歐維正，陳崢宏，陳 靜，駱科文，王 燕，秦 萬，蒙 俊

基因芯片技術(shù)檢測貴州省結(jié)核分枝桿菌耐藥基因KatG和inhA

歐維正1，陳崢宏2，陳 靜1，駱科文1，王 燕1，秦 萬1，蒙 俊1

目的 了解本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌(MTB)異煙肼(INH)相關(guān)耐藥基因katG和inhA的突變特征，評價基因芯片法對MTB INH耐藥性檢測的臨床應(yīng)用價值。方法 應(yīng)用基因芯片法對經(jīng)PCR-熒光探針法鑒定為MTB陽性的2 738例病人標(biāo)本進(jìn)行INH耐藥性檢測，分析其相關(guān)耐藥基因katG和inhA的突變特征，同時應(yīng)用比例法檢測上述同期送檢的相同病人的同類型標(biāo)本經(jīng)羅氏培養(yǎng)MTB陽性菌株的INH耐藥性，比較兩種方法的檢測結(jié)果。結(jié)果 2 738例MTB核酸陽性標(biāo)本經(jīng)基因芯片法檢測，INH耐藥465例，耐藥率16.98%，其中以katG315(AGC→ACC)突變?yōu)橹鳎蛲蛔兟蕿?8.06%，其次為inhA-15(C→T)，katG315(AGC→AAC)，突變率分別為16.13%和5.59%。上述病人同期送檢的同類型標(biāo)本有1 493例經(jīng)羅氏培養(yǎng)MTB陽性，比例法檢測，INH耐藥255例，耐藥率17.08%，對應(yīng)的基因芯片法檢測結(jié)果為INH耐藥249例，耐藥率16.68%。以比例法結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法測定INH耐藥性的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值(PPV)、陰性預(yù)測值(NPV)及準(zhǔn)確性分別為85.49%、97.50%、87.55%、97.03%和95.45%。結(jié)論 本地區(qū)INH耐藥以katG315(AGC→ACC)和inhA-15(C→T)突變類型為主；基因芯片對MTB INH耐藥性檢測具有高敏感性、特異性、準(zhǔn)確性和快速性，可用于本地區(qū)MTB INH耐藥性的快速檢測。

基因芯片；異煙肼；基因突變；比例法藥物敏感性試驗；結(jié)核分枝桿菌

異煙肼(isoniazid，INH)是治療結(jié)核病的首選化學(xué)藥物，對結(jié)核病的有效控制起著重要作用。但目前結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)對INH的耐藥率已達(dá)17.6%[1]，是結(jié)核病治療失敗的一大原因。目前，對于INH耐藥性檢測的方法有多種，但大部分檢測方法所需時間較長，傳統(tǒng)方法是以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的絕對濃度法和比例法，需要2～3個月時間才能得到藥物敏感性結(jié)果。放射性快速診斷技術(shù)(BACTEC)可將耐藥性檢測時間縮短到2～4周，但仍不能滿足臨床的需要。近年來，基因芯片等分子藥敏檢測技術(shù)進(jìn)展迅速，其最大優(yōu)點(diǎn)是快速，通常1 d即可獲得藥敏結(jié)果，但也存在只能檢測主要耐藥基因常見突變位點(diǎn)的問題，并且，耐藥基因突變位點(diǎn)因國家和地區(qū)而有所差異[2-4]，其檢測的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性和地區(qū)適用性有待臨床驗證。為此，本研究從我院近兩年的17 452例臨床送檢標(biāo)本中，經(jīng)PCR-熒光探針法檢測MTB核酸后，篩選出2 738例不同病人的MTB核酸陽性標(biāo)本，應(yīng)用基因芯片法檢測MTB對INH的耐藥性，分析本地區(qū)INH相關(guān)耐藥基因katG和inhA的突變特征，同時與傳統(tǒng)比例法結(jié)果比較，為本地區(qū)基因芯片法快速檢測INH藥物敏感性的推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 2012年4月至2014年5月來自我院門診、住院病人送檢標(biāo)本共17 452例。病人來源分布于貴州省各地，年齡20 d至96歲，男：11 143人次，女：6 309人次。送檢標(biāo)本包括8 814例痰(含咽拭子)、4 064例支氣管灌洗液、2 602例胸水、195例腹水、784例腦脊液、438例穿刺液、409例分泌物、123例尿液和23例其他標(biāo)本。

