程 成，鞠文東，付維明，曹蘇婭，徐 寧，王艷梅，耿 聰，王玉龍

黑龍江口岸地區(qū)鼠類動物中漢坦病毒感染情況調(diào)查

程 成1，鞠文東1，付維明1，曹蘇婭2，徐 寧1，王艷梅1，耿 聰1，王玉龍2

目的 了解黑龍江省中俄邊境11個口岸鼠類宿主動物攜帶漢坦病毒(Hantavirus,HV)狀況及其分子流行病學(xué)特征。方法 采用夾夜法和鼠籠法捕獲鼠類，應(yīng)用巢式PCR方法對鼠肺樣本進(jìn)行檢測，對陽性樣本測序并分型，獲得序列用MEGA6進(jìn)行分析。結(jié)果 此次調(diào)查共捕獲鼠類動物346只，經(jīng)鑒定隸屬3科9屬11種。檢測出漢坦病毒核酸陽性樣本17份，平均帶毒率為4.90 %，包括漢灘型病毒(Hantaan virus, HNTV)6例，漢城型病毒(Seoul virus, SEOV) 11例，首次在黑龍江口岸東方田鼠中檢測到1例SEO型HV。進(jìn)化分析表明，6株HNT型HV均與HNT型HV原型株76-118親緣性較遠(yuǎn)(86.82%～88.43%)，分別與HNT型HV株BAO14、HXZ244同源性最高；11株SEO型HV分別與SEO型HV株Gongzhuling97、北京株BjHD01、越南株HaiPhong3-11同源性最高。結(jié)論 黑龍江中俄邊境口岸宿主動物感染漢坦病毒至少2個類型，相對較高的感染率提示著中俄邊境地區(qū)開展腎綜合征出血熱監(jiān)測和防控的迫切性。

漢坦病毒；鼠類動物；巢式PCR；基因測序及分型；系統(tǒng)進(jìn)化分析；分子流行病學(xué)

Supported by the General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China (AQSIQ) scientific research subject (Grant no. 2014IK047), the Heilongjiang Import and Export Inspection and Quarantine Bureau Autonomous Scientific Research Subject (Grant no. 2013HK006), and the Special Fund of the Central Universities Fundamental Research (Grant no. DL13CA04) Corresponding author: Wang Yu-long, Email: wangyl@nefu.edu.com

漢坦病毒(Hantavirus, HV) 屬布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬(hantavirus)，在臨床上可引起腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和漢坦病毒肺呼吸綜合征(Hantavirus pulmonary syndrome，HPS)，主要由鼠類等嚙齒類動物傳播的一種動物疫源性病原體[1]。HFRS雖為世界性分布，但中國卻是受HV危害最為嚴(yán)重的國家，每年都會超過10萬個HFRS病例[2]，是世界上HFRS發(fā)病人數(shù)最多的國家。

HV 種類繁多，世界上至少有23個已經(jīng)確定的種類和30多個暫定種類[3]，中國除漢灘病毒(Hantaan virus，HNTV)和漢城病毒(Seoul virus，SEO)以外，在宿主動物中還發(fā)現(xiàn)了普馬拉病毒(Puumala virus，PUUV)、圖拉病毒(Tula virus，TULV)和Amur病毒等病毒型[4-7]。王彩橋等人還在黑瞎子島媒介監(jiān)測中捕獲的嚙齒動物里，發(fā)現(xiàn)了哈巴羅夫斯基病毒(Khabarovsk virus，KBRV)和kenkeme病毒(KKMV)[8]，目前，在中國已有11種HV被識別[3]。黑龍江省是中國HFRS的老疫區(qū)和重疫區(qū)，主要以HTN型和SEO型為流行型，其中以HTN型為主[7，9]。近幾年盡管黑龍江省疫情呈下降趨勢，但發(fā)病率仍然名列全國前列[9]。自上世紀(jì)30年代初，中國首次在黑龍江下游、中俄邊境地區(qū)發(fā)現(xiàn)HFRS，尤其是近年，已證實(shí)俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)的HV 自然疫源地中循環(huán)的HV 血清型和基因型存在明顯的多樣性[10]，因此黑龍江中俄邊境口岸作為重點(diǎn)監(jiān)測的地區(qū)之一，倍受檢驗(yàn)檢疫部門的重視，鑒于此，為了加強(qiáng)中俄邊境地區(qū)宿主動物中HV感染情況的監(jiān)測，本研究在黑龍江省中俄邊境11個口岸采集鼠類宿主動物，開展HV分子流行病學(xué)調(diào)查研究，為進(jìn)一步研究中俄邊境口岸HV流行病學(xué)情況及預(yù)防控制措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鼠標(biāo)本的采集 2014年3-8月間，在黑龍江省中俄邊境同江、哈爾濱機(jī)場、密山、綏芬河、佳木斯、嘉蔭、東寧、富錦、虎林、蘿北、牡丹江11個口岸以夾夜法(晚放晨收)和鼠籠法捕獲鼠類。將現(xiàn)場捕獲的鼠類依據(jù)其外部形態(tài)特征進(jìn)行鑒定、分類，并登記編號，記錄捕捉日期、生境及其生物學(xué)特征，裝入已編號鼠袋帶回，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)室處理

