陳巖賴垂金△李雯李華偉

·實驗研究·

不同基因轉(zhuǎn)染方法對小鼠內(nèi)耳毛細胞轉(zhuǎn)染效率的比較*

陳巖1賴垂金1△李雯1李華偉1

目的 對比不同的基因轉(zhuǎn)染方法對小鼠內(nèi)耳毛細胞的轉(zhuǎn)染效率，以探尋簡便、高效轉(zhuǎn)染耳蝸毛細胞的方法。方法 分離111只新生昆明小鼠（P2）耳蝸螺旋韌帶及感染上皮，分別采用電穿孔法介導質(zhì)粒載體（pGPHI／GFP／Neo）、腺病毒載體（Ad5／CMV／GFP）和慢病毒載體（LV／CMV／GFP）3種方法轉(zhuǎn)染小鼠內(nèi)耳毛細胞，于轉(zhuǎn)染48小時后在熒光顯微鏡下觀察并比較三種方法基因轉(zhuǎn)染后小鼠內(nèi)耳毛細胞綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的表達。結(jié)果 電穿孔法介導質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染組和慢病毒載體轉(zhuǎn)染組GFP陽性細胞極少；腺病毒載體轉(zhuǎn)染組效率最高，耳蝸中回外毛細胞GFP陽性率為90.0%±4.1%，內(nèi)毛細胞GFP陽性率為5%±0.4%。結(jié)論腺病毒載體能更有效地將外源基因?qū)攵伱毎麅?nèi)表達，是基因轉(zhuǎn)染耳蝸毛細胞的理想載體。

腺病毒載體； 慢病毒載體； 電穿孔法； 基因轉(zhuǎn)染； 內(nèi)耳毛細胞

噪聲、耳毒性藥物、感染及老化等因素可以造成耳蝸毛細胞損傷死亡，毛細胞丟失是感音神經(jīng)性聾的主要原因。哺乳動物耳蝸毛細胞不能自發(fā)再生，一旦毛細胞損傷死亡將造成永久性耳聾?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)是將目的基因轉(zhuǎn)入靶細胞的重要方法，通過基因轉(zhuǎn)染內(nèi)耳毛細胞預防毛細胞丟失、促進損傷毛細胞修復和激活毛細胞再生，是未來的研究和治療感音神經(jīng)性聾的方向。

相對于內(nèi)耳非感覺上皮細胞和成纖維細胞，毛細胞的基因轉(zhuǎn)染效率比較低。目前，許多病毒和非病毒載體已經(jīng)應用于內(nèi)耳毛細胞基因轉(zhuǎn)染研究，常規(guī)的脂質(zhì)體和鈣沉淀轉(zhuǎn)染方法很難將外源基因?qū)朊毎?］。Holt和Chen等［2，3］報道腺病毒載體（Ad5 DeltaE1／E3／CMV／GFP）能夠成功介導毛細胞基因轉(zhuǎn)染并且不影響毛細胞功能，而Venail等［4］報道腺病毒載體（Ad5 DeltaE1-E3／CMV／GFP）只轉(zhuǎn)染耳蝸的非感覺上皮細胞，綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）陽性的毛細胞非常少。Pietola等［5］研究報道，用慢病毒載體內(nèi)耳注射介導GFP轉(zhuǎn)染，僅在耳蝸鼓階和前庭階的非感覺上皮細胞中發(fā)現(xiàn)GFP陽性細胞，而Corti氏器中沒有GFP陽性細胞。Li［6］和shibata［7］發(fā)現(xiàn)腺相關(guān)病毒AAV只轉(zhuǎn)染血管紋細胞和支持細胞，不能轉(zhuǎn)染毛細胞；但Stone等［8］發(fā)現(xiàn)AAV1和AAV2能成功地將GFP轉(zhuǎn)導至毛細胞和支持細胞。本研究擬通過比較腺病毒、慢病毒和電穿孔法介導耳蝸毛細胞基因轉(zhuǎn)染的效果差異，以探尋一種簡便、高效轉(zhuǎn)染耳蝸毛細胞的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人血清型5型E1／E3缺陷型重組腺病毒（Ad5 DeltaE1／E3／CMV-GFP）購自北京諾賽基因組研究中心公司；慢病毒Lv-CMV -GFP購自廣州復能基因公司。DEME培養(yǎng)基和RNA提取試劑Trizol購自invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real t ime PCR試劑盒購自Promega公司；胎牛血清（GIBCO）；電轉(zhuǎn)儀（Bio Red）；熒光顯微鏡（Olympus）；Real time PCR儀（ABI）。

