／劉行摘譯 廖華審校

／1 武漢大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（武漢430060）

·國際之窗·

一種新型的大鼠急性耳鳴模型的行為學評估方法
——優(yōu)化同步記錄神經(jīng)振蕩活動

／劉行1摘譯 廖華1審校

／1 武漢大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（武漢430060）

電生理學認為耳鳴產(chǎn)生于聽皮層的神經(jīng)振蕩自發(fā)性電活動，但既往行為學結(jié)合電生理學的動物模型還不能檢測這一假說；研究表明對注意力的控制可能在耳鳴的感知中發(fā)揮了作用，但是對覺醒動物耳鳴的電生理學記錄卻很被動。耳鳴模型的評估方式主要有以下三種：Jastreboff、Guitton等采用的避免電擊試驗、Rüttiger等將聲刺激與獎勵建立條件反射以及Turner等使用的gap-PPI即間隔-驚跳反射前抑制試驗檢測動物是否感知耳鳴。但是這些方法都有一定的局限性，為了記錄局部場電位（local field potential，LFP），神經(jīng)活動需要持續(xù)數(shù)秒而動物行為控制需要相對長的時間，大多數(shù)評估方式采用不連續(xù)的刺激而影響結(jié)果，并且聲刺激會干擾神經(jīng)活動從而對耳鳴相關(guān)的神經(jīng)自發(fā)性放電活動造成影響。為了克服這些問題，本實驗采用二選一識別任務（a two-alternative choice identification task）來評估耳鳴動物模型，也就是通過選擇性實驗來對動物模型進行耳鳴行為學評估，這是記錄耳鳴動物模型神經(jīng)電生理活動的最佳檢測方法。

耳鳴動物模型行為學評估方法：在隔聲屏蔽室內(nèi)，將大鼠置于一個透明的玻璃盒，玻璃盒中間有個中心區(qū)，中心區(qū)左側(cè)和右側(cè)分別有一個喂養(yǎng)槽，白色燈泡置于中心區(qū)上方，隔聲屏蔽室頂端置一揚聲器，通過置于大鼠頭頂處的麥克風校準聲音。大鼠的攝食量是自由喂養(yǎng)的攝食量的85%～90%，揚聲器給聲條件有三種，第一種播放穩(wěn)定的窄帶噪聲（a steady-state narrowband noise，NBN），為1／8倍頻程，中心頻率隨機選取4、8、16、22.6、32 k Hz之一，強度60 dB SPL；第二種播放正弦調(diào)幅寬帶噪聲（an amplitude-modulated noise，AM），100%調(diào)制度，中心頻率為5 Hz，強度60 d B SPL；第三種為關(guān)閉揚聲器，不給任何噪聲刺激，為安靜條件。本實驗通過應答正確給予食物以強化大鼠所感知的聲音，由于大鼠訓練時可獲得一定的食物，因此大鼠的體重增長可能和正常喂養(yǎng)一樣，每只大鼠每天訓練1小時，每小時至少進行100次試驗，一周訓練6天，訓練成功一般需要3月。

開始訓練時于隔聲屏蔽室內(nèi)給予持續(xù)穩(wěn)定的上述聲條件之一，大鼠隨機將鼻子置于中區(qū)心（圖1）超過4秒（等待時間）時，立刻開啟位于大鼠頭部上方的的白色燈光（表示＂可行暗示＂）。大鼠對給予的聲條件作出正確的應答便獲得食物；如果應答錯誤，則關(guān)閉燈光并予以20秒的超時懲罰，也就是大鼠獲得食物后或者20秒之后再進行下一次訓練；如果大鼠不進行應答則不進行下一次訓練，下次訓練時重新隨機選取一種給聲條件。大鼠于AM

噪聲或安靜給聲條件將頭轉(zhuǎn)向右側(cè)喂養(yǎng)槽或者于NBN噪聲條件將頭轉(zhuǎn)向左側(cè)為應答正確，則給予45 mg食物于喂養(yǎng)槽內(nèi)；否則為應答錯誤。當大鼠連續(xù)5次命中正確時，可增加250毫秒的等待時間。為了減少猜測或者習慣行為采用隨機給聲條件：50%給予NBN噪聲并隨機予以不同的頻率以利于大鼠對耳鳴的感知，30%給予AM噪聲，20%為安靜條件。當大鼠至少連續(xù)2天的命中率超過80%時，食物強化訓練由100%給予逐漸變?yōu)?0%給予，以減小大鼠的學習能力造成的影響。直到訓練大鼠在每次給聲條件下的命中率超過80%即為標準基線，一旦大鼠至少連續(xù)四天都達到標準基線便開始腹腔注射水楊酸鈉或者生理鹽水，每次注射前2小時訓練。