1.2.1 鼠肺樣本的采集及研磨 采集鼠肺標(biāo)本于2 mL無菌離心管中，編號標(biāo)記后，置于冰上，向離心管內(nèi)加入無菌不銹鋼珠和400 μL 無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，用組織研磨器研磨0.5～1 min(時(shí)間不宜過長)，使組織勻漿。將勻漿液4 ℃，8 000 g離心1 min，將上清分裝至1.5 mL離心管中用于核酸提取。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物 根據(jù)漢坦病毒M片段設(shè)計(jì)兩套巢式PCR引物，內(nèi)套引物分別對漢灘(HTN)型和漢城(SEO)型病毒具有特異性(表1)，可分別獲得383 bp、418 bp大小的片段。引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表1 研究中所用引物

1.3.2 RNA提取及cDNA合成 從鼠肺研磨液中提取總RNA，使用Trizol RNA提取試劑(Invitrogen)按操作說明立即提取總RNA。以病毒RNA為模板，利用PrimeScript RT Reagent kit(TaKaRa) 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，方法參照反轉(zhuǎn)錄酶說明書。合成的cDNA 即可用于PCR 反應(yīng)。

1.3.3 PCR PCR反應(yīng)采用套式PCR，即先用HTmlF和HTmlR引物擴(kuò)增，然后再用HTN型特異性引物HTm2F/HTm2R和SEO型特異性引物STm2F/ STm2R擴(kuò)增。PCR條件均是95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.4 PCR 產(chǎn)物的序列測定 陽性PCR 產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司直接測序，獲得序列與GenBank 中的序列進(jìn)行序列比對。用Mega6軟件中的Algnment進(jìn)行漢坦病毒M基因片斷的同源性(distance)和進(jìn)化樹分析(phylogeny)。本研究采用的參考毒株序列均取自GenBank。

2 結(jié) 果

2.1 宿主動物調(diào)查結(jié)果 本次調(diào)查共捕獲鼠類動物346只，經(jīng)鑒定隸屬于3科9屬11種，捕獲的鼠類動物中黑線姬鼠(Apodemusagrarius)190只，占捕鼠總數(shù)的54.9%，為優(yōu)勢種群，其次為褐家鼠(Rattusnorvegicus)26.0%和大倉鼠(Cricetulustriton)3.4%(表2)。

2.2 HV檢測結(jié)果 在346份鼠肺組織樣本中共檢出HV核酸陽性標(biāo)本17份，總帶毒率為4.9%。其中HNT型核酸陽性樣本6份，帶毒率為1.7%(6/346)，SEO型核酸陽性樣本11份，帶毒率為3.2%(11/346)。不同鼠種之間，東方田鼠、褐家鼠、黑線姬鼠的，帶毒率分別為16.7%、12.2%和2.6%。但從類型分布分析，黑線姬鼠中HNT型與SEO型的比例為4∶1；而褐家鼠為2∶9，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.95,P=0.0001)，這說明了黑線姬鼠為HNT型病毒的主要宿主，而褐家鼠為SEO型病毒的主要宿主，表明了漢坦病毒的不同類型對宿主具有一定的選擇性[12]。(表2)。分析11個口岸帶毒率情況，其中富錦帶毒率最高為50%(2/4)，其次是東寧和佳木斯，帶毒率分別是14.3%(1/7)，13.3%(4/30)。其中富錦、東寧、佳木斯、哈爾濱機(jī)場以SEO型病毒為主要流行型，同江、虎林以HNT型病毒為主要流行型。

2.3 序列測定結(jié)果 通過序列測定，獲得了17例漢坦病毒部分的M片段序列，經(jīng)Blast比對后，確定6例HNT型HV，11例SEO型HV(表3)。

2.3.1 HNT型 結(jié)果顯示，編號TJ2014-1、TJ2014-2、TJ2014-3、TJ2014-14序列相近，與HNT型HV株BAO14同源性最高(96.80 %～97.12 %)；編號HL2014-11、MDJ2014-6序列相近，與HNT型HV株HXZ244和HXZ245同源性最高(95.47%～95.78%)；該6株HNT型HV均與HNT型HV原型株76-118親緣性較遠(yuǎn)，同源性在86.82 %至88.43 %之間。TJ2014-1、TJ2014-2、TJ2014-3、TJ2014-14與HNT型HV株BAO14、Jiang13、AA2499共同位于一個大支系(圖1中分支1# )，HL2014-11、MDJ2014-6與HNT型HV株HXZ244和HXZ245位于一個支系(圖1中分支2#)。

