沈林海，孔慶鑫，孫建榮，徐 虹，金 慧，韋凌婭，查 捷，王英紅，倪曉平

香港海鷗形菌多重PCR及嵌合熒光PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

沈林海，孔慶鑫，孫建榮，徐 虹，金 慧，韋凌婭，查 捷，王英紅，倪曉平

目的 建立香港海鷗形菌(Laribacerhongkongensis, LH)的多重PCR(multi-PCR)及嵌合熒光法(SYBR Green I)PCR檢測(cè)方法，并對(duì)其在臨床及環(huán)境微生物方面的應(yīng)用前景進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 通過(guò)對(duì)62株香港海鷗形菌16S RNA 基因和16S-23S rRNA基因間隔區(qū)(16-23S rRNA intergenic spacer region, ISR)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和多序列比對(duì)，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，建立多重PCR體系，用15種細(xì)菌性腹瀉標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床菌株進(jìn)行PCR特異性和敏感性檢驗(yàn)；并在此基礎(chǔ)上針對(duì)兩對(duì)引物分別用嵌合熒光PCR法進(jìn)行濃度梯度檢測(cè)，以確定最低檢測(cè)限。結(jié)果 香港海鷗形菌多重PCR法特異性為100%，最低檢出限為5×103CFU/mL菌液；而嵌合熒光PCR法兩對(duì)引物的最低檢出限均達(dá)到5×102CFU/mL菌液。結(jié)論 該法的建立為臨床及環(huán)境微生物學(xué)提供了一種快速和靈敏的香港海鷗形菌檢測(cè)手段。

香港海鷗形菌；多重PCR；嵌合熒光PCR

香港海鷗形菌(Laribacerhongkongensis, LH)作為一種新的食源性腹瀉病原菌， 2001年首次分離自中國(guó)香港的1例酒精性肝硬化患者的血液和胸腔膿液中[1]。隨后在Woo PC等人開(kāi)展的一項(xiàng)多中心病例-對(duì)照研究中，LH在腹瀉病人及淡水魚(yú)中均被分離檢出，并被證實(shí)該菌與社區(qū)獲得性腹瀉和旅行性腹瀉有關(guān)[2-3]。Marcos和Dupont將香港海鷗形菌與產(chǎn)腸毒素脆弱類桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌同時(shí)列入2004-2007年間新發(fā)現(xiàn)的3種引起人類急性細(xì)菌性腹瀉的病原體[4]。2011年，韓國(guó)也在1例肝硬化病人的血液中首次分離到香港海鷗形菌[5]。

Lau等人對(duì)香港地區(qū)的自然水源進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)香港海鷗形菌能在淡水水源中生長(zhǎng)[6]，又在2007年對(duì)香港地區(qū)多種淡水生物開(kāi)展香港海鷗形菌帶菌調(diào)查，發(fā)現(xiàn)中國(guó)虎紋蛙也是LH的攜帶者[7]。我們于2005年始開(kāi)展腹瀉患者與淡水魚(yú)的LH分離工作，于2005年11月在中國(guó)內(nèi)地首次從一名社區(qū)獲得性腹瀉患者中分離到該菌[8]，并從3種淡水魚(yú)中分離到多株LH[9]。2006年，我們首次從涉禽小白鷺糞便樣品中分離到LH，并證實(shí)小白鷺為L(zhǎng)H的攜帶者，并可能造成LH在不同水源間的傳播[10]。

香港海鷗形菌的分離和培養(yǎng)相對(duì)困難，目前還沒(méi)有LH的商業(yè)化鑒定試劑，自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)也不能對(duì)其進(jìn)行鑒定，16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)被認(rèn)為是細(xì)菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，能對(duì)大多數(shù)細(xì)菌進(jìn)行快速和準(zhǔn)確的鑒定，因此也被應(yīng)用于香港海鷗形菌基因診斷[1,8]。然而，基于測(cè)序的細(xì)菌鑒定方法依賴昂貴的測(cè)序儀，并需要多個(gè)工作日，并不適用于香港海鷗形菌的常規(guī)診斷及其快速診斷，因此建立香港海鷗形菌快速、準(zhǔn)確的分子診斷方法已勢(shì)在必行。

1 材 料

1.1 菌株 62株香港海鷗形菌均由本實(shí)驗(yàn)室于2005-2007年間分離，其中10株分離自社區(qū)獲得性腹瀉患者糞便標(biāo)本，12株分離自小白鷺糞便標(biāo)本，40株分離自淡水魚(yú)中后腸段拭子。所有菌株均經(jīng)表型鑒定及16S RNA基因測(cè)序方法進(jìn)行確診[8]。

