膠質(zhì)瘤相關(guān)分子標(biāo)志物和異質(zhì)性的研究進展

韓劍孫澤林

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院河北唐山063000)

[關(guān)鍵詞]膠質(zhì)瘤異質(zhì)性分子標(biāo)志物

[中圖分類號]R 57

[文章編號]2095-2694(2015)06-247-06

【作者簡介】韓劍(1989-)，男，碩士。研究方向：膠質(zhì)瘤。

【通訊作者】孫澤林。

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤，由于具有難治性、局部浸潤性生長和復(fù)發(fā)等特點，預(yù)后很差,臨床以手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療為主。盡管膠質(zhì)瘤臨床診療技術(shù)有了日新月異的進步，但其復(fù)發(fā)仍是不可避免的。不同發(fā)病階段、不同患者、相同患者不同腫瘤部位之間的基因型存在差異。在時間、個體之間的差異被稱為腫瘤之間的異質(zhì)性[1]。腫瘤內(nèi)部不同區(qū)域，隨著疾病的進展出現(xiàn)的不同亞型的細(xì)胞，稱為腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性[2,3]。近年來，以腫瘤免疫治療為代表的分子靶向治療有了突飛猛進的發(fā)展。而特異性的分子標(biāo)志物被認(rèn)為是免疫治療的核心環(huán)節(jié)[4]。

隨著二代測序技術(shù)的應(yīng)用，對腫瘤不同區(qū)域及時間點來源的樣品進行外顯子測序、染色體變異分析及倍性分析使得人們更好地了解了腫瘤的異質(zhì)性，但由于技術(shù)相對復(fù)雜、對設(shè)備的要求條件高、花費昂貴且用時較長等原因并不能在臨床上得以推廣應(yīng)用。目前一些研究較多的膠質(zhì)瘤分子標(biāo)志物已經(jīng)可以用相對簡單的方法進行檢測，為膠質(zhì)瘤分子標(biāo)志物在臨床的應(yīng)用提供了可能。

1膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性

膠質(zhì)瘤，被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization WHO)分成4級。其中惡性程度最高的為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM glioblastoma multiforme WHOⅣ)，是成人中最常見且侵襲性最強的顱內(nèi)惡性腫瘤，占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的16%，占膠質(zhì)瘤的50%。其預(yù)后差，中位生存期約為15個月，確診后的5年生存率小于5%[5,6]。GBM嚴(yán)重影響患者的生命健康，成為了分子標(biāo)志物診斷和靶向治療的熱點。GBM的分子標(biāo)記物與腫瘤的基本特性及腫瘤的臨床發(fā)展及結(jié)果關(guān)系緊密，可以指導(dǎo)腫瘤的診斷和治療，已經(jīng)逐漸成為神經(jīng)病理診斷的一部分。

美國癌癥基因組圖譜(TCGA)計劃研究小組根據(jù)GBM所發(fā)生的EGFR、TP53、IDH1、PDGFRA和PTEN的改變將GBM分為4種亞型：神經(jīng)元前型(proneural)、經(jīng)典型(cliassical)、間質(zhì)型(mesenchymal)和神經(jīng)原型(neural)[7]。GBM所發(fā)生的異常改變主要涉及到3條信號通路，分別為：RTK/RAS/PI3K、p53及Rb通路[8,9]。一項對于11例膠質(zhì)瘤患者的臨床標(biāo)本進行的研究指出，在同一腫瘤團塊內(nèi)存在著具有不同的標(biāo)志物改變的腫瘤細(xì)胞，即存在不同的分子亞型[10]。另有一項對于GBM的不同區(qū)域(腫瘤實質(zhì)、壞死部位，腫瘤周邊)取材的研究也得出類似的結(jié)果[5]。說明了GBM的瘤內(nèi)部異質(zhì)性的存在，但特定標(biāo)志物的靶向治療(如關(guān)于EGFR的靶向治療藥物埃洛替尼的研究)并未取得期望的療效[11]。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能為，存在其他代替治療靶點(如EGFR)的標(biāo)志物變異，激活了下游的信號通路。并且這些關(guān)于同一通路的變異存在于不同的腫瘤細(xì)胞，在同一腫瘤實體內(nèi)形成不同的亞群[12]。TCGA認(rèn)為來自同一實體GBM中至少含有兩種腫瘤亞型[7]。很多對腫瘤的分子標(biāo)志物異質(zhì)性的研究發(fā)現(xiàn)，一些標(biāo)志物的改變是被所有腫瘤細(xì)胞所共有的，一些變異是一部分細(xì)胞所具有的，而另一些變異是某些細(xì)胞所特有的；共有的變異是發(fā)生在腫瘤發(fā)展過程中的早期事件，而其余的變異則是腫瘤發(fā)展的晚期事件[10]。針對腫瘤分子標(biāo)志物的研究揭示了膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的重要信息。對腫瘤患者進行分子亞型的篩選可使腫瘤的診斷更準(zhǔn)確，治療更合理。

