丹龍醒腦方抗缺血性腦損傷機制的實驗研究進(jìn)展

曹澤標(biāo)，周小青*，張利美，陳娉婷，劉旺華

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南 長沙 410007）

丹龍醒腦方抗缺血性腦損傷機制的實驗研究進(jìn)展

曹澤標(biāo)1，周小青2*，張利美1，陳娉婷1，劉旺華2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南 長沙 410007）

丹龍醒腦方；缺血性腦損傷；機制；級聯(lián)反應(yīng)；神經(jīng)再生

腦血管病是威脅中老年人健康的常見疾病，據(jù)衛(wèi)計委《2014中國衛(wèi)生和計劃生育統(tǒng)計年鑒》顯示，在2013年居民主要疾病發(fā)病率、死亡率和致殘率中，腦血管病都排前三位，給社會和家庭帶來了巨大負(fù)擔(dān)，而腦血管病中約80%屬缺血性[1]。研究表明，腦缺血后，將發(fā)生缺血性腦損傷級聯(lián)反應(yīng)[2]，使神經(jīng)細(xì)胞大量丟失導(dǎo)致腦功能缺失；同時處于“靜息”狀態(tài)下的神經(jīng)干細(xì)胞被激活而發(fā)生神經(jīng)再生[3]。因此，干預(yù)級聯(lián)反應(yīng)減少腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞丟失和促進(jìn)神經(jīng)再生已成為治療缺血性腦血管病的主要途徑。

丹龍醒腦方是周小青教授經(jīng)驗方，用于治療缺血性腦血管病，現(xiàn)已作為附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，并獲得了中藥新藥臨床研究批文（批件號：2003L1997）。十多年來，在臨床應(yīng)用該復(fù)方取得良好療效的同時，研究人員結(jié)合現(xiàn)代科技，對其抗缺血性腦損傷的機制進(jìn)行了大量實驗研究，發(fā)現(xiàn)其能針對腦缺血后的病理生理過程進(jìn)行多方位、多環(huán)節(jié)、多靶點干預(yù)，現(xiàn)將有關(guān)研究成果和進(jìn)展綜述如下。

1 丹龍醒腦方與缺血性腦損傷級聯(lián)反應(yīng)

1.1 缺血性腦損傷級聯(lián)反應(yīng)

缺血性腦損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，它包括缺血期的原發(fā)性損傷和再灌注期的繼發(fā)性損傷，二者緊密聯(lián)系，呈現(xiàn)出級聯(lián)反應(yīng)。概括地說，該級聯(lián)反應(yīng)主要涉及代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、循環(huán)障礙和細(xì)胞凋亡等環(huán)節(jié)。

1.1.1 代謝紊亂 該級聯(lián)反應(yīng)的始動因素是缺血缺氧，導(dǎo)致ATP合成減少，離子泵部分功能失效和細(xì)胞膜去極化，細(xì)胞間隙中以谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)為代表的興奮性氨基酸（EAAs）濃度升高，呈現(xiàn)出一定的毒性；同時Ca2+大量進(jìn)入胞內(nèi)出現(xiàn)鈣超載，線粒體功能障礙并損傷，一氧化氮（NO）等自由基及其代謝產(chǎn)物如丙二醛(MDA)生成增多、自由基生成抑制劑如超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，從而表現(xiàn)出一定的氧化損傷[4]。

1.1.2 炎癥反應(yīng) 氧自由基及其他信使可激活核轉(zhuǎn)錄因子尤其是核因子κB亞基(NF-κB)調(diào)控的炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[5]，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等表達(dá)增多，同時趨化因子釋放，黏附分子如細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子l等表達(dá)上調(diào)，白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞阻塞微血管，形成“無復(fù)流現(xiàn)象”，并釋放大量炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，吸引更多中性粒細(xì)胞浸潤，加重炎癥，造成惡性循環(huán)。

1.1.3 循環(huán)障礙 自由基和鈣超載可進(jìn)一步導(dǎo)致血液流變學(xué)改變，如腦血管痙攣、紅細(xì)胞變形性差、血小板聚集、纖維蛋白含量增加、血液黏稠度增加等，致使腦微小血管血栓形成；另外，NO等自由基的擴(kuò)血管作用及炎性反應(yīng)可使血腦屏障（BBB）通透性增加，甚至破壞BBB[6]。