1.2 細胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 新生昆明小鼠（P2）111只（222耳），麻醉后斷頭，取出耳蝸，在PBS中分離螺旋韌帶和耳蝸感覺上皮。每個分離好的耳蝸感覺上皮分別置于預涂有多聚賴氨酸的玻片上，在DEME培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。

1.2.2 電穿孔法介導質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)耳毛細胞 分離好的耳蝸感覺上皮置于電轉(zhuǎn)緩沖液和質(zhì)?；旌弦海ㄙ|(zhì)粒終濃度為0.05μg／μl）中，將電極放在耳蝸上皮兩端（電極距離2 mm），實施電擊。采用不同條件（電壓20、27、35 V，方波／回旋波，持續(xù)時間20、35、40 ms，脈沖次數(shù)2、5、8次，共27組，每組4個耳蝸感覺上皮，共使用108個耳蝸）嘗試電穿孔法介導質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)耳毛細胞，電擊后立即將上皮小心地轉(zhuǎn)移至預涂有多聚賴氨酸的玻片上，在DEME培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清）中培養(yǎng)，48小時后檢測GFP熒光。

1.2.3 腺病毒、慢病毒載體介導轉(zhuǎn)染內(nèi)耳毛細胞耳蝸感覺上皮貼壁培養(yǎng)過夜后，分別加入不同滴度的腺病毒（原液1x1010pfu／ml，按1：10，1：100，1：1 000稀釋，共3組）和慢病毒（原液1×108顆粒／ml，按1：10，1：100，1：1 000稀釋，共3組），并設一組未轉(zhuǎn)染病毒的細胞為陰性對照，總共7組，每組6個耳蝸，共使用42個耳蝸，病毒轉(zhuǎn)染6小時（腺病毒）或24小時（慢病毒）后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后更換培養(yǎng)基并在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.3 Real-time PCR檢測Bmi1 mRNA表達水平耳蝸感覺上皮培養(yǎng)過夜后，分別加入不同滴度的重組腺病毒Ads-Bmi1-GFP（原液1×1010pfu／ml，按1：10，1：100，1：1 000稀釋，共3組），并設一組轉(zhuǎn)染重組腺病毒Ads-GFP的細胞為陰性對照組，共4組，每組6個耳蝸，重復三次實驗，共使用72個耳蝸。病毒轉(zhuǎn)染6小時后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后提取RNA。RNA提取采用Trizol法提取耳蝸感覺上皮總RNA，紫外分光光度儀測定總RNA含量。按照promega的試劑盒說明書合成cDNA并進行Real time PCR分析。Bmi1引物：F：5’-CAGCAATGACTGTGATGC-3’；R：5’-CTCCAGCATTCGTCAGTC-3’。GAPDH引物：F：5’-TGCGACTTCAACAGCAACTC-3’；R：5’-CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG-3’。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS11.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下內(nèi)耳毛細胞轉(zhuǎn)染效果

2.1.1 電穿孔法內(nèi)耳毛細胞轉(zhuǎn)染效果 不同條件下電穿孔法介導質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)耳毛細胞的效果不理想，當電壓超過30 V或持續(xù)時間超過40 ms時，耳蝸感覺上皮組織和細胞容易死亡；最高轉(zhuǎn)染效率的條件是質(zhì)粒0.5μg／μl，電壓27 V，方波／回旋波，持續(xù)時間35 ms，脈沖次數(shù)8次。在這種條件下，轉(zhuǎn)染陽性的GFP陽性細胞主要為大上皮塉細胞和成纖維細胞，GFP陽性的毛細胞偶見（圖1）。

2.1.2 慢病毒載體介導轉(zhuǎn)染內(nèi)耳毛細胞效果 慢病毒載體介導轉(zhuǎn)染內(nèi)耳毛細胞效率非常低，沒有GFP陽性的毛細胞（圖2）。

