張靜怡，吳文惠，王南平，何 蘭，Elango JEEVITHAN，包 斌,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 2013 06；3.上海市水產(chǎn)研究所，上海 200433）

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羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白 的抗原反應(yīng)特性分析

張靜怡1，吳文惠2，王南平3，何 蘭3，Elango JEEVITHAN1，包 斌1,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 2013 06；3.上海市水產(chǎn)研究所，上海 200433）

摘 要：目的：確定羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的抗原性，為進(jìn)一步研究羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白生物相容性提供依據(jù)。方法：采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對分離提取的羅非魚皮膠原蛋白進(jìn)行鑒定，共免疫ICR小鼠3 次。采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）分別于每次免疫后第7天測定小鼠產(chǎn)生的總膠原蛋白抗體，并在第21天測定小鼠血清中內(nèi)免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白M（IgM）的含量。結(jié)果：羅非魚皮膠原蛋白樣品是Ⅰ型膠原蛋白。所有經(jīng)羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫的小鼠體內(nèi)均產(chǎn)生抗體，3 次免疫后羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白抗體質(zhì)量濃度范圍為160.50～164.25 μg/L，小鼠IgG、IgA和IgM的質(zhì)量濃度范圍分別為424.81～437.59 ng/mL、46.86～49.53 μg/mL、1.81～1.89 ng/mL。結(jié)論：羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白對ICR小鼠呈現(xiàn)較弱的抗原性。

關(guān)鍵詞：膠原蛋白；免疫；酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)；抗原性

膠原蛋白作為哺乳動物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占體內(nèi)蛋白總量的25%～33%，并且在組成細(xì)胞間質(zhì)過程中起重要作用[1-2]。膠原蛋白廣泛存在于動物的皮、骨、軟骨、牙齒、肌腱、韌帶和血管中，具有支撐器官、保護(hù)機體的重要作用[3]。膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)，由2 條α1多肽鏈和1 條α2多肽鏈組成，3 條α肽鏈交互纏繞形成了繩索狀的超螺旋結(jié)構(gòu)[4]。每一條膠原鏈都是左手螺旋構(gòu)型，3 條左手螺旋鏈相互纏繞成右手螺旋結(jié)構(gòu)，形成膠原蛋白獨特的三重螺旋結(jié)構(gòu)，使其分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定[5]。膠原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性和生物活性[6]。因此，膠原蛋白在食品、醫(yī)藥、組織工程、化妝品等領(lǐng)域獲得廣泛的關(guān)注，膠原蛋白的生產(chǎn)與開發(fā)具有很好的前景[7]。

長期以來，人們都是使用豬、牛的皮和骨提取膠原蛋白和明膠。但瘋牛病、口蹄疫等疾病的爆發(fā)，對牲畜膠原制品的安全性產(chǎn)生了影響[8-10]。另外，有些地區(qū)由于其他人文原因不能使用牲畜膠原蛋白制品。由此，魚類膠原蛋白逐漸成為了研究熱點[11]。我國水產(chǎn)資源豐富，魚類膠原蛋白屬天然生物再生資源，可以作為一種新型的生物醫(yī)學(xué)材料廣泛應(yīng)用[6,12-13]。與陸生動物膠原蛋白相比，魚類膠原蛋白具有許多獨特優(yōu)勢。而羅非魚是一種分布廣泛、產(chǎn)量較高的魚類品種，被認(rèn)為是未來動物性蛋白的主要來源之一，近年來逐步受到重視。

然而，魚類膠原蛋白的安全性仍然是關(guān)鍵問題?？贵w是在宿主對抗原刺激的免疫應(yīng)答過程中，由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類能夠特異性識別 并中和相應(yīng)抗原的具有免疫功能的球蛋白?？乖允强?原刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力?？乖宰鳛樯锊牧习踩缘年P(guān)鍵因素，其強弱與抗原分子的大小、化學(xué)成分、抗原決定簇的結(jié)構(gòu)、抗原與被免疫動物親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近等有密切關(guān)系。膠原蛋白的分子質(zhì)量較大，在應(yīng)用于生物材料過程中可能會產(chǎn)生抗原性問題。膠原蛋白對于宿主是異物，在體內(nèi)必定會產(chǎn)生某種應(yīng)答或出現(xiàn)排異現(xiàn)象[14-15]。如果要成功植入膠原蛋白，至少要使發(fā)生的免疫反應(yīng)被宿主接受，不產(chǎn)生有害作用。而被免疫的動物會通過特異 性和非特異性的免疫防御機制來維持機體的正常功能及自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。因此，進(jìn)行羅非 魚皮Ⅰ型膠原蛋白抗原性的檢測是十分必要的。通過測定被免疫動物血清中的抗體含量，評價其免疫狀況，對判斷羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白生物相容性具有重要意義。