嗜水氣單胞菌(ATCC 7966)、空腸彎曲桿菌(ATCC 33560)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(ATCC 14028)、宋內(nèi)志氏志賀菌(ATCC 9290)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、脆弱擬桿菌(ATCC 25285)、白色念珠菌(ATCC 90028)、糞腸球菌(ATCC 29212)、克雷伯氏菌屬(ATCC 13883)、變形桿菌(ATCC 12453)及艱難梭菌、大腸桿菌、類志賀鄰單胞菌、痢疾志賀菌、福氏志賀菌等臨床分離株均由澳大利亞Westmead醫(yī)院感染性疾病與微生物研究中心提供。

1.2 主要儀器與試劑 普通PCR擴(kuò)增儀、電泳系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；7500型熒光定量PCR儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品；基因組DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；SYBR Green I 嵌合熒光PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；引物由澳大利亞基因組研究設(shè)備有限公司合成。

2 方 法

2.1 菌株DNA提取 從麥康凱培養(yǎng)基上調(diào)取香港海鷗形菌單個(gè)菌落到LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用接種環(huán)挑取3～5個(gè)菌落用于細(xì)菌基因組DNA提取。

2.2 香港海鷗形菌LH ISR序列PCR擴(kuò)增及測(cè)序 引物L(fēng)HISR1-F和LHISR1-R分別對(duì)應(yīng)細(xì)菌16S rRNA基因和23S基因保守區(qū)域[11]，用于擴(kuò)增香港海鷗形菌16S-23S rRNA基因間隔區(qū)全長(zhǎng)序列，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，含1×PCR緩沖液，1.5 mmol/L Mg2+，100 μmol/L dNTPs，500 nmol/L上下游引物，0.5 U熱啟動(dòng)酶，2 μL模板DNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 熱啟動(dòng)15 min， 94 ℃ 變性1 min， 60 ℃ 退火1 min， 72 ℃ 延伸2 min，循環(huán)35次，72 ℃ 10 min，4 ℃ 結(jié)束程序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖(含1∶20 000 GelRed染料)電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行分析，符合預(yù)期的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送測(cè)序作進(jìn)一步分析。

2.3 多序列比對(duì)分析和多重PCR引物設(shè)計(jì) 將182個(gè)16S rRNA基因序列(包含60個(gè)LH、102個(gè)Chromobacterium、14個(gè)Vogesella和 6個(gè)Microvirgula的16S rRNA基因序列)以及本實(shí)驗(yàn)測(cè)序所得的62個(gè)LH ISR基因序列作多序列比對(duì)分析(Clustal W 1994)，分析結(jié)果用于LH種特異性引物設(shè)計(jì)。利用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì)兩對(duì)引物L(fēng)H16S-F/LH16S-R和LHISR2-F/LHISR2-R，并用BLASTn搜索軟件進(jìn)行引物特異性分析，引物序列見(jiàn)表1。

2.4 定量DNA模板的制備和多重PCR檢測(cè)方法的建立 將香港海鷗形菌菌株LHHZ242含量由5×107CFU/mL 10倍梯度稀釋到5×10-1CFU/mL，不同濃度分別提取DNA模板進(jìn)行多重PCR檢測(cè)。多重PCR反應(yīng)總體積為25 μL，含1×PCR緩沖液，1.5 mmol/L Mg2+，100 μmol/L dNTPs，500 nmol/L各條引物，0.5 U熱啟動(dòng)酶，2 μL模板DNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃熱啟動(dòng)15 min， 94 ℃變性1 min， 60 ℃退火1 min， 72 ℃ 延伸2 min，循環(huán)35次，72 ℃ 10 min，4 ℃ 結(jié)束程序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖(含1∶20 000 GelRed染料)電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行分析。

2.5 嵌合熒光法的PCR反應(yīng)體系 參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)總體積為25 μL，含1×SYBR Premix EXTAQTMII，400 nmol/L上下游引物，1×ROX Reference Dye，4 μL模板DNA。熒光PCR反應(yīng)程序?yàn)镾tage 1：95 ℃ 預(yù)變性30 s；Stage 2：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，循環(huán)40次；Stage 3：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1min，95 ℃ 15 s。

表1 PCR引物序列

3 結(jié) 果

3.1 多序列比對(duì)分析結(jié)果 香港海鷗形菌16S rRNA基因高度保守，總長(zhǎng)為1 524 bp的序列僅有0～3個(gè)堿基差異，相似度大于99.8%，其多態(tài)性堿基位置為第424、425和430。香港海鷗形菌的16S-23S rRNA基因間隔區(qū)長(zhǎng)度為恒定471 bp，且高度保守，僅有0～5個(gè)堿基差異，相似度大于98.9%，其多態(tài)性堿基位置為第53、355、358、374和379。