2膠質(zhì)瘤的分子標(biāo)記物

2.1異檸檬酸脫氫酶(IDH)突變異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)包括3個亞型即：IDH1、IDH2、IDH3，在膠質(zhì)瘤中所發(fā)現(xiàn)的突變主要為IDH1，IDH2的突變發(fā)生率較少[13]。野生型的異檸檬酸脫氫酶IDH1/2催化異檸檬酸鹽生成酮戊二酸，并且還原NADP+為NADPH。酮戊二酸和釋放的NADPH都可以保護細(xì)胞免受氧化損傷，具有解毒作用。IDH1存在于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，IDH2存在于線粒體中[14]。

IHD1突變最常見的為132位的精氨酸取代組氨酸(R132H)，IDH2的突變多為172位的精氨酸取代組氨酸(R172H)。這些雜合性突變導(dǎo)致IDH失去催化異檸檬酸鹽氧化羧化形成酮戊二酸的能力，細(xì)胞內(nèi)酮戊二酸及NADPH的含量減少。突變后的IDH獲得了將酮戊二酸轉(zhuǎn)化為2-羥戊二酸(2-HG)的能力，進一步消耗了NADPH。即：IDH突變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NADPH的含量減少，2-HG含量增加。2-HG與腦內(nèi)高水平的活性氧密切相關(guān)，含量增加可促進腫瘤的形成。同時，2-HG可以競爭性抑制調(diào)節(jié)DNA甲基化和組蛋白去甲基化的酶，這將導(dǎo)致CpG島的甲基化[13]。NADPH的含量減少，致使細(xì)胞更易受到氧化損傷。

臨床上，發(fā)生IDH突變的膠質(zhì)瘤患者年齡較輕，II～III級的星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)瘤及繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(由低級別膠質(zhì)瘤進展而來的GBM)中多見[15]。野生型IDH1/2的GBM大都為原發(fā)GBM，具有7號染色體的擴增、10號染色體的缺失及EGFR擴增的特點。突變型IDH1/2的GBM大都為繼發(fā)GBM，不具備上述突變。IDH突變合并1p/19q的共缺失的膠質(zhì)瘤多為少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤[16]。在星形膠質(zhì)瘤中IDH突變往往和TP53突變、MGMT甲基化及PDGFRA的過度表達共存。IDH突變的特征已被應(yīng)用到對膠質(zhì)瘤預(yù)后的判斷[17～19]：具有IDH1/2突變的患者預(yù)后好，生存期長[20～22]。有研究發(fā)現(xiàn)攜帶IDH1突變的患者其生存期(31月)明顯高于未攜帶該突變的患者(15月)，并發(fā)現(xiàn)IDH突變與患者的腫瘤級別呈負(fù)相關(guān)(II級、III級、Ⅳ級表達率分別為：77%、55%、6%)，同時該突變與患者的治療效果呈正相關(guān)[23]。

2.2染色體1p/19q染色體1p/19q共缺失發(fā)生于19號染色體長臂(19q)和1號染色體短臂(1p)上，其常見的缺失區(qū)域為19q13.3和1p的1036.3附近。由1994年Reifenberger等首先發(fā)現(xiàn)[24]。1p/19q共缺失的膠質(zhì)瘤較少發(fā)生于非顳葉，顳葉少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的1p/19q多不發(fā)生突變[25,26]。