Song等[16]為了研究水母膠原蛋白是否會產(chǎn)生類似牛膠原蛋白或明膠引起的炎癥反應(yīng)，進(jìn)行了體內(nèi)植入實驗，測定了促炎細(xì)胞因子和抗體分泌物的表達(dá)并檢測了免疫細(xì)胞的數(shù)量變化情況。結(jié)果顯示水母膠原蛋白可以引起與牛膠原蛋白和明膠類似的免疫反應(yīng)。本實驗以ICR小鼠作為動物模型，采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)分析測定羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體的特性及其相關(guān)指標(biāo)的變化特點[17]，從而確定羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的抗原性強弱，以便為該種膠原蛋白材料在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1動物、材料與試劑

SPF級ICR雌性小鼠，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2008-0016。小鼠飼養(yǎng)在相對濕度60%～70%、溫度20～25 ℃、自然晝夜溫差的環(huán)境內(nèi)，每日定時飼喂常規(guī)飼料，每日更換墊料。

羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白由上海水產(chǎn)研究所提供。所有提?、裥湍z原蛋白的實驗操作均在4 ℃條件下進(jìn)行。羅非魚魚皮經(jīng)浸提、離心、透析和冷凍干燥等步驟獲得干燥的羅非魚酶溶性膠原蛋白（tilapia pepsin soluble collagen，TPSC）。

三羥甲基氨基甲烷（t r i s h y d r o x y m e t h y l aminomethane，Tris）（分析純） 瑞典LKB公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、過硫酸銨（ammonium persulphate，AP）、甘氨酸、四甲基乙二胺、氯化鋁、氫氧化鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)R250 上海標(biāo)本模型廠；小鼠抗Ⅰ型膠原蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）試劑盒、小鼠免疫球蛋白G （immunoglobulin G，IgG）ELISA試劑盒、IgA ELISA試劑盒、IgM ELISA試劑盒 上海撫生實業(yè)有限公司；0.25 μm孔徑親水PTFE針式濾器 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

DYY-2c型電泳儀 北京六一儀器廠；SH-1000型酶標(biāo)儀 上海天美儀器有限公司；CR21G型高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；電泳凝膠成像分體系統(tǒng) 美國UVP公司。

1.3方法

1.3.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（sodium dodecyl su lfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析

采用SDS-PAGE測定羅非魚皮膠原蛋白分子質(zhì)量，主要參照Laemmli[18]的方法進(jìn)行。濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%，250 V電壓電泳約1 h至終點。固定液固定1 h，考馬斯亮藍(lán)R250染色0.5 h，脫色過夜，凝膠成像系統(tǒng)分析成像。

1.3.2 免疫材料的制備

取44 mL 0.6 mol/L氯化鋁溶液加熱至60 ℃，再取42 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液加熱至60 ℃，在60 ℃水浴鍋中將氫氧化鈉溶液緩慢加入氯化鋁溶液中，不斷攪拌1 h。用氫氧化鈉溶液調(diào)整混合液的pH值達(dá)7.0時為終點，再繼續(xù)攪拌10 min，配制得到的氫氧化鋁溶膠佐劑裝入瓶內(nèi)，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，室溫保存[19-20]。

取羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白0.012 5 g，加入0.1 mol/L乙酸100 mL。注射前經(jīng)0.25 μm孔徑親水PTFE針式濾器過濾，作為抗原樣品。

蝦類是人類優(yōu)質(zhì)的食用蛋白資源之一，也是公認(rèn)的易引起過敏的食物之一。蝦蛋白作為一種異體蛋白進(jìn)入體內(nèi)時，機體易產(chǎn)生免疫反應(yīng)將其中和及消滅掉。因此本實驗中選用蝦蛋白作為陽性對照[21]。選取10 g斑節(jié)對蝦的肌肉在研缽中勻漿，加入0.1 mol/L乙酸100 mL，4 ℃浸提16 h后10 000 r/min、4 ℃離心20 min取上清液，即為蝦總蛋白提取液[22]。經(jīng)0.25 μm孔徑親水PTFE針式濾器過濾后，蝦總蛋白提取液與氫氧化鋁溶膠佐劑等體積混勻[19-20]，作為陽性對照抗原。