1.1.2 MTB核酸提取和PCR-熒光探針法檢測試劑 為博奧生物有限公司生產(chǎn)的“晶芯?分枝桿菌核酸檢測(PCR-熒光探針法)試劑盒” [注冊號為國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2010第3400530號]。

1.1.3 MTB耐藥基因芯片法檢測試劑 為博奧生物有限公司生產(chǎn)的“晶芯?結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒(DNA微陣列芯片法)” [注冊號為國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2010第3400383號]，檢測指標(biāo)含INH耐藥相關(guān)基因katG基因和inhA基因啟動子各1個位點(diǎn)，分別為katG基因315位野生型及AGC→ACC和AGC→AAC兩個突變型，inhA基因啟動子-15位野生型及C→T突變型。

1.1.4 培養(yǎng)基 改良羅氏培養(yǎng)基、INH含藥改良羅氏培養(yǎng)基為珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司產(chǎn)品[注冊號為粵食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第2400717號]。用于比例法檢測的INH含藥培養(yǎng)基藥物終濃度為0.2 μg/mL。

1.1.5 主要儀器 ABI 7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、K30干式恒溫器(上海之信儀器有限公司)、TG16臺式高速離心機(jī)(長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司)、XW-80A型旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、TC06/G/H(b)基因擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)、生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)以及ExtractorTM36核酸快速提取儀、BioMixerTMII芯片雜交儀、SlideWasherTM8芯片洗干儀、LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀(以上均為博奧生物有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR-熒光定量法檢測MTB核酸 將17 452例標(biāo)本嚴(yán)格按試劑說明書及標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)進(jìn)行PCR熒光定量分析，以擴(kuò)增呈S型曲線且CT值<36判斷為陽性，以試劑盒自帶的陰陽性對照作為質(zhì)控。MTB核酸陽性標(biāo)本提取的DNA置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MTB INH耐藥基因芯片法檢測 篩選MTB核酸陽性標(biāo)本(MTB核酸濃度較低，CT值>32者除外)按試劑說明書及SOP進(jìn)行PCR擴(kuò)增、芯片雜交、洗滌、甩干和結(jié)果掃描判讀。以試劑盒自帶的陰陽性對照作為質(zhì)控。

1.2.3 MTB培養(yǎng)和比例法藥物敏感性試驗 上述標(biāo)本中6 142例同期送檢做MTB羅氏培養(yǎng)，對分離到的MTB菌株參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[5]進(jìn)行比例法藥物敏感性試驗，以MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC27294)為質(zhì)控菌株。

2 結(jié) 果

2.1 PCR-熒光定量檢測結(jié)果 17 452例MTB核酸檢測中，3 966例MTB核酸陽性，陽性率為22.73%(3 966/17 452)。

2.2 基因芯片法檢測結(jié)果 3 966例MTB核酸陽性標(biāo)本中，剔除825例MTB核酸濃度較低、CT值>32者，有3 141例為合格標(biāo)本，占全部陽性數(shù)的79.20%(3 141/3 966)，除去同一病人重復(fù)檢測次數(shù)后實為2 738例用于基因芯片檢測。其中，INH耐藥465例，耐藥率16.98%。突變類型包括：katG315(AGC→ACC)單一突變358例，katG315(AGC→AAC)26例，inhA-15(C→T)單一突變69例，katG315(AGC→ACC)聯(lián)合inhA-15(C→T)5例，katG基因缺失6例，katG基因缺失聯(lián)合inhA-15(C→T)1例。465例耐INH MTBkatG和inhA基因突變譜及突變率，見表1。

表1 465例耐INH MTBkatG和inhA基因突變譜及突變率

Tab.1 Gene mutation spectrum and mutation rate ofkatGandinhAresistance to INH from 465 examples

GeneLocusBasechangeMutationnumberMutationrate(%)katG315G→C36378.06G→A265.59deletion71.51inhA-15C→T7516.13