3.2 多重PCR特異性檢測(cè)結(jié)果 利用多重PCR法對(duì)10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株和5個(gè)臨床分離菌株DNA進(jìn)行PCR特異性檢驗(yàn)。結(jié)果表明，62株香港海鷗形菌DNA菌擴(kuò)增出兩條目的條帶，229 bp和95 bp，其他DNA樣品未見(jiàn)特異性擴(kuò)增條帶(圖1)。

M: DNA marker; 1: LHHZ242 positive control; 2: Blank control; 3-17: DNA of reference strains.

圖1 香港海鷗形菌多重PCR特異性檢測(cè)電泳圖

Fig.1 Multi-PCR electrophoresis for specific detection of LH

3.3 多重PCR敏感度檢測(cè)結(jié)果 多重PCR法對(duì)稀釋度為5×107CFU/mL至5×10-1CFU/mL的香港海鷗形菌菌液DNA模板進(jìn)行敏感度檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩對(duì)引物均在第5泳道出現(xiàn)最弱條帶，檢測(cè)的敏感度為5×103CFU/mL(圖2)。

M: DNA marker; 1-9: Various bacterial suspension of LHHZ242 from 5×107CFU/mL to 5×10-1CFU/mL; 10: Blank control.

圖2 香港海鷗形菌多重PCR敏感度檢測(cè)電泳圖

Fig.2 Sensitiveness of multi-PCR for detection of LH

3.4 嵌合熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果 用嵌合熒光PCR法對(duì)稀釋度為5×107CFU/mL至5×10-1CFU/mL的香港海鷗形菌菌液DNA模板進(jìn)行濃度梯度檢測(cè)，結(jié)果顯示：引物L(fēng)H16S-F/LH16S-R和LHISR2-F/LHISR2-R均可檢測(cè)到6個(gè)濃度的信號(hào)，其最低檢測(cè)限均為5×102CFU/mL菌液(圖3)。

4 討 論

細(xì)菌16S rRNA基因相對(duì)保守，但又存在著9或10個(gè)變異區(qū)，不同屬和種間都有不同程度的差異。16S-23S rRNA基因間隔區(qū)(16-23S rRNA intergenic spacer region, ISR)的進(jìn)化速度是16S rRNA基因的10倍[12]，并且其兩端的序列高度保守，使得它可以用于親緣性異常接近菌種的鑒別，也能用于細(xì)菌的分型[11]。自香港海鷗形菌被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，還未見(jiàn)香港海鷗形菌16S rRNA基因序列或16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列的同源性分析報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，香港海鷗形菌16S rRNA基因序列高度保守，且與其他親緣菌株序列有較大差異；其16S-23S rRNA基因間隔區(qū)長(zhǎng)度恒定并高度保守，并在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)相識(shí)性序列。因此，香港海鷗形菌16S rRNA和ISR區(qū)域均可作為種特異性PCR引物設(shè)計(jì)區(qū)。Yuen KY等用系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的方法發(fā)現(xiàn)Chromobacterium，Microvirgula和Vogesella等菌屬與LH的親緣關(guān)系最近[1]，而有趣的是這些細(xì)菌都能從水環(huán)境中檢出。通過(guò)對(duì)這些細(xì)菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，我們?cè)O(shè)計(jì)的LH種特異性引物能夠特異性擴(kuò)增LH基因，而不會(huì)擴(kuò)增這些親緣關(guān)系最近的細(xì)菌基因。這就使我們能快速鑒定環(huán)境樣品中的LH，為研究環(huán)境中LH的來(lái)源和分布提供了條件，也為研究和尋找LH新種或亞型提供了可能。其次，我們用臨床常見(jiàn)腸道致病菌檢測(cè)引物的特異性，發(fā)現(xiàn)引物并不能擴(kuò)增這些菌株的16S rRNA基因或ISR基因，并且均未發(fā)現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶。所以本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的種特異性引物能用于臨床細(xì)菌樣品的LH PCR鑒定，而兩對(duì)引物構(gòu)成的多重PCR體系更能提高檢出的特異性，而并不影響PCR反應(yīng)的靈敏度。

Amplification curve of primers LH16S-F/LH16S-R; Fig below: Amplification curve of primers LHISR2-F/LHISR2-R; Concentration gradient: Various bacterial suspension of LHHZ242 from 5×107CFU/mL to 5×10-1CFU/mL.