1.3.3 動物分組及免疫

取30 只體質(zhì)量為20 g左右的雌性ICR小鼠，腹腔注射羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白溶液，進(jìn)行劑量篩選預(yù)實驗。結(jié)果表明0.1 mL/d為最佳劑量，因此采用該劑量進(jìn)行后續(xù)實驗。

30 只雌性ICR小鼠隨機分為6 組，每組5只：低劑量處理組、中劑量處理組、高劑量處理組、對照組、膠原蛋白陽性對照組和蝦蛋白陽性對照組，注射量為0.1 mL。各劑量處理組小鼠分別注射羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白5、50、500 μg/kg（以體質(zhì)量計，下同）；對照組小鼠注射0.1 mol/L乙酸；膠原蛋白陽性對照組和蝦蛋白陽性對照組用氫氧化鋁溶膠佐劑0.05 mL分別與羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白及蝦蛋白0.05 mL混合，注入小鼠體內(nèi)，以便更有效地刺激免疫系統(tǒng)，增大免疫應(yīng)答效應(yīng)[23]。

每隔一周腹腔注射一次，共注射3 次。期間觀察小鼠注射后的癥狀，每次注射后7 d眼眶取血，抗凝條件為檸檬酸鈉3.8%、生理鹽水0.85%。5 000 r/min離心5 min取上清液，－20 ℃貯存?zhèn)溆?。提取血清進(jìn)行ELISA分析。

1.3.4 抗體含量檢測方法

分別于每次免疫后7 d取血，采用小鼠抗羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白抗體ELISA試劑盒，利用具有高靈敏度競爭性ELISA的替代工具雙抗原夾心法，測定小鼠血清中Ⅰ型膠原蛋白抗體（collagen type I antibody，COL-Ⅰ Ab）水平[24]。在已包被的酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)孔準(zhǔn)確加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL。37 ℃溫育30 min后棄去液體，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5 次。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL（空白孔除外），37 ℃溫育30 min，同上洗滌。經(jīng)過徹底洗滌后加底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色，37 ℃避光顯色10 min，TMB在辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色。每孔加終止液50 μL終止反應(yīng)，TMB在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中Ⅰ型膠原蛋白抗體（COL-Ⅰ Ab）含量呈正相關(guān)。以空白孔調(diào)零，在4 50 nm波長處測定每組小鼠抗體的絕對吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計算小鼠Ⅰ型膠原蛋白抗體含量[25]。

2　結(jié)果與分析

2.1SDS-PAGE結(jié)果分析

圖1　羅非魚皮膠原蛋白樣品SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of tilapia skin collagen

如圖1所示，羅非魚皮膠原蛋白含兩條α鏈和它們的聚合鏈β，所得條帶與陳申如等[26-27]的研究結(jié)果相似。與Nagai等[28]對3 種魚皮膠原蛋 白的研究結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，所提取的羅非魚皮膠原蛋白是Ⅰ型膠原蛋白成分。兩條α肽鏈分子質(zhì)量約為130 kD，β肽鏈分子質(zhì)量約為116 kD[29]。由3 條α鏈所組成的未變性膠原蛋白分子質(zhì)量為300 kD，所以β肽鏈可能是α肽鏈通過架橋結(jié)合所形成的成分[26]。進(jìn)行SDS-PAGE時，對加了巰基乙醇和未加巰基乙醇的樣品進(jìn)行對照（結(jié)果未給出），電泳結(jié)果沒有區(qū)別，推測羅非魚皮膠原蛋白樣 品中沒有包含二硫鍵。

2.2羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的抗原免疫原性測定結(jié)果

圖2　羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫小鼠的抗體質(zhì)量濃度Fig.2 Antibody concentrations against tilapia skin type I collagen in mice

在以羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白為抗原的免疫實驗中，所有的小鼠體內(nèi)均產(chǎn)生抗體。如圖2所示，前兩次免疫分析結(jié)果顯示，處理組間比較，中劑量處理組的抗體質(zhì)量濃度最高，其次為高劑量處理組，最低為低劑量處理組。第3次免疫后高劑量處理組的抗體質(zhì)量濃度最高，其次為低劑量處理組，最低為中劑量處理組。對比膠原蛋白陽性對照組和蝦蛋白陽性對照組的抗體質(zhì)量濃度可以發(fā)現(xiàn)，前兩次免疫后膠原蛋白陽性對照組產(chǎn)生的抗體質(zhì)量濃度要高于蝦蛋白陽性對照組，這表明小鼠在接受注射后14 d內(nèi)對羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的免疫強度較蝦蛋白強。21 d后這種差異性變得不再明顯，這可能是因為21 d后小 鼠對膠原蛋白產(chǎn)生了免疫適應(yīng)性，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)接受膠原蛋白的刺激能力變?nèi)醪⑹姑庖哐h(huán)趨于穩(wěn)定變化。第3次免疫后所有注射組的抗體質(zhì)量濃度均降低到最低值，維持在160～163 μg/L的水平。其中，中劑量處理組在第3次免疫后抗體質(zhì)量濃度明顯降低。

