2型糖尿病與海馬蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)性的研究進(jìn)展

涂畫高翔陳雪品①成曦爽①石亞靜①韓淑英①郭蘭②

(華北理工大學(xué)藥學(xué)院河北唐山063000;①基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;②冀唐學(xué)院)

[關(guān)鍵詞]2型糖尿病海馬蛋白學(xué)習(xí)記憶關(guān)聯(lián)性

[中圖分類號]R 587

[文章編號]2095-2694(2015)06-244-03

【基金項目】華北理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實驗計劃項目(編號：x2015214)；唐山市“十二五”科技重點項目(編號：10130203)。

【作者簡介】涂畫(1994-)，女，華北理工大學(xué)在讀生。研究方向：中藥藥學(xué)。

【通訊作者】韓淑英。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活方式的改變以及人口老齡化，2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年增長的趨勢，尤其是在發(fā)展中國家和部分發(fā)達(dá)國家中，其增長速度更快。T2DM是老年人群中常見的代謝性疾病，隨著病程的延長，T2DM可導(dǎo)致中樞認(rèn)知功能的損害，尤其是學(xué)習(xí)和記憶能力的下降，甚至發(fā)展成阿爾茲海默癥(AD)[1]，現(xiàn)在多稱由糖尿病所引起的學(xué)習(xí)障礙為“糖尿病腦病”[2]。國內(nèi)外研究表明，糖尿病引發(fā)認(rèn)知學(xué)習(xí)記憶功能障礙的核心在于腦神經(jīng)元的受損、缺失和功能下調(diào)[3]，而海馬又是學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知功能的重要腦組織，多種海馬蛋白的表達(dá)以及糖尿病的發(fā)生會影響海馬突觸的可塑性[4,5]，提示糖尿病病程中海馬蛋白改變可能是導(dǎo)致發(fā)生學(xué)習(xí)記憶障礙的重要原因。

1海馬內(nèi)病理過程相關(guān)蛋白

1.1載脂蛋白E (ApoE)在腦內(nèi)，ApoE主要是由星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。ApoE與淀粉β樣蛋白(AB)結(jié)合，可以導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞變性甚至死亡，引起細(xì)胞外老年斑的增加(SP)和乙酰膽堿(Ach)的不足，從而引起學(xué)習(xí)記憶功能障礙[6,7]。石梅[3]等將大鼠禁食24h，按55mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素建立T2DM模型；經(jīng)曠場與Mirros水迷宮測試發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠發(fā)生了學(xué)習(xí)記憶功能障礙，測試后立即處死大鼠取海馬組織，通過目的基因反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病模組海馬的ApoE mRNA表達(dá)水平較正常對照組明顯增加，而皮層的ApoE mRNA表達(dá)水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示T2DM使得大鼠腦內(nèi)海馬的ApoE mRNA的表達(dá)水平升高,與學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)生有關(guān)。

1.2Aββ淀粉樣前體蛋白(APP)在分泌酶的作用下剪切成Aβ。Aβ是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，可以引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，損傷內(nèi)皮細(xì)胞致使細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境失衡而促進(jìn)氧自由基(ROS)的生成，引起神經(jīng)元的損傷和死亡?，F(xiàn)代研究表明，大腦皮層及海馬區(qū)的 Aβ 在胞外積累并形成SP，正是AD的病理特征之一[8]。提示糖尿病病程中海馬中Aβ沉積是造成學(xué)習(xí)記憶障礙的重要原因。孫忠文[9]等以GK大鼠為T2DM實驗組模型，wistar大鼠為正常對照組，適應(yīng)喂養(yǎng)1周后取腦。通過免疫組織化學(xué)染色法檢測腦組織腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8樣因子2(TIPE2)和Aβ1-40的表達(dá)及空間分布，結(jié)果表明，Aβ1-40主要分布于皮質(zhì)和海馬等組織結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管壁，并且證明TIPE2蛋白的表達(dá)與Aβ1-40水平呈正相關(guān)。提示免疫調(diào)節(jié)因子TIPE2可能通過其免疫負(fù)調(diào)控作用，使Aβ沉積誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促使糖尿病腦組織的損傷。王苗[10]等采用高脂高糖飲食加小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素建立T2DM大鼠模型，將wistar大鼠分為3、6月齡正常組與3、6月齡T2DM組，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Elisa)法測定低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(Lrp-1)、Aβ1-40在腦組織的表達(dá)量。其中Lrp-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)清除對腦內(nèi)Aβ1-40動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)起重要作用。研究結(jié)果表明，Aβ1-40表達(dá)于大鼠大腦皮質(zhì)、海馬等處的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿、胞膜及軟腦膜動脈和穿支動脈的外膜及平滑肌細(xì)胞處；在同月齡大鼠中，糖尿病組Aβ1-40在腦組織中表達(dá)均較正常大鼠組明顯增多，Lrp-1的表達(dá)明顯減少，提示Aβ1-40沉積可能與Lrp-1的表達(dá)下調(diào)有關(guān)，進(jìn)而使得Aβ的清除受阻，造成腦內(nèi)沉積，可能導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶發(fā)生障礙。