1.1.4 細(xì)胞凋亡 腦缺血后EAAs毒性、鈣超載等各種誘導(dǎo)因素可引起細(xì)胞凋亡啟動，然后主要通過死亡受體通路和線粒體通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為前者重要因子Fas/FasL、TNF-α、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）、凋亡蛋白酶（caspase）-8、caspase-3等表達(dá)上調(diào)；后者的重要因子細(xì)胞色素-C（Cyto-C）、第二種天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶激活物（Samc）、caspase-9、caspase-3等表達(dá)上調(diào)[7]，凋亡抑制蛋白（IAPs）尤其是X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）表達(dá)下調(diào)。細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控，腦缺血后，促凋亡基因（如Bax）及抑制凋亡基因（如Bcl-2）表達(dá)會發(fā)生動態(tài)變化[8]，影響神經(jīng)細(xì)胞凋亡。需要指出的是，上述各環(huán)節(jié)常密切相關(guān)，互為因果，彼此重疊，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡和腦功能缺失。

1.2 丹龍醒腦方可多環(huán)節(jié)干預(yù)缺血性腦損傷級聯(lián)反應(yīng)

1.2.1 調(diào)節(jié)腦組織代謝 研究發(fā)現(xiàn)，丹龍醒腦方抗缺血性腦損傷機制與其調(diào)節(jié)腦組織代謝有關(guān)。研究者用雙側(cè)頸總動脈反復(fù)夾閉再灌注同時腹腔注射硝普鈉建立VD大鼠模型，研究該方對腦組織代謝的影響。結(jié)果顯示丹龍醒腦片組能使Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性明顯升高，腦組織中Glu、Asp、MDA、Ca2+的含量明顯降低，SOD活性顯著升高。表明該方能改善腦組織能量代謝障礙，維持細(xì)胞的主動轉(zhuǎn)運功能，使細(xì)胞內(nèi)外離子濃度趨向正常[9]；能調(diào)節(jié)腦組織EAAs含量、減輕其興奮性毒性，保護(hù)大腦神經(jīng)細(xì)胞[10]；還可以改善自由基代謝、減輕神經(jīng)細(xì)胞Ca2+超載[11]。另外，對腦缺血再灌注沙土鼠模型，丹龍醒腦片也能調(diào)節(jié)其腦組織EAAs含量、減輕其興奮性毒性，保護(hù)大腦海馬區(qū)神經(jīng)元[12]。

1.2.2 抑制腦內(nèi)炎癥 多項實驗表明丹龍醒腦方可通過抑制炎癥來發(fā)揮抗缺血性腦損傷的作用。在觀察活血通絡(luò)法（丹龍醒腦方）對大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)再通誘導(dǎo)的中性粒白細(xì)胞浸潤的影響時，發(fā)現(xiàn)丹龍醒腦方能降低腦組織髓過氧化物酶（MPO）活性，減輕再灌注腦組織中性粒白細(xì)胞的浸潤[13]。研究組成員還分別就丹龍醒腦方對老齡大鼠腦缺血再灌注模型的NF-κB及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)進(jìn)行了探討[14-16]，顯示該方能顯著抑制NF-κB及ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)，表明丹龍醒腦片抗老年腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機制與其抑制由缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的NF-κB及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。

1.2.3 改善大腦血液循環(huán) 研究人員觀察了丹龍醒腦片對VD模型大鼠血液流變學(xué)的改善作用，發(fā)現(xiàn)丹龍醒腦片組全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積及纖維蛋白原濃度均降低，提示丹龍醒腦片能通過改善腦缺血損傷后大鼠血液流變狀態(tài)，從而改善大腦血液供應(yīng)[17]。對實驗性腦血栓形成大鼠保護(hù)作用及對花生四烯酸(AA)代謝的影響研究表明，丹龍醒腦片組腦組織伊文思蘭吸光度值A(chǔ)620、血漿血栓素B2（TXB2）、6-酮前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)含量均明顯降低，顯示丹龍醒腦片對血栓誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的腦血栓形成具有抑制作用，對腦血栓形成后腦血管通透性的升高有抑制作用，其作用可能是通過對抗腦血栓形成而發(fā)揮的[18]。