由以上結(jié)果可以看出，50 μg/kg的羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白注射量會在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較高的抗體質(zhì)量濃度。5 μg/kg的注射量在前7 d時產(chǎn)生的抗體質(zhì)量濃度較低，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），與蝦蛋白陽性對照組相比差異顯著（P＜0.05）。羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白首次免疫小鼠產(chǎn)生的抗體量較少，第2次免疫后產(chǎn)生抗體質(zhì)量濃度有所升高，至第3次免疫產(chǎn)生的抗體質(zhì)量濃度又顯著降低。這表明低劑量的羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白是一種低抗原性的蛋白質(zhì)。隨著免疫次數(shù)的增加，免疫反應(yīng)強度進(jìn)一步降低。原因可能是持續(xù)的免疫反應(yīng)使小鼠適應(yīng)羅非魚皮膠原蛋白的能力得到提升，從而使羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫刺激能力下降。該結(jié)果與何創(chuàng)龍等[30]的研究結(jié)果相似：運用ELISA間接法檢測植入一種骨膠原材料后兔血清的抗體含量，確定該材料的抗原特性從而得出該材料可引起較低的免疫反應(yīng)。以上結(jié)果表明，羅非魚皮膠原Ⅰ型蛋白可以作為一種蛋白質(zhì)材料在一定時間內(nèi)存在于生物體內(nèi)而不發(fā)生嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。

2.3羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的IgG、IgA、IgM含量

表1　羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫小鼠的IgG、IgA、IgM質(zhì)量濃度Table 1 IgG, IgA and IgM concentrations in tilapia skin type Ⅰcollagen-immunized mice

3 次免疫反應(yīng)后對小鼠體內(nèi)的IgG、IgA、IgM含量進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析法測定。由表 1可知，中劑量處理組的IgG質(zhì)量濃度顯著高于蝦蛋白陽性對照組（P＜0.05），低、高劑量處理組和對照組在小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）。這說明中劑量的羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白可以刺激小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高質(zhì)量濃度的IgG。其原因可能是低劑量條件下膠原蛋白活潑基團(tuán)的暴露量較少，IgG在蛋白分子上的吸附量較低，致免作用較弱。當(dāng)膠原蛋白劑量逐漸增大時，伴隨著膠原蛋白活潑羥基群含量的提升，補體活化作用顯著增強，并刺激小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生大量的IgG。而高劑量的膠原蛋白抗原含量較高，會較快地與新產(chǎn)生的IgG免疫球蛋白結(jié)合并被吞噬細(xì)胞吞噬，從而造成IgG檢測量偏低。對比處理組和陽性對照組，中劑量處理組羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白產(chǎn)生的IgG質(zhì)量濃度要高于同劑量添加佐劑的蝦蛋白陽性對照組，這表明羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白在小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)強于蝦蛋白粗提取液。添加佐劑的羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白（膠原蛋白陽性對照組）產(chǎn)生的IgG質(zhì)量濃度最高，這表明佐劑的存在會增強IgG的質(zhì)量濃度水平從而產(chǎn)生更有效的保護(hù)性免疫。在IgA質(zhì)量濃度測定中，羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白各劑量處理組的IgA質(zhì)量濃度測定結(jié)果與IgG相似，高劑量處理組的IgA質(zhì)量濃度極顯著低于膠原蛋白陽性對照組（P＜0.01）。中劑量處理組的IgA質(zhì)量濃度高于高、低劑量處理組。這種情況在IgM的測定結(jié)果中更為明顯。膠原蛋白陽性對照組IgM質(zhì)量濃度低于蝦蛋白陽性對照組，這表明羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白對IgM產(chǎn)生的影響小于斑節(jié)對蝦蝦蛋白。