2.3 比例法檢測結(jié)果 與基因芯片檢測者為同一病人的同類型送檢標(biāo)本經(jīng)羅氏培養(yǎng)后有1 493例MTB陽性，經(jīng)比例法檢測，INH耐藥255例，敏感1 238例，耐藥率為17.08%。

2.4 基因芯片和比例法檢測INH耐藥性結(jié)果的比較 以比例法結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，255株耐藥菌株中有218株經(jīng)基因芯片法測定為INH耐藥，37株檢測為敏感；1 238株敏感菌株中1 207株經(jīng)基因芯片法檢測為敏感，31株檢測為耐藥菌株(見表2)。基因芯片法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值(PPV)、陰性預(yù)測值(NPV)及準(zhǔn)確性分別為85.49%(218/255)、97.50%[1 207/(31+1 207)]、87.55%[218/(218+31)]、97.03%[1 207/(37+1 207)]和95.45%[(218+1 207)/1 493]。

3 討 論

結(jié)核病是由MTB感染所引發(fā)的一種慢性傳染性疾病，目前全世界有1/3的人口存在潛在MTB感染，僅2007年就有927萬新發(fā)病例[6]。耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的出現(xiàn)，掀起了結(jié)核病的第3次世界流行高峰(僅2007年全球MDR病例估計數(shù)就有50萬之多)[6]，同時也嚴(yán)重阻礙了我國結(jié)核病防治工作的進(jìn)程。INH的耐藥性檢測是MDR-TB和XDR-TB篩查的主要依據(jù)之一。目前分子藥敏檢測技術(shù)日益已成為MDR-TB和XDR-TB篩查的研究熱點(diǎn)。

表2 基因芯片和比例法檢測INH耐藥性結(jié)果比較

Tab.2 Comparison of the results of gene chip and ratio to detect the resistance to INH

GenechipRatiodrugsensitivetestResistanceSensitivityResistance21831Sensitivity371207

基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)。基因芯片技術(shù)是針對不同的基因突變，設(shè)計出不同的寡核苷酸探針，并固定在固相載體上，即基因芯片，同時采用PCR技術(shù)對含突變的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段與基因芯片進(jìn)行雜交。只需少量樣品一次雜交，即可獲得該菌株對多種抗結(jié)核藥物的耐藥性結(jié)果。

研究表明，導(dǎo)致MTB對INH耐藥的主要分子機(jī)制與katG、inhA、kasA、ndh、ahpC5種基因突變[7]或缺失有關(guān)，其中過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因katG和參與分枝菌酸生物合成的烯?；€原酶編碼基因inhA發(fā)生突變可以解釋約80%以上的耐INH分離株[8]，kasA、ndh和ahpC3種基因突變僅占耐藥機(jī)制中的不足20%。在本研究中，katG315(AGC→ACC)是最主要的突變類型，inhA-15(C→T)次之，突變率分別為78.06%(363/465)和16.13%(75/465)。本研究與樂軍等的測序報道[9]基本相近。Bang等[10]對l 825例結(jié)核病患者的研究，katG315(AGC→ACC)和inhA基因啟動子-15位(C→T)突變型分別占到INH高水平耐藥和低水平耐藥的84%。可以認(rèn)為katG315(AGC→ACC)和inhA-15(C→T)是本地區(qū)INH耐藥最主要的突變類型。但也有不同的報道，西班牙katG315密碼子突變頻率為34.6%[11]，而俄羅斯的這種突變頻率高達(dá)93.6%[12]；對于inhA基因突變，吳雪瓊[13]等人的實驗結(jié)果為20%，朱中元[14]等人的研究結(jié)果則為65%。由此可見耐藥基因突變具有明顯的地區(qū)差異，因此，每個國家和地區(qū)的突變類型和頻率資料通常不能應(yīng)用于其他地區(qū)。

在本研究中，還發(fā)現(xiàn)katG315(AGC→ACC)聯(lián)合inhA-15(C→T)的突變類型，以及katG基因缺失和katG基因缺失聯(lián)合inhA-15(C→T)的突變類型。聯(lián)合突變報道較為常見，但katG基因缺失以及與inhA-15(C→T)聯(lián)合突變報道則并不多見，國內(nèi)吳雪瓊[13]、陳楊[15]等也曾有katG基因缺失的發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為此基因缺失也是導(dǎo)致MTB對INH產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制之一。