2.3.2 SEO型 結(jié)果顯示，編號JC2014-12、JC2014-20、MDJ2014-24、JMS2014-16、JMS2014-19、JMS2014-21、JMS2014-30、TJ2014-11序列相近，其中TJ2014-11與SEO型HV株Gongzhuling97同源性最高(98.86 %)，其余與北京株BjHD01同源性最高(98.86 %～99.25 %)，并且共同位于一個支系(圖2中分支1#)；FJ2014-1、FJ2014-2序列相近，與SEO型HV株JiyuanRn60同源性最高分別是99.15 %、98.86 %，并且與HuaxianRn223等SEO型HV株共同位于一個支系(圖2中分支2#)；DN2014-2與越南株HaiPhong3-11、HaiPhong24-11、HaiPhong31-11同源性最高(97.77%～98.28%)，并且共同位于一個支系(圖2中分支3# )。

表2 不同鼠種HV檢測結(jié)果

3 討 論

本次調(diào)查共捕獲鼠類動物346只，隸屬于3科9屬11種，其中中黑線姬鼠和褐家鼠為優(yōu)勢種群，但是在HV帶毒率卻發(fā)現(xiàn)褐家鼠為12.2 %(11/90)，黑線姬鼠僅為2.6 %(5/190)，兩者帶毒比例相

Bao14 (AB127995.1), Jiang13(AB027067), AA2499(AF427327), HXZ244(KF477195.1), HXZ245(KF477196.1), 76-118(Y00386.1).

圖1 基于M片段部分核苷酸序列所構(gòu)建的HNT型系統(tǒng)發(fā)生樹

Fig.1 Phylogenetic trees of HNTV based on partial M segments

差明顯(4.7∶1)；不僅如此，還在同江及牡丹江口岸的褐家鼠中檢測到兩例HNT型HV；在哈爾濱機(jī)場和牡丹江口岸的黑線姬鼠及東方田鼠中檢測到兩例SEO型HV，這提示HV的定型不能僅僅依賴以往的流行病學(xué)，臨床特征經(jīng)驗(yàn)[11]。

值得注意的是，我們在牡丹江口岸的東方田鼠樣本中檢測到1例SEO型HV。目前為止，由于漢坦病毒的宿主選擇性[12]，在黑龍江省宿主動物中僅從黑線姬鼠、褐家鼠中檢測到HV[7，13]。盡管陳露菲等人近期曾在黑龍江大林姬鼠中檢測到Amur型HV[7]，但有關(guān)黑龍江東方田鼠中SEO型HV的報(bào)道尚屬首次，提示了漢坦病毒經(jīng)過不斷進(jìn)化，有可能突破了宿主屏障，引起了HV在其他動物物種之間的流行和傳播[14]。

Gongzhuling97 (KF745936.1), BjHD01 (DQ133505.1), Gongzhuling42 (KF745932.1), Gongzhuling108 (KF745937.1), Gongzhuling415 (KF745939.1), HLD65 (EF205377.1), HLD78 (EF205378.1), RuianRn180 (GU592931.1), HuaxianRn223 (FJ884509.1), HuaxianRn202 (FJ884508.1), JiyuanRn60 (FJ884515.1), HuaxianRn40 (GU592924.1), XiaotangshanRn7 (GU592929.1), HaiPhong3-11 (AB674759.1), HaiPhong24-11(AB674761.1), HaiPhong31-11(AB674762.1).

圖2 基于M片段部分核苷酸序列所構(gòu)建的SEO型系統(tǒng)發(fā)生樹

Fig.2 Phylogenetic trees of SEOV based on partial M segments

表3 序列編號列表

從各個口岸的HV帶毒率分析，富錦帶毒率最高，東寧和佳木斯次之、同江、虎林、牡丹江、哈爾濱機(jī)場較低，其余口岸未檢出，這可能與采樣數(shù)量和生境選擇有關(guān)，例如富錦采集數(shù)量僅為4只，采集樣本為生活區(qū)的褐家鼠，這可能是其帶毒率較高的原因。但是從總體帶毒率角度分析，此次調(diào)查共檢出HV核酸陽性率為4.9 %，與之姚昆[10]等人在2005-2006年調(diào)查鼠攜帶HV 總陽性率為6.25%，侯詠[15]等人在2010年調(diào)查鼠攜帶HV總陽性率為7.46%相比，均有明顯下降，這說明了近幾年黑龍江檢驗(yàn)檢疫部門在加強(qiáng)黑龍江中俄口岸HV疫情的監(jiān)測和防控等方面取得了一定的成績。