1p/19q共缺失與少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤高度相關(guān)，其在II級少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的發(fā)生率約為61%～89%，在III間變型少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中為13%～20%，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和GBM中其發(fā)生率相對較低，分別為7.5%～25%和2.9%～3.7%[27]。因此，1p/19q共缺失被認(rèn)為是少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的病理學(xué)特點。另外，1p/19q共缺失是低級別膠質(zhì)瘤預(yù)后良好和化療敏感的重要指標(biāo)。在間變型少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和II膠質(zhì)瘤當(dāng)中，存在1p/19q共缺失的患者其中位生存期較無共缺失的患者要高(分別為12～15年∶6～7年，5～8年∶2～3年)，存在1p/19q共缺失患者的5年生存率明顯高于無突變者[28,29]。對25名膠質(zhì)瘤患者應(yīng)用TMZ進行化療發(fā)現(xiàn)存在1p/19q共缺失突變的患者反應(yīng)率高于無該突變的患者[88%(8/9);25%(4/16)]，且其無進展生存期的比值為24.5月∶13.7月，總生存期的比值為66.8月∶15.2月，均高于無共缺失的患者[30]。存在該突變的患者腫瘤直徑的增長速度小于無該突變的患者(3.4∶5.9mm/年，P=0.0016)，TMZ化療后復(fù)發(fā)的比例小于無突變的患者(16.6%∶58%，P=0.004)，1p/19q共缺失可能延緩了TMZ耐藥性的產(chǎn)生[31]。

2.3表皮生長因子受體(EGFR)突變表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)為酪氨酸受體家族的一員，其分子量為170KD，其基因定位在7號染色體的短臂上。其與配體結(jié)合后，經(jīng)跨膜部分激活細(xì)胞內(nèi)一系列蛋白分子，并將信號傳導(dǎo)到細(xì)胞核，引起基因的轉(zhuǎn)錄、編碼、細(xì)胞生長繁殖及分化所必需的蛋白質(zhì)，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長及分裂，促進腫瘤的發(fā)展、增殖及血管增生[32,33]。GBM中所發(fā)生的EGFR的變異主要存在于腫瘤細(xì)胞的胞外側(cè)，而其他腫瘤細(xì)胞的EGFR的改變主要在胞漿側(cè)[34]。

約40%的原發(fā)型GBM存在EGFR基因的擴增[35]。此外在GBM還存在EGFR基因外顯子2～7的缺失，這將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的N端丟失267個氨基酸，致使其丟失結(jié)合配體的活性，但可表現(xiàn)為受體的獨立活性。這是由于其酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，可以在缺乏配體的情況下單獨促進細(xì)胞生長。這種由缺失了外顯子的基因所編碼的產(chǎn)物稱為EGFRvIII。EGFRvIII突變的腫瘤細(xì)胞不僅可以促進自身的增殖，而且可以促進其周邊具有正常EGFR表達的細(xì)胞的增殖[36]。大約50%的含有EGFR擴增的GBM同時含有編碼EGFRvIII的突變，這些變異均促進腫瘤的發(fā)展[37]。EGFR的突變除促進腫瘤細(xì)胞的增殖外，還具有對細(xì)胞的損傷進行修復(fù)的功能[38]。有研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Glioma stem cells，GSCs)中也有EGFRvIII的表達，其可以通過MAPK(mitogen-activated protein kinase)信號通路提高JAGGED1的表達水平，而JAGGED1又是NOTCH通路的配體，因此JAGGED1的水平上調(diào)可以激活該通路，NOTCH除了具有促進增殖、影響凋亡的作用外，對維持GSCs的自我修復(fù)和去分化起主要作用，可見EGFR在維持腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性上也起著重要的作用[39]。在GBM中EGFR基因的擴增和突變是不同的生物學(xué)過程，擴增為正常的EGFR表達水平上升，突變是產(chǎn)生不依賴于配體的變異型EGFR，具有獨立促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展的能力。

雖然原發(fā)型GBM與繼發(fā)型GBM在組織學(xué)上難以進行區(qū)分，但由于EGFR的異常改變主要存在于原發(fā)型GBM中，可由此進行分子病理學(xué)的鑒別。在一項針對EGFR水平上調(diào)及EGFRvIII突變對患者生存期的影響研究中，無EGFR改變、存在EGFR水平上調(diào)改變及存在EGFRvIII突變的患者其生存期分別為0.96、0.98和1.07年，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.5)，不能預(yù)示患者預(yù)后差。而在患者生存時間≥1年的患者中無EGFR改變、存在EGFR水平上調(diào)改變及存在EGFRvIII突變的分別為2.03、2.02和1.21年，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.5)，由此可見EGFR以及EGFRvIII突變與患者的生存期呈負(fù)相關(guān)[40]。

2.4O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)啟動子甲基化MGMT(6O-methylguananine-DNA methyltransferase)是一種普遍存在的DNA修復(fù)酶，可以移除DNA鳥嘌呤O6位點的烷基化加合物移除，使其轉(zhuǎn)移到自身的145位的半胱氨酸殘基上，從而能夠保護細(xì)胞對抗烷化劑的損傷。這一過程不需要其他輔助因子參與，同一蛋白既是甲基轉(zhuǎn)移酶，又是甲基受體。同時MGMT也因甲基化而失活，這一過程被稱為自殺性修復(fù)。失活的蛋白從DNA上釋放下來，通過泛素化路徑降解。細(xì)胞對DNA的修復(fù)取決于胞內(nèi)MGMT的含量和合成速度。MGMT的表達與MGMT啟動子區(qū)域CpG島是否甲基化密切相關(guān)。