每周可進行一次耳鳴檢測，在檢測耳鳴時，應答條件改為安靜狀態(tài)時既不給予大鼠食物也不給予處罰，并且需要分別給于三種聲條件，大鼠感知耳鳴的表現(xiàn)為在安靜條件下將頭部轉(zhuǎn)向NBN噪聲側(cè)即左側(cè)喂養(yǎng)槽。如果非水楊酸鈉注射組實驗動物在安靜條件下轉(zhuǎn)頭，可認為該組大鼠可能是對食物強化作用較為敏感，而非感知耳鳴；如果水楊酸鈉注射組實驗動物安靜條件時持續(xù)準確將頭轉(zhuǎn)向NBN噪聲側(cè)，則為感知耳鳴（圖1）。如果大鼠感知耳鳴，則其對安靜聲條件的命中率與其前四天比較會大幅度下滑；將正常對照組與水楊酸鈉組對每種給聲條件進行統(tǒng)計學分析，P＜0.01為有統(tǒng)計學差異。

研究表明高劑量水楊酸鈉能導致大鼠產(chǎn)生暫時的耳鳴樣行為，從而得到急性耳鳴大鼠模型，本實驗分為水楊酸鈉組和生理鹽水組，每組7只大鼠，檢測前2小時注射。水楊酸鈉組每只大鼠予以200 mg／kg水楊酸鈉（50 mg／ml）腹腔注射；生理鹽水組予以等量生理鹽水腹腔注射。通過上述耳鳴模型評估方法對大鼠進行耳鳴行為學評估后，分別記錄分析生理鹽水組與水楊酸鈉組大鼠聽皮層LFP變化。

本研究發(fā)現(xiàn)生理鹽水組7只大鼠均能在安靜狀態(tài)正確應答，并能正確辨別NBN和AM噪聲側(cè)別；水楊酸鈉組大鼠有6只在安靜給聲條件時持續(xù)將頭轉(zhuǎn)向NBN噪聲側(cè)，并能準確辨別NBN和AM噪聲側(cè)別。統(tǒng)計學結(jié)果表明生理鹽水組和水楊酸鈉組大鼠在安靜狀態(tài)（N＝6）的命中率有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）；NBN以及AM噪聲給聲條件下（N＝6）兩組大鼠命中率無統(tǒng)計學差異（P＝0.082 1和P＝0.552 1），說明生理鹽水組大鼠并未感知到耳鳴，而水楊酸鈉組有6只大鼠感知到耳鳴，并且大鼠對耳鳴的感知更接近于NBN噪聲。在完成耳鳴大鼠模型行為學評估后，通過記錄大鼠聽皮層LFP以及頻譜分析發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組比較，水楊酸鈉組的θ頻帶、α頻帶以及γ高頻帶功率減少，而γ低頻帶功率增加，分析NBN噪聲和安靜給聲條件下的功率譜也得到了同樣的結(jié)果，但AM噪聲條件下γ低頻帶功率譜的增加中角度小于另外兩種給聲條件。該結(jié)果說明神經(jīng)振蕩活動在耳鳴的發(fā)生機制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

本實驗的耳鳴動物模型評估方法高效地檢測了大鼠是否感知耳鳴，雖然大鼠處于覺醒狀態(tài)，但是該方法提供了“可行暗示”之前的一段較長時間（圖2），通過在大鼠聽皮層植入電極，能實時、在體并穩(wěn)定持續(xù)地記錄分析LFP，同時排除聲刺激對結(jié)果造成的影響，使得行為學和電生理學能完美結(jié)合，更好地揭示大鼠聽皮層神經(jīng)活動的改變，從而促進耳鳴的神經(jīng)機制的研究。

圖1

圖2 在“可行暗示”前的等待時間為電生理記錄時間

（摘譯自Stolzberg D，et al.A novel behavioral assay for the assessment of acute tinnitus in rats optimized for simultaneous recording of oscillatory neural activity［J］.Journal of Neuroscience Methods，2013，219：224～232.）

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.04.031