2.1.3 腺病毒載體介導轉(zhuǎn)染內(nèi)耳毛細胞效果 腺病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)耳毛細胞效率較高，GFP陽性的毛細胞較多。耳蝸頂回的毛細胞轉(zhuǎn)染陽性率較低，中回和底回的毛細胞轉(zhuǎn)染陽性率較高；內(nèi)毛細胞轉(zhuǎn)染陽性率較低，外毛細胞轉(zhuǎn)染陽性率較高；腺病毒滴度為1x108pfu／ml時，耳蝸中回外毛細胞轉(zhuǎn)染陽性率為90.0%±4.1%，內(nèi)毛細胞轉(zhuǎn)染陽性率為5%±0.4%（圖3）。

2.2 real-time PCR測定目的基因表達水平 為了進一步驗證腺病毒載體能否有效的介導外源基因在毛細胞中高表達，構(gòu)建重組腺病毒載體Ad5-Bmi1-GFP，并通過Real-time PCR檢測各實驗組Bmi1 mRNA表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果顯示，腺病毒載體成功介導外源Bmi1基因在毛細胞內(nèi)高表達（圖4）。

圖1 電穿孔法毛細胞基因轉(zhuǎn)染效果

圖2 慢病毒載體介導毛細胞基因轉(zhuǎn)染效果

圖3 腺病毒載體介導毛細胞基因轉(zhuǎn)染效果

3 討論

基因轉(zhuǎn)染的方法很多，分為病毒轉(zhuǎn)染和非病毒轉(zhuǎn)染兩類［9］，常用的非病毒轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔法；耳蝸毛細胞是較難轉(zhuǎn)染的原代細胞，常規(guī)的脂質(zhì)體和鈣沉淀法很難將外源基因?qū)朊毎ｋ姶┛追椒ㄊ禽^常用的轉(zhuǎn)染懸浮細胞方法，靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞內(nèi)，但此方法對細胞損傷較大，電穿孔轉(zhuǎn)染K562細胞后24小時觀察轉(zhuǎn)染細胞凋亡率為40%［10］。本研究首次嘗試了用電穿孔法轉(zhuǎn)染耳蝸毛細胞，結(jié)果顯示電穿孔后細胞損傷較大，電壓過大或持續(xù)時間過長會導致感覺上皮細胞死亡。在細胞能耐受的轉(zhuǎn)染條件下，難以將目的基因轉(zhuǎn)入毛細胞。

圖4 腺病毒載體介導外源Bmi1基因m RNA表達水平測定

常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂期細胞，而內(nèi)耳毛細胞是原代細胞，因此不適合轉(zhuǎn)染毛細胞。據(jù)文獻報導，相對于毛細胞來說，腺相關(guān)病毒載體更適合轉(zhuǎn)染內(nèi)耳支持細胞［7，8］。本研究嘗試用重組慢病毒和腺病毒載體轉(zhuǎn)染耳蝸毛細胞，結(jié)果顯示腺病毒載體對內(nèi)耳毛細胞的轉(zhuǎn)染效率較高，這可能與它們對耳蝸毛細胞的親嗜性不同有關(guān)；此外，隨著腺病毒滴度的提高，腺病毒轉(zhuǎn)染效率也隨之提高，此現(xiàn)象與文獻報導相一致［11］；腺病毒類型對毛細胞功能有一定的影響［2］，僅去除E1／ab元件的復制缺陷重組腺病毒雖然能有效的將GFP轉(zhuǎn)入毛細胞中，但是影響毛細胞離子通道的功能，而去除E1、E3、病毒聚合酶和前末端蛋白的復制缺陷重組腺病毒轉(zhuǎn)染毛細胞后不影響毛細胞離子通道功能［2］。腺病毒可在293T工具細胞內(nèi)可大量擴增，具有易制備、容量大、滴度高、高效轉(zhuǎn)染靜止和分裂期的細胞、不產(chǎn)生插入突變等優(yōu)點；腺病毒載體不與靶細胞染色體整合，轉(zhuǎn)入基因可在轉(zhuǎn)染陽性細胞內(nèi)維持高水平表達2～4周，能夠滿足耳聾基因致聾機制和促進毛細胞再生研究的需要。

總之，本研究結(jié)果顯示，與電穿孔和慢病毒載體相比，腺病毒載體能更有效地將外源基因?qū)攵伱毎麅?nèi)表達，是轉(zhuǎn)染耳蝸毛細胞的理想載體。

1 Staecker HD，Li BW，O＇Malley Jr，et al.Gene expression in the mammalian cochlea：a study of multiple vector systems［J］.Acta Otolaryngol，2001，121：157.