作為體液免疫系統(tǒng)中重要的免疫效應(yīng)分子，免疫球蛋白IgG、IgA和IgM在生物體內(nèi)的含量可以直接體現(xiàn)免疫反應(yīng)的發(fā)生情況[31-32]。侯小萍等[33]研究了Ⅲ型豬膠原蛋白膜免疫實驗兔后IgG、IgM和IgA抗體含量，從而確定其免疫特性，作為鑒定該材料是否可以用于鼓膜移植材料的一個依據(jù)。孫澤威等[34]也用類似方法對犢牛血清中大豆抗原特異性抗體IgG的含量進(jìn)行了ELISA檢測。IgG是體液免疫最重要的一個生物反應(yīng)指標(biāo)，它是血清主要的抗體成分，約占血清免疫球蛋白含量的75%。其主要功能是在機體免疫中起保護(hù)作用，如抗菌、抗病毒，應(yīng)對麻疹、甲型肝炎等，能有效地預(yù)防相應(yīng)的感染性疾病。本實驗中羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白引起小鼠體內(nèi)IgG的變化進(jìn)一步驗證了羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白具有一定的抗原性[29]。IgA在正常人血清中的含量僅次于IgG，占血清免疫球蛋白含量的10%～20%，也常與其他免疫球蛋白抗體一起作為抗原反應(yīng)特性的依據(jù)。血清檢出IgM 提示新近發(fā)生感染，可用于早期感染的診斷依據(jù)，因此本實驗也對其進(jìn)行了測定[32]。膠原蛋白陽性對照組的IgA質(zhì)量濃度高于蝦蛋白陽性對照組，表明羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的抗原性強于斑節(jié)對蝦蛋白。并且小鼠體內(nèi)初次遭遇蛋白質(zhì)抗原后最早回應(yīng)出現(xiàn)的循環(huán)抗體為IgM， 但I(xiàn)gM在血液中的含量會因清除作用而迅速下降。因此羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白IgM質(zhì)量濃度較斑節(jié)對蝦蛋白低，也證明其抗原性高于后者，應(yīng)作進(jìn)一步的檢測以確定其影響強度。

3　結(jié) 論

本實驗中羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白在SDS-PAGE圖中顯示由α鏈和β鏈構(gòu)成。羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫穩(wěn)定后ICR小鼠產(chǎn)生的Ⅰ型膠原蛋白抗體質(zhì)量濃度范圍為160.50～164.25 μg/L，不同劑量處理組間顯示出較小的差別，僅為2%，該結(jié)果也顯示出羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的低抗原性。用不同劑量的羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫ICR小鼠后，IgG、IgA、IgM作為特征性免疫球蛋白，在各劑量處理組之間差異不大，其質(zhì)量濃度范圍分別是424.81～437.59 ng/mL、46.86～49.53 μg/mL、1.81～1.89 ng/mL。IgG、IgA、IgM的檢測結(jié)果也顯示羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的低抗原性。與Song等[16]的研究結(jié)果比較，羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白和水母膠原蛋 白同樣可以引起較弱的免疫反應(yīng)，可知結(jié)果的有效性。羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白低抗原性的結(jié)論暗示羅非魚Ⅰ型膠原蛋白作為食品的安全性及其作為生物材料的可能性。

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Antigen Response Properties of Tilapia Skin Type I Collagen

ZHANG Jingyi1, WU Wenhui2, WANG Nanping3, HE Lan3, Elango JEEVITHAN1, BAO Bin1,*
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation, Shanghai 201306, China; 3. Shanghai Fisheries Research Institute, Shanghai 200433, China)

Abstract:Objective: To investigate the antigenicity of type I collagen isolated from tilapia skin and evaluate its biocompatibility. Methods: The purity of tilapia skin collagen was confirmed by SDS-PAGE, and the antigenicity was evaluated by measuring the changes in serum IgG, IgA and IgM induced by tilapia skin type I collagen in ICR mouse model using ELISA. Results: The tilapia skin type I collagen was pure. The antibody concentrations of tilapia skin collagenimmunized mice were 160.50–164.25 μg/L, and the concentrations of IgG, IgA and IgM were 424.81–437.59 ng/mL, 46.86–49.53 μg/mL and 1.81–1.89 ng/mL, respectively. Conclusion: Tilapia skin type I collagen has weak antigenicity responsitivty and proved to have superior biocompatibility for biomedical applications.

Key words:collagen; immunization; enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA); antigenicity

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507015

中圖分類號：TS201.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0079-05

*通信作者：包斌（1965—），女，副教授，碩士，研究方向為海洋天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：bbao@shou.edu.cn

作者簡介：張靜怡（1988—），女，碩士研究生，研究方向為海洋藥物。E-mail：zhangjyj@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金委員會主任基金項目（81341082）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA09070109）

收稿日期：2014-05-06