研究表明約40%的原發(fā)型GBM含有MGMT啟動子甲基化的改變[41，42]。MGMT啟動子甲基化的改變在繼發(fā)型GBM形成的早期階段發(fā)生，并與這個階段發(fā)生的TP53突變關(guān)系緊密[41]。MGMT啟動子甲基化的患者對烷化劑(TMZ，Temozolomide)的敏感性較未甲基化的患者要高。MGMT啟動子甲基化合并IDH1/2突變的膠質(zhì)瘤患者生存將明顯延長[43]。在一項對膠質(zhì)瘤患者進行放療及放療輔助TMZ化療的研究中，應(yīng)用放療結(jié)合TMZ化療時MGMT啟動子突變的患者中位生存期明顯高于無突變者(21.7個月：12.7個月)，而進行單獨放療的患者中突變和無突變者的中位生存期差異不大(15.3個月：11.8個月)[44]。說明MGMT 啟動子甲基化是良好預(yù)后和TMZ敏感性高的標(biāo)志。

2.5人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子突變在細(xì)胞的不斷分裂的過程中，染色體末端的端粒不斷地縮短，從而使細(xì)胞衰老，人的端粒酶可以維持染色體末端端粒的長度，從而使細(xì)胞處于不斷分裂的狀態(tài)，而在大部分腫瘤中均存在維持端粒活性的變異。人端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合物，由人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT,human telomerase reverse transcriptase)、人端粒酶RNA組分(hTR,human telomerase RNA component)以及人端粒酶相關(guān)蛋白(hTEP1,human telomerase-associated protein 1)組成。人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因位于5號染色體短臂的最末端(5p15.33)，為一單拷貝基因，其長度為40kb。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶是端粒酶的催化亞基。TERT啟動子的突變主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始位點上游的124位(C228T)和146位(C250T)，這些突變將增強TERT啟動子(TERT promoter)的活性。有研究表明TERT啟動子的突變將增強端粒酶的表達水平及端粒酶的活性[45]。對膠質(zhì)瘤進行基因分析后發(fā)現(xiàn)，大約70%～80%原發(fā)型GBM和70%的少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤具有TERT啟動子的突變，但TERT啟動子的突變在發(fā)生IDH1/2突變的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和繼發(fā)型GBM中卻少見[46]。在膠質(zhì)瘤的研究中由于hTERT啟動子的突變發(fā)生在疾病進展的早期而備受關(guān)注[46,47]。

目前已在腦腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)TERT的表達預(yù)示著患者的預(yù)后差[48]。含有TERT啟動子突變的GBM患者其總生存期縮短，TERT的表達水平與患者的生存期成負(fù)相關(guān)，與膠質(zhì)瘤的惡性程度成正相關(guān)[49]。TERT啟動子的突變與IDH1及TP53突變呈負(fù)相關(guān)，而與EGFR的擴增呈正相關(guān)[49]。應(yīng)用該突變與膠質(zhì)瘤的其他變異可以對患者的預(yù)后及生存期進行預(yù)測，如在III～IV膠質(zhì)瘤患者中，同時具有IDH與TERT突變的患者中位生存期約為125個月，主要為少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤；單獨具有IDH突變的患者中位生存期約為57個月，主要為星形細(xì)胞瘤；單獨TERT突變的患者中位生存期約為11.5個月，主要為原發(fā)型GBM[17]。

2.6ATRX突變ATRX(alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked)基因所編碼的蛋白為染色質(zhì)重塑蛋白，ATRX蛋白可與DAXX(death-domain associated protein，死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白)所形成復(fù)合體與組蛋白H3.3相互作用聚集染色質(zhì)和端粒[50]。ATRX的突變將導(dǎo)致端粒的不穩(wěn)定，細(xì)胞的無限分裂，且這種無限分裂活性不依賴于端粒酶的改變，被稱為ALT(alternative lengthening of telomeres)[50]。ARTX與TERT啟動子突變的差別在于，前者存在于不具有端粒酶活性的細(xì)胞中，而TERT啟動子的突變則是增強了端粒酶的活性。