為了進(jìn)一步驗證基因芯片檢測INH對MTB耐藥性結(jié)果的敏感性和特異性，我們用與基因芯片檢測相同病人的同期送檢同類型標(biāo)本的培養(yǎng)陽性菌株做比例法藥物敏感性試驗，比較兩種方法的符合性，結(jié)果如表2所示，二者具有較高的符合率，這與我們前期的研究結(jié)果[16]基本一致。

INH耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，涉及多個基因的多個突變位點(diǎn)，并不時發(fā)現(xiàn)有新的耐藥基因與突變位點(diǎn)，基因芯片因受其載量的限制，不能包羅INH耐藥的所有基因突變類型，這是基因芯片技術(shù)的不足，但通過大樣本檢測了解本地區(qū)INH相關(guān)耐藥基因的主要突變特征，選用適合本地區(qū)的基因芯片，對INH耐藥性的快速檢測仍具有重要意義。

綜上所述，本地區(qū)INH耐藥以katG315(AGC→ACC)和inhA-15(C→T)突變類型為主，基因芯片對MTB INH耐藥性檢測與比例法比較，具有較高的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，可用于本地區(qū)MTB INH耐藥性的快速檢測。

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Determination of resistance genesKatGandinhAinMycobacteriumtuberculosisisolates from Guizhou Province by gene chip

OU Wei-zheng1,CHEN Zheng-hong2,CHEN Jing1,LUO Ke-wen1,WANG Yan1,QIN Wan1,MENG Jun1

(1.GuiyangPublicHealthTreatmentCenter,Guiyang550003,China;2.DepartmentofPathogenicBiology,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550025,China)

We aimed to investigate the characteristics ofKatGandinhAgene mutations ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) associated with INH in Guizhou Province, and to evaluate the clinical application value of gene chip in MTB resistance detection. Resistance to INH of 2 738 clinical samples were detected by gene chip method. These samples were determined as MTB positive by PCR-fluorescent probe method. Characteristics of mutations of INH resistance geneKatGandinhAwere then analysed. Meanwhile, MTB were isolated from these samples by Lowenstein-Jensen method and INH resistance were detected by ratio method. Susceptibility results determined by these two methods were compared. Of 465 samples in 2 738 MTB nucleic acid positive samples were resistant to INH determined by gene chip method, and the rate was 16.98%. Gene mutations were mainly found inkatG315(AGC→ACC)and the mutation frequency was 78.06%. TheinhA-15 (C→T) mutation was in the second place and thekatG315 (AGC→AAC) was in the third place, and the mutation frequency was 16.13% and 5.59%, respectively. A total of 1 493 MTB strains were isolated from the same samples of the above patients. Being determined by conventional ratio method, 255 MTB strains were detected as resistant to INH, with the rate of 17.08%. INH resistance was judged according to the conventional method, and the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), and accuracy of the gene chip method was 85.49%, 97.50%, 87.55%, 97.03% and 95.45%, respectively. In conclusion, gene mutations related with MTB resistance to INH were mainly happened at theKatG315 (AGC→ACC) and theinhA-15 (C→T) in Guizhou Province. Gene chip is a rapid test method with high sensitivity, specificity and accuracy, which could be used in the fast detection of the MTB drug resistance to INH.

gene chip; isoniazid; gene mutation; ratio drug sensitive test;Mycobacteriumtuberculosis

Chen Jing, Email:chenjingfk@sina.cn

陳靜，Email：chenjingfk@sina.cn

1.貴陽市公共衛(wèi)生救治中心，貴陽 550003； 2.貴陽醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，貴陽 550025

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.013

R378.91

A

1002-2694(2015)07-0655-04

2014-12-08；

2015-05-19

貴州省社會發(fā)展攻關(guān)項目(黔科合SY字[2013]3060號)；貴陽市社會發(fā)展與民生科技項目(筑科合同[2013103]14號)

Supported by the Brainstorm Project on Social Development in Guizhou Province (Guizhou Science Contract No.[2013]3060) & the Project on Social Development and Science and Technology for People’s Livelihood in Guiyang City (Guiyang Science Contract No.[2013103]14).