1.2.4 減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡 大量研究證實丹龍醒腦方抗缺血性腦損傷的一個非常重要的機制是減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。研究顯示丹龍醒腦片能使MCAO大鼠模型神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）和凋亡神經(jīng)細(xì)胞積分光密度（IOD）明顯降低，海馬區(qū)存活細(xì)胞數(shù)明顯增多[19]，表明該方能減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。研究者還從介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的兩條主要信號通路進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)該方能顯著抑制Fas/FasL、TNF-α的表達(dá)，使FADD、caspase-8、caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明該組方的作用機制可能與抑制細(xì)胞凋亡死亡受體通路有關(guān)[20-21]。對于線粒體通路，該方能顯著減少Cyto-C、caspase-9、caspase-3、Smac并促進(jìn)XIAP的表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)元及神經(jīng)功能，提示該方作用機理與抑制細(xì)胞凋亡線粒體通路有關(guān)[22]。另外，研究人員還從細(xì)胞凋亡基因調(diào)控層面進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)丹龍醒腦方組抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)顯著性增加，凋亡基因Bax蛋白表達(dá)降低，表明丹龍醒腦方能通過增強Bcl-2的表達(dá)、抑制Bax的表達(dá)來抑制神經(jīng)元凋亡，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用[23]。

2 丹龍醒腦方與缺血性腦損傷后神經(jīng)再生

2.1 缺血性腦損傷后神經(jīng)再生

缺血性腦損傷后的神經(jīng)再生主要是指神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的增殖、遷移和分化過程。神經(jīng)干細(xì)胞終身具有分裂潛能和自我更新能力，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)[24]。研究顯示，在腦組織發(fā)生缺血缺氧等損傷后，NSCs能通過不對稱分裂增殖分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，同時向梗死區(qū)遷移，參與神經(jīng)功能的修復(fù)過程，即神經(jīng)發(fā)生。在此過程中，神經(jīng)干細(xì)胞所表達(dá)的特異性標(biāo)志物巢蛋白（Nestin）及星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性活化的標(biāo)志蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白 （GFAP）等表達(dá)升高[25]。同時，神經(jīng)再生還受多種調(diào)節(jié)因子和信號通路的調(diào)控。研究表明，損傷后多種促進(jìn)神經(jīng)再生的生長因子如堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF），細(xì)胞因子如睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNF）及營養(yǎng)因子如膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）的表達(dá)增加[26]，這些神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)因子在NSCs增殖、分化中發(fā)揮重要作用。同時，與神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化相關(guān)的信號通路如Wnt/β-catenin[27]、Notch、骨形成蛋白、促分裂素原活化蛋白激酶、NF-κB信號通路等啟動，從各個環(huán)節(jié)對NSCs的增殖、遷移和分化進(jìn)行調(diào)控。同樣，各調(diào)節(jié)因子和信號通路并非孤立的，而是交叉重疊，相互影響，共同構(gòu)成了一個影響神經(jīng)再生的精密網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。

2.2 丹龍醒腦方能促進(jìn)缺血性腦損傷后神經(jīng)再生

2.2.1 促進(jìn)NSCs的增殖和分化 研究者以5-溴脫氧尿嘧啶核苷摻入法檢測NSCs增殖，顯示丹龍醒腦方組NSCs增殖數(shù)量顯著升高，表明該方能促進(jìn)NSCs的增殖[28]。同時，研究人員還通過免疫組化法檢測Nestin，間接探討該方促NSCs增殖作用，同樣用免疫組化法檢測GFAP來探討其促NSCs分化作用，發(fā)現(xiàn)丹龍醒腦方組在治療3 d和7 d后Nestin的平均光密度增加，GFAP的平均灰度值減少，提示該方能促進(jìn)NSCs增殖和分化，其抗腦缺血損傷的機制可能與促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化有關(guān)[29]。

