卵17個(gè)，5～8 d后成為感染性蟲卵，雌性四翼無刺線蟲壽命為45～50 d。本文作者在37℃ 5% CO2實(shí)驗(yàn)條件下研究發(fā)現(xiàn)，四翼無刺線蟲蟲卵在體外第8 d時(shí)具胚胎有感染性，雌性和雄性成蟲離體能存活兩周。本研究獲得的寄生蟲可作為模式生物，用于抗寄生蟲藥物篩選研究，也可作為人類寄生蟲疾病動(dòng)物模型制備材料，用于寄生蟲致病機(jī)理的深入研究。

Parel[18]報(bào)道用核糖體rDNA基因作為鑒定四翼無刺線蟲的靶基因，但在PCR擴(kuò)增后還需要酶切電泳，操作繁瑣易污染。而我們的研究則將經(jīng)典的形態(tài)學(xué)檢查鑒定方法和最新的分子生物學(xué)檢測(cè)鑒定方法結(jié)合起來應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四翼無刺線蟲感染診斷調(diào)查，首先采用直接鏡檢實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視頻技術(shù)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道四翼無刺線蟲，獲得了雌雄成蟲、幼蟲和蟲卵獨(dú)特形態(tài)構(gòu)造寶貴視頻資料；同時(shí)應(yīng)用多重PCR和測(cè)序技術(shù)對(duì)分離獲得的四翼無刺線蟲成蟲、幼蟲和蟲卵進(jìn)行多基因特征的確證，鑒定核實(shí)了四翼無刺線蟲特定的nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA基因，可作為今后四翼無刺線蟲檢測(cè)鑒定的靶標(biāo)，獲得的多位點(diǎn)基因數(shù)據(jù)可用于四翼無刺線蟲遺傳多樣性研究，為國家標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了技術(shù)支撐和參考依據(jù)。

歐洲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)[19]制定了統(tǒng)一的歐洲標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定實(shí)驗(yàn)小鼠、大鼠、地鼠、沙鼠、豚鼠、兔必檢無刺線蟲屬。日本中央實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定必檢四翼無刺線蟲。隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和對(duì)外交流增加，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域中作用也愈顯重要，因此，適應(yīng)全球經(jīng)濟(jì)一體化，研究國外標(biāo)準(zhǔn)，以我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物寄生蟲監(jiān)測(cè)調(diào)研基礎(chǔ)數(shù)據(jù)作為科學(xué)依據(jù)，修訂完善國家標(biāo)準(zhǔn)顯得非常必要，這需要更多確定的研究予以支持。

綜上所述，直接鏡檢法和多重PCR結(jié)合測(cè)序技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)鑒定出四翼無刺線蟲。四翼無刺線蟲是一種重要的人獸共患寄生蟲病的病原，其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的感染危害嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在四翼無刺線蟲的傳播中可能起著重要的貯存作用。因此，需要考慮該寄生蟲的潛在健康危害，以防傳染人類。

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Morphological and molecular identification ofAspiculuristetraptera

GAO Zheng-qin,YUE Bing-fei

(NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050, China)

Aspiculuristetrapterais a pathogen of parasitic zoonoses, which is one of the most harmful parasites infecting laboratory animals. However, limited data are available on an effective technique for detection and identification ofAspiculuristetraptera. The aim of this study is to develop the method for diagnosis ofAspiculuristetraptera. It could provide a scientific basis for revision of national standard. Direct examination of intestines was performed to screen forAspiculuristetraptera. Moreover, multiplex-PCR and sequencing were applied to identify the parasite by constructing species-specific primers that were designed for unique regions of the nd1, nd5, cox1, cytb, ITS2 and 28S rRNA genes ofAspiculuristetraptera. Results showed that numerous ofAspiculuristetrapterawere detected in intestines by direct microscopy using real-time dynamic microscopic video.Aspiculuristetrapterawas speciated based on the morphology and size of ovum, larvae, female and male adult worm. Multiplex-PCR and sequencing were performed to identify nd1, nd5, cox1, cytb, ITS2 and 28S rRNA genes of DNA extracted from the parasite identifiedAspiculuristetraptera. This approach allowed their specific identification with no amplicon being amplified from heterogeneous DNA samples, and sequencing confirmed the identity of the sequences amplified. Direct microscopy, multiplex-PCR and sequencing can be used to detect and identifyAspiculuristetraptera. Of the SPF and cleaning laboratory animals studied,Aspiculuristetrapterawere presented overall frequencies of 41.5% and 40.8%, respectively. Direct microscopy, multiplex-PCR and sequencing are effective techniques with high specificity and sensitivity and could serve as useful tools for detection and identification ofAspiculuristetraptera. Laboratory animals may serve as an important reservoir for transmission ofAspiculuristetraptera. Therefore, the potential health hazard of the parasite needs to be considered to prevent infectivity of humans.

Aspiculuristetraptera, direct microscopy, multiplex-PCR, sequencing

Yue Bin-fei, Email: gaozhengqin@126.com

岳秉飛，Email: gaozhengqin@126.com

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.009

R383

A

1002-2694(2015)07-0635-05

2015-01-15；

2015-05-20