1.3tau蛋白tau蛋白是腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞重要的支架蛋白之一，其可促進(jìn)微管的形成以及維持其穩(wěn)定性，而微管參與維持細(xì)胞形態(tài)、信息傳遞以及軸突的形成。tau蛋白的過度磷酸化使其成為毒性分子而聚積成雙螺旋纖絲(PHF)和束狀細(xì)絲(SF)，形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)。若其從微管中釋放出來，會導(dǎo)致細(xì)胞骨架異常、軸漿運(yùn)輸障礙，這種改變與認(rèn)知障礙和記憶缺失有著密切聯(lián)系[5]。楊雁[11]等從20只雄性SD大鼠中挑選16只以高脂高糖高蛋白飼料喂養(yǎng)，再從其中取8只按照20～25mg/kg劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌素，尿糖持續(xù)陽性，T2DM造模成功為T2DM組，余下8只為肥胖組(OB組)。采用蛋白質(zhì)印跡研究T2DM及單純肥胖大鼠腦中海馬回 tau 蛋白磷酸化程度，發(fā)現(xiàn)在這兩種大鼠模型中海馬 tau 蛋白在多個位點上都呈現(xiàn)過度磷酸化狀態(tài)。另外，海馬神經(jīng)細(xì)胞膜上胰島素受體 β亞基水平在兩種實驗?zāi)Ｐ椭酗@著下降。提示T2DM及肥胖可能通過增高胰島素抵抗，導(dǎo)致tau 蛋白的過度磷酸化，增加學(xué)習(xí)記憶障礙的風(fēng)險。

1.4鈉鉀泵ATP酶(NKA)NKA是細(xì)胞膜上物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、能量轉(zhuǎn)化和信息傳遞的重要蛋白酶。糖尿病時葡萄糖增高使細(xì)胞的多元醇代謝途徑激活,引起神經(jīng)組織“偽缺氧”、自由基生成增多和Na+-K+ATP酶活性降低等變化，其中Na+-K+ATP酶活性的降低可導(dǎo)致突觸內(nèi)Na+堆積,以致神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢[12]。同時細(xì)胞內(nèi)的Na+增多和Ca2+的蓄積，可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷。因此糖尿病程中海馬中的NKA的改變可能是導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的重要因素。林軍[13]等將大鼠禁食24h,按55mg/kg腹腔注射佐鏈霉素建立T2DM模型。以曠場分析法和Morris水迷宮法考察各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,檢測大腦皮層和海馬的Na+-K+ATP酶活性。結(jié)果表明，糖尿病大鼠曠場分析表現(xiàn)出中央格停留時間延長、探洞次數(shù)較少、Morris水迷宮實驗示逃避潛伏時間延長、搜尋平臺策略成績降低。T2DM模型對照組動物大腦皮層和海馬的Na+-K+ATP酶活性較正常對照組下降，大腦皮層和海馬的Na+-K+ATP酶活性明顯下降。預(yù)示著這兩腦區(qū)的神經(jīng)功能發(fā)生病理學(xué)改變,因而學(xué)習(xí)記憶功能出現(xiàn)障礙。

1.5胰島素受體底物-1(IRS-1)IRS-1是胰島素信號的傳導(dǎo)分子，組織細(xì)胞內(nèi)IRS-1蛋白表達(dá)是胰島素信號傳導(dǎo)的基礎(chǔ)。莊曉明[14]等以KKAy小鼠置于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)建立T2DM模型，處死后立即取海馬組織，并將海馬組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色以及免疫組化定量分析。結(jié)果表明，糖尿病組電鏡下海馬區(qū)的神經(jīng)元核膜凹陷，海馬神經(jīng)元胰島素受體(InsR)陽性反應(yīng)神經(jīng)元數(shù)目比正常對照組明顯減少、染色淡、突起少，DM組海馬(InsR)、IRS-1的表達(dá)低于正常組。提示胰島素信號傳導(dǎo)阻滯是可能導(dǎo)致神經(jīng)元的退行性變的原因之一。