在膠質(zhì)瘤當(dāng)中，ATRX突變主要發(fā)生在II、III級星形細(xì)胞瘤，少突星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和繼發(fā)型GBM中。原發(fā)型GBM、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和兒童GBM中較為少見的。與ATRX突變相反，TERT啟動子的改變主要見于原發(fā)型GBM和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中。幾乎所有含有ATRX突變的膠質(zhì)瘤均同時存在IDH突變，同時存在這兩種突變的腫瘤中，大部分又同時具有TP53突變[51]。同時存在IDH和ATRX突變的膠質(zhì)瘤可作為病理診斷星形細(xì)胞瘤的診斷要點[52]。

2.7P53突變P53是一種抑癌基因，基因全長約20kb，位于17號染色體的短臂上，編碼一個分子量為53kD的核內(nèi)磷酸化蛋白，與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA復(fù)制、細(xì)胞分化及凋亡等生物學(xué)功能有關(guān)。P53蛋白可分為3部分：N端為反向激活域；中央為DNA特定結(jié)合域；C端為四聚體化結(jié)構(gòu)域，P53蛋白被激活后形成含有393氨基酸殘基的同源四聚體[53]。P53蛋白主要分布在核漿中，能與DNA特異的結(jié)合，其活性受磷酸化、乙?；?、甲基化、泛素化等翻譯后修飾調(diào)控，正常的P53在G1期檢查DNA損傷點，監(jiān)視基因組的完整性，若存在損傷，P53蛋白則組織DNA復(fù)制，為DNA修復(fù)提供足夠的時間，若修復(fù)失敗，P53蛋白引發(fā)細(xì)胞凋亡，但突變后的P53不僅失去了抑癌的功能，其編碼的蛋白產(chǎn)物mutP53(mutation P53)為一種致癌因子[53,54]，mutP53可以促進腫瘤的發(fā)展，通過抑制wtP53(wild type P53)來增強腫瘤的侵襲性，其可與wtP53發(fā)生聚合，來影響其活性。

P53突變發(fā)生在約50%的彌散性星形細(xì)胞瘤、間變型星形細(xì)胞瘤和繼發(fā)型GBM中，很少見于少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤[55,56]。大多數(shù)IDH1突變的星形細(xì)胞瘤同時具有P53突變。而在不含IDH1/2突變的星形細(xì)胞瘤中卻較少出現(xiàn)P53突變。IDH1/2突變的間變型星形細(xì)胞瘤和GBM中也多含有P53突變[55]。由于該突變主要存在于II、III級星形細(xì)胞瘤，并且較少存在于少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，因此可把P53作為膠質(zhì)瘤診斷分類的一個標(biāo)記物。P53突變的膠質(zhì)瘤患者發(fā)病年齡較大者預(yù)后差，對放化療均有抵抗[57]。

2.8其他分子標(biāo)記物由于GBM中所發(fā)生的生物活性的改變主要涉及P53、Rb及RTK/Ras/PI3K這3條通路。因此除上述研究較成熟的分子改變外，還涉及到許多與這3條通路相關(guān)的分子標(biāo)記物的改變。如涉及P53通路的MDM2/4(Murine Double Minute 2/4)及TP53，與Rb通路相關(guān)的CDK4、CDK6、CDKN2A/B，以及與PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)通路相關(guān)的PIK3R1、PTEN、NF1等的改變。并且這些標(biāo)志物之間也存在著一定的聯(lián)系。更好地了解這些標(biāo)志物變異情況，將有助于研究GBM的發(fā)生、發(fā)展及發(fā)現(xiàn)更有效的治療方法。

3展望

目前還沒有任何一種分子標(biāo)志物可以涵蓋所有的膠質(zhì)瘤。綜合分析多種分子標(biāo)志，可更好地了解膠質(zhì)瘤的生物特性，將膠質(zhì)瘤分為不同的亞型，指導(dǎo)臨床的治療及預(yù)后的判斷。但由于異質(zhì)性的存在，隨著腫瘤的發(fā)展，單次活檢已不能適時地反應(yīng)腫瘤的情況。如何準(zhǔn)確全面地進行病理檢測已成為目前膠質(zhì)瘤診斷及治療的首要問題。單一部位的病理取材并不能完全地表現(xiàn)腫瘤的異質(zhì)性。針對腦膠質(zhì)瘤，尤其是不適于手術(shù)的膠質(zhì)瘤患者，進行多點取材可增加膠質(zhì)瘤診斷的全面性，是研究的重要方向之一。

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(王一伊編輯)