本研究利用巢式PCR，通過特異性HV分型引物對17例HV直接分型，并通過測序比對進(jìn)一步確定其型別，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。6株HNT型HV均與HNT型HV原型株76-118親緣性較遠(yuǎn)，同源性在86.82%至88.43%之間，說明產(chǎn)生了很大的變異；11例SEO型HV，其與北京株BjHD01同源性達(dá)99.15%，并且共同位于一個支系(圖2中分支1#)，說明了HNT型和SEO型變化的速度可能不完全一致；值得關(guān)注的是分離自東寧的DN2014-2，其與越南株HaiPhong3-11、HaiPhong24-11、HaiPhong31-11共處于一個支系(圖2中分支3# )，且同源性最高可達(dá)98.28 %，表明，該株HV可能為SEO型的不同亞型。同江、佳木斯和富錦分離的HV有較大的同源性，在地理位置上這3個地區(qū)毗鄰，說明了HV的空間分布具有一定的地理簇集性[13]。

黑龍江省腎綜合征出血熱疫情在90年代末時(shí)處于高峰期[16-17]，僅1995年發(fā)病率為28.41/10萬，在疾病預(yù)防控制部門和檢驗(yàn)檢疫部門的共同努力下，近年來黑龍江省腎綜合征出血熱疫情呈下降趨勢，據(jù)2013年統(tǒng)計(jì)，黑龍江省2008-2013年出血熱發(fā)病率平均值為4.37/10萬[18]，但相對其他省份而言，形勢依然嚴(yán)峻，發(fā)病率仍然較高，又因與HV自然疫源地的俄羅斯毗鄰，因此，黑龍江中俄口岸腎綜合征出血熱的危害一直受到廣泛關(guān)注。分子流行病學(xué)的快速發(fā)展也給腎綜合征出血熱的監(jiān)測和檢測提供了新的技術(shù)和方法，因此，進(jìn)一步加強(qiáng)黑龍江中俄邊境口岸地區(qū)宿主動物感染漢坦病毒分子流行病學(xué)調(diào)查的研究，及時(shí)掌握腎綜合征出血熱的感染強(qiáng)度和疫源地活躍度，將為該病的長期監(jiān)測和防控，提供必要的理論基礎(chǔ)和決策依據(jù)。

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Epidemiologic investigation on Hantavirus carried by rodents at Heilongjiang frontier ports

CHENG Cheng1,JU Wen-dong1,FU Wei-ming1,CAO Su-ya2,XU Ning1,WANG Yan-mei1,GENG Cong1,WANG Yu-long2

(HeilongjiangInternationalTravelHealthcareCenter,Harbin150001,China)

We investigated the rodent carrying the Hantaan virus (HV) and the characteristics of molecular epidemiology at Heilongjiang frontier ports at Sino-Russia border. The night trapping and mouse cages were used to capture rodents, rodent lung samples were detected by nested PCR method, positive samples were sequenced and genotyped, and obtained sequences were then analyzed by MEGA6. In this survey, we captured 346 rodents, identified to be 3 families, 9 genera and 11 species. A total of 17 samples carried Hantavirus were with the infection rate of 4.9%. In which, 6 samples belonged to HNTV and 11 samples to SEOV, which was the first case of SEOV detected fromMicrotusfortisin Heilongjiang Port, China. Phylogenetic analysis showed that 6 strains of Hantavirus were not closely related to the prototype strain Hantaan76-118 (homology was 86.82%-88.43%), but showed high homology with HNT BAO14 and HNT HXZ244 strains. The 11 strains of Seoul virus showed high homology with SEO Gongzhuling97, SEO BjHD01, and SEO HaiPhong3-11 (isolated from Vietnam) strains respectively. Based on the above results, we can analyse that at least two types of Hantavirus infected by rodent at Heilongjiang Sino-Russian border, and a relatively high infection rate suggested the importance of increasing monitoring and control HFRS at Sino-Russian border areas.

Hantavirus; rodents; nested PCR; gene sequencing and genotyping; phylogenetic analysis; molecular epidemiology

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科研基金(2014IK047)；黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局科研基金(2013HK006)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(DL13CA04)

王玉龍， Email：wangyl@nefu.edu.com

1.黑龍江國際旅行衛(wèi)生保健中心，哈爾濱 150001； 2.東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.019

R373. 9

B

1002-2694(2015)07-0681-06

2014-10-20；

2015-05-06