2海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，是多基因調(diào)控的細(xì)胞自殺性凋亡。但異常的激活凋亡因子加速正常細(xì)胞的凋亡，會造成組織、細(xì)胞的損傷。在Bcl-2家族中，細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序取決于Bcl-2與Bax的相對數(shù)量，Bcl-2/Bax的比值改變與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)；在caspases級聯(lián)反應(yīng)中，caspases-3是最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白，其引起核酸斷裂，引起細(xì)胞凋亡；而凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)也是caspases級聯(lián)反應(yīng)中重要的調(diào)控蛋白。吳亮[15]等用高脂飲食加小劑量30mg/kg鏈脲佐菌素誘導(dǎo)T2DM模型，Morris水迷宮法評價大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、Western blot法檢測大腦皮層及海馬組織Bax、Bcl-2、caspase-3、AIF蛋白表達(dá)水平。Morris水迷宮測試發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，T2DM組大鼠第5天潛伏期明顯延長，第5天搜索策略明顯變差；海馬中caspase-3、AIF蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)無明顯變化。這均提示糖尿病時神經(jīng)元內(nèi)凋亡蛋白與促凋亡蛋白的表達(dá)占優(yōu)勢地位，這可能是神經(jīng)元數(shù)目變少并導(dǎo)致認(rèn)知障礙的直接原因。莊曉明[16]等在研究APP17肽對T2DM KKAy小鼠大腦海馬神經(jīng)元部分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)的影響中，利用免疫沉淀并蛋白印跡法檢測海馬中pMAPK、CREB、pCREB、Bax、Bcl-2等凋亡蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明：KKAy小鼠海馬神經(jīng)元的P-MAPK表達(dá)下降，其他均表達(dá)正常，并且沒有出現(xiàn)Tunel陽性細(xì)胞，說明海馬神經(jīng)元未出現(xiàn)凋亡。

3其他相關(guān)蛋白

3.1NO合酶NO合酶是催化L-精氨酸生成NO的重要蛋白質(zhì)，因為NO極易擴(kuò)散且半衰期短，所以NO的作用與NOS密不可分。NO是一種新型神經(jīng)遞質(zhì)和信息分子，參與學(xué)習(xí)記憶過程，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要作用。張松筠[17]等用6周齡雄性糖尿病C57BL/KsJ db/db小鼠與正常對照組相比, 通過NADPH-d組織化學(xué)反應(yīng)觀察糖尿病組小鼠海馬齒狀回NOS陽性神經(jīng)元密度顯著減少(P<0.01)。提示糖尿病病程中NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量減少影響了NO的合成，從而使糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生障礙。李強(qiáng)[18]等以小劑量鏈脲佐菌素連續(xù)腹腔注射建立T2DM大鼠模型，通過SP免疫組化染色觀察海馬神經(jīng)元nNOS的表達(dá)。結(jié)果顯示nNOS免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)膩顆粒狀，位于海馬神經(jīng)元的胞漿。與正常對照組大鼠相比，糖尿病，模型組大鼠海馬神經(jīng)元nNOS的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。提示過量的NO會產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，最終引起海馬組織的損傷。

3.2NAA/Cr、Cho/Cr乙酰天冬氨酸復(fù)合物(NAA)作為可神經(jīng)元的標(biāo)志物在神經(jīng)元線粒體中代謝，主要是反映神經(jīng)元的密度及完整。膽堿復(fù)合物(Cho)主要是參與神經(jīng)元細(xì)胞髓鞘的形成，是反映細(xì)胞膜磷脂分解、合成的指標(biāo)，細(xì)胞崩裂時可引起Cho水平的升高。Cho還是記憶認(rèn)知、情緒行為等重要神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的前體。提示Cho含量的升高可能導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙。周紅[4]等以21例T2DM患者為對象，進(jìn)行聽覺詞語記憶測試-延遲回憶項(AVLT-delayrecall、AVLT-recognition)和畫鐘測試(CDT)等認(rèn)知功能評估測試，常規(guī)行MR橫斷、矢狀及垂直于海馬長軸的斜冠狀面多序列成像,取垂直于海馬長軸的T2WI定位相，對所得譜線進(jìn)行相位、基線校正，并計算出NAA/Cr、Cho/Cr的比值。結(jié)果表明：T2DM患者AVLT-delayrecall、AVLT-recognition和CDT測試成績均明顯低于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，T2DM患者雙側(cè)海馬NAA/Cr均降低(均P<0.01)，并以左側(cè)為著(P<0.05);左側(cè)海馬Cho/Cr增高(P<0.05)。提示糖尿病引起海馬的多項指標(biāo)代謝異常，出現(xiàn)認(rèn)知功能的障礙，可認(rèn)為左側(cè)海馬代謝可能與記憶損害密切相關(guān)。

綜上所述，T2DM所導(dǎo)致的糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，海馬蛋白的改變會使腦內(nèi)有關(guān)學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)元的改變，從而發(fā)生學(xué)習(xí)記憶障礙，提示T2DM所致海馬內(nèi)蛋白表達(dá)異常是發(fā)生糖尿病腦病的重要機(jī)制。

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(2015-06-25收稿)(王一伊編輯)