2.2.2 促進(jìn)多種促神經(jīng)再生調(diào)節(jié)因子的表達(dá) 研究人員通過探討丹龍醒腦方對大鼠腦缺血再灌注后NGF、bFGF和GDNF表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)較之模型組，丹龍醒腦方中、大劑量組NGF、bFGF、GDNF的陽性表達(dá)灰度值均顯著降低，即陽性率增大，提示丹龍醒腦方可能通過促進(jìn)NGF、bFGF、GDNF的表達(dá)來促進(jìn)NSCs增殖[28]。

2.2.3 通過調(diào)控相關(guān)信號通路促進(jìn)神經(jīng)再生 腦缺血后神經(jīng)再生受多條信號通路的調(diào)控，有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在NSCs的增殖分化中起重要作用，甚至處于核心地位[30]。本研究組也從Wnt/β-catenin通路探討了丹龍醒腦方促進(jìn)MCAO大鼠神經(jīng)再生的機理。近期研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，西藥組、丹龍醒腦方組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)、βcatenin、Wnt-3a蛋白及mRNA表達(dá)明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明丹龍醒腦方可能通過激活βcatenin及Wnt-3a蛋白表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖[31]，即與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路活化有關(guān)。

3 結(jié)語

丹龍醒腦方由丹參、三七、地龍、石菖蒲、遠(yuǎn)志、菟絲子、淫羊藿等組成，具有活血通絡(luò)、化痰開竅、補腎生髓之功。大量研究顯示[32-33]，對于缺血性腦損傷，活血通絡(luò)和化痰開竅法能干預(yù)級聯(lián)反應(yīng)，補腎生髓法能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化。另外，現(xiàn)代藥理研究也表明，丹參酮ⅡA能降低腦水腫，清除自由基，抑制炎癥[34]，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[35]；三七總皂苷能降低腦部細(xì)胞因子的表達(dá)和血腦屏障通透性[36]；香港遠(yuǎn)志黃酮苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠BBB有保護(hù)作用[37]；淫羊藿及其提取物對NSCs具有直接促增殖作用[38]。這些都可能是丹龍醒腦方多環(huán)節(jié)干預(yù)級聯(lián)反應(yīng)和促進(jìn)神經(jīng)再生的物質(zhì)基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步研究。

然而，在取得大量實驗研究成果的同時，還有一些尚待完善之處：（1）在多環(huán)節(jié)干預(yù)級聯(lián)反應(yīng)方面已經(jīng)積累了較多成果，但對促進(jìn)神經(jīng)再生方面研究較少，而且不夠系統(tǒng)、深入，尤其是對可能的信號通路的研究，尚未見報道；（2）丹龍醒腦方干預(yù)級聯(lián)反應(yīng)機制及促進(jìn)神經(jīng)再生機制分別在抗缺血性腦損傷中的作用時間窗及二者間相互關(guān)系有待研究；（3）對級聯(lián)反應(yīng)中各環(huán)節(jié)其他靶點的干預(yù)、對不利于神經(jīng)再生相關(guān)調(diào)節(jié)因子的作用及對與神經(jīng)再生相關(guān)的其他信號通路的影響尚待研究；（4）除對方中主要成分三七總皂苷進(jìn)行了抗缺血性腦損傷部分研究外，尚缺乏從本方藥理學(xué)角度探討其抗缺血性腦損傷的機制，顯然不利于該方科學(xué)性的解釋和新藥的開發(fā)；（5）目前研究多局限在動物實驗，尚未見細(xì)胞水平的研究報道。面對這些問題，研究組正在對其中一部分進(jìn)行探討，而且已經(jīng)取得了一定成果；對某些尚未著手研究的部分，期待將來條件成熟時逐漸解決。

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（本文編輯 匡靜之）

Experimental Research Progress on the M echanism of Danlongxingnao Fang against Ischem ic Brain Injury

CAO Zebiao1,ZHOU Xiaoqing2*,ZHANG Limei1,CHEN Pingting1,LIU Wanghua2

（1.Graduate School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China; 2.Research Institute for Diagnostics of TCM,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China）

Danlongxingnao Fang;ischemic brain damage;mechanism;cascade reaction;nerve regeneration

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.019

2014－12－24

國家自然科學(xué)基金資助項目（81373702，81473567）。

曹澤標(biāo)，男，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)心腦血管疾病證治。

*周小青，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zxq5381@sohu.com。