圖3 香港海鷗形菌嵌合熒光PCR法敏感度檢測(cè)結(jié)果

Fig.3 Sensitiveness of SYBR Green I real-time RAM for detection of LH

香港海鷗形菌在SS、XLD、CCDA、TCBS等培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)或者生長(zhǎng)不良，雖然Lau SK等人發(fā)現(xiàn)改良頭孢哌酮麥康凱(CMA)可以作為分離LH的合適培養(yǎng)基，但其在CMA上生長(zhǎng)緩慢，37 ℃下培養(yǎng)48 h后菌落大小約為0.5～1 mm，且菌落形態(tài)特征不明顯、為無(wú)色透明扁平狀，且難以在混雜的眾多菌落中區(qū)分和挑取[9,13]?？梢删涮羧『?，還需要細(xì)菌分純、表型和生化鑒定等步驟。因此，用傳統(tǒng)微生物鑒定法分離LH很大程度上依賴于檢驗(yàn)者長(zhǎng)期積累的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且容易漏檢和誤檢。而種特異性多重PCR方法能在培養(yǎng)24 h后即能對(duì)難挑菌落和可疑菌落進(jìn)行鑒定，雖不能完全取代傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法，但更為迅速和靈敏。

嵌合熒光PCR法為一種簡(jiǎn)單的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，所用染料 SYBR Green I 能結(jié)合于雙鏈DNA微槽而增加熒光強(qiáng)度，從而具有高靈敏度，而引物特異性決定了嵌合熒光PCR的特異性[14]。本研究采用嵌合熒光PCR法分別檢測(cè)香港海鷗形菌16S rRNA基因和ISR基因，結(jié)果顯示其熒光強(qiáng)度與模板濃度成正比，最低檢測(cè)限均達(dá)到5×102CFU/mL菌液，為普通PCR靈敏度的10倍。而且嵌合熒光PCR免去了瓊脂糖凝膠電泳的步驟，明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間。因此，嵌合熒光PCR法擁有高特異性、高靈敏度及快速檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，更適用于香港海鷗形菌爆發(fā)流行的快速診斷，或者大批量及低濃度樣品的檢測(cè)。

(澳大利亞Westmead醫(yī)院感染性疾病與微生物研究中心對(duì)本研究提供了資助及實(shí)驗(yàn)所用菌株，孔繁榮博士在研究實(shí)施及論文寫(xiě)作期間給予了精心的協(xié)助和指導(dǎo)，在此一并感謝！)

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Development and application of multi-PCR and SYBR Green I real-time ramification amplification method for detection ofLaribacerhongkongensis

SHEN Lin-hai,KONG Qin-xin,SUN Jian-rong,XU Hong,JIN Hui,WEI Ling-ya,ZHA Jie,WANG Ying-hong,NI Xiao-ping

(HangzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Hangzhou310006,China)

We aimed to establish multi-PCR and SYBR Green I real-time ramification amplification method (RAM) for detection ofLaribacerhongkongensis, and evaluate the applications of two methods in both clinical and environmental microbiology. Full-length of the 16S rRNA gene and 16S-23S rRNA intergenic spacer region (ISR) sequences of 62L.hongkongensisisolates were obtained by PCR based sequencing. Two species-specific primer pairs targeting 16S rRNA gene and ISR were designed for multi-PCR and SYBR Green I real-time RAM for detection ofL.hongkongensis, and the specificity and sensitivity of two methods were evaluated by 15 strains associated with bacterial diarrhea. Results showed that LH species-specific multi-PCR assay had high specificity (100%) and the minimum detectable level was 5×103CFU/mL; the minimum detectable levels of two primer pair were both 5×102CFU/mL by SYBR Green I real-time RAM. The multi-PCR method and SYBR Green I real-time RAM provide rapid and reliable alternative to conventional methods to identifyL.hongkongensis, and may have applications in both clinical and environmental microbiology.

Laribacterhongkongensis; multi-PCR method; SYBR Green I real-time RAM

Ni Xiao-ping, Email: hznixp@163.com

倪曉平，Email: hznixp@163.com

杭州市疾病預(yù)防控制中心，杭州 310021

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.014

R446.5

A

1002-2694(2015)07-0659-04

2014-07-18；

2015-01-28

浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2011R50021)；杭州市科技計(jì)劃引導(dǎo)項(xiàng)目(2014-2)

Funded by the Program for Zhejiang Leading Team of Science Technology Innovation and the Science and Technology Guiding Projects of Hangzhou city (No. 2014-2)