2 Holt JR.Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the Mammalian inner ear［J］.Audiol Neurootol，2002，7：157.

3 Chen Y，Yu H，Zhang Y，et al.Cotransfection of Pax2 and Math1 promote in situ cochlear hair cell regeneration after neomycin insult［J］.Sci Rep，2013，3：2996.

4 Venail FJ，Wang J，Ruel J，et al.Coxsackie adenovirus receptor and alpha nu beta3／alpha nu beta5 integrins in adenovirus gene transfer of rat cochlea［J］.Gene Ther，2007，14：30.

5 Pietola L，Aarnisalo AA，Joensuu J，et al.HOX-GFP and WOX-GFP lentivirus vectors for inner ear gene transfer［J］. Acta Otolaryngol，2008，128：613.

6 Li Duan，Bordet MT，Mezzina M，et al.Adenoviral and adeno -associated viral vector mediated gene transfer in the guinea pig cochlea［J］.Neuroreport，2002，13：1295.

7 Shibata SB，Pasquale GDi，Cortez SR，et al.Gene transfer using bovine adeno-associated virus in the guinea pig cochlea［J］.Gene Ther，2009，16：990.

8 Stone IM，Lurie DI，Kelley MW，et al，Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea［J］.Mol Ther，2005，11：843.

9 葉美玲，王少元.基因轉(zhuǎn)染技術(shù)及其在白血病研究中的應用［J］.醫(yī)學綜述，2010，16：1934.

10 竇立萍，劉軍華，王暢，等.電穿孔轉(zhuǎn)染K562細胞的效率研究［J］.軍醫(yī)進修學院學報，2008，29：420.

11 Holt JR，Johns DC，Wang S，et al.Functional expression of exogenous proteins in mammalian sensory hair cells infected with adenoviral vectors［J］.J Neurophysiol，1999，81：1881.

（2014-12-30收稿）

（本文編輯 周濤）

The Comparative Study of Different Methods for Gene Transfer to Cochlear Hair Cells

Chen Yan，Lai Chuijin，Li Wen，Li Huawei
（Affiliated Eye and ENT Hospital of Fudan University，Shanghai，200031，China）

Objective To obtain an easy and high efficient method for gene transfer to cochlear hair cells，by comparing three mediating green fluorescent protein（GFP）methods（electroporation，adenovector and lentivirus vector）.Methods Cochlear sensory epithelium was dissected from anaesthetized P2 mice.Sensory epithelia were transferred onto poly-L-lysine treated cover slides and cultured overnight.Gene transfer was performed by electroporation in medium containing pGPHI／GFP／Neo plasmid or by incubation with diluted recombined adenovirus／lentivirus vector.After 48 hours，green fluorescence was checked under fluorescence microscope.To confirm the efficiency of exogenous gene transfer，real-time PCR was performed using specific primers.Results The transfection efficiencies of electroporation and lentivirus vector mediated gene transfer were very low.Both immunofluorescence and real-time PCR results showed that the transfection efficiency of adenovirus mediated GFP and Bmi1 transfer were relatively higher.The proportion of GFP positive cells in outer hair cells and inner hair cells of middle turn were 90.0%±4.1%and 5%±0.4%，respectively.Conclusion Adenovector is more efficient for exogenous gene transfer to cochlear hair cells，thus adenovector is a good carrier for gene transfer to cochlear hair cells.

Inner ear； Cochlear hair cells； Gene transfer； Electroporation； Adenovector； Lentivirus vector

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.02.012

時間：2015-3-3 14：40

R764.35

A

1006-7299（2015）02-0166-04

* 973及國家重大研究計劃（2011CB504506）、國家自然科學基金（81100709）、教育部博士點基金博導類計劃（20120071110077）聯(lián)合資助

1 復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院（上海 200031）

陳巖，女，山東人，助理研究員，博士，主要研究方向為感音性聾的機制和防治。

李華偉（Email：lihuawei63@gmail.com）

△ 為并列第一作者

網(wǎng)絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150303.1440.032.html