張佰清，孫欄夢(mèng)

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

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脈沖強(qiáng)光對(duì)啤酒酵母的誘變效應(yīng)

張佰清，孫欄夢(mèng)

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

摘 要：采用脈沖強(qiáng)光對(duì)啤酒酵母菌種進(jìn)行誘變處理，脈沖處理電壓分別為1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 V，閃照次數(shù)分別為4、8、16、32、48。測(cè)定出發(fā)菌株和篩選出的變異菌株的凝聚性、雙乙酰產(chǎn)量、發(fā)酵速率、發(fā)酵結(jié)束理化性質(zhì)等指標(biāo)，比較變異菌株與出發(fā)菌株綜合指標(biāo)的差異。結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，篩選出10#和12#兩株發(fā)酵性能較好的菌株。脈沖強(qiáng)光誘變處理并未對(duì)啤酒酵母的發(fā)酵度產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，而是有所提高或保持原酵母菌株的優(yōu)良發(fā)酵性能。

關(guān)鍵詞：脈沖強(qiáng)光；啤酒酵母；誘變；變異菌株；出發(fā)菌株

脈沖強(qiáng)光誘變裝置是以交流電為電源，采用強(qiáng)光閃照的方法進(jìn)行微生物誘變，它由一個(gè)動(dòng)力單元和一個(gè)惰性氣體燈單元組成[1-4]。脈沖強(qiáng)光對(duì)微生物有多種影響，脈沖強(qiáng)光寬譜的光能產(chǎn)生全面的、不可逆的破壞作用，使得菌體細(xì)胞中的DNA、細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和其他大分子受到影響[5]。由于脈沖強(qiáng)光對(duì)微生物的核糖結(jié)構(gòu)有影響，就有可能對(duì)微生物發(fā)生誘導(dǎo)產(chǎn)生突變。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于脈沖強(qiáng)光致死微生物的效果及機(jī)理研究較多。國(guó)內(nèi)研制出了自動(dòng)控制脈沖強(qiáng)光殺菌裝置，對(duì)釀酒酵母、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行了不同照射時(shí)間的研究，得出影響脈沖強(qiáng)光殺菌效果的主要因素是閃照次數(shù)、菌液原始濃度及輸入電壓，其中閃照次數(shù)的影響最大[6-7]。國(guó)外，Macgregor等[8]研究了大腸桿菌Escherichia coli O157:H7和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes 4b在脈沖強(qiáng)光照射下的存活情況。Wekhof等[9-11]研究了脈沖強(qiáng)光對(duì)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis芽孢和黑曲霉菌Aspergillus niger孢子的殺滅效果，發(fā)現(xiàn)不用UV-C波段脈沖強(qiáng)光也可以達(dá)到殺菌的效果。還有研究者發(fā)現(xiàn)脈沖強(qiáng)光能夠引起菌體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄漏并且使照射酵母的細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，脈沖強(qiáng)光和紫外光使菌體細(xì)胞受損傷的程度是不同的，脈沖強(qiáng)光照射對(duì)細(xì)胞膜的影響較大[12-16]。

本實(shí)驗(yàn)利用脈沖強(qiáng)光技術(shù)對(duì)啤酒酵母進(jìn)行誘變，比較啤酒酵母出發(fā)菌株和變異菌株之間基本發(fā)酵性能的差異，為脈沖強(qiáng)光技術(shù)在提高啤酒酵母發(fā)酵性能中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

啤酒酵母菌株，由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

麥芽汁培養(yǎng)基：采用實(shí)驗(yàn)室自制麥芽汁培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌處理，調(diào)糖度為8～10 °Bx，自然pH值。固體麥芽汁培養(yǎng)基：在麥芽汁培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂，0.1 MPa滅菌20 min；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[17]方法配制。

1.2儀器與設(shè)備

TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；生物顯微鏡 上海光電公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；pHs-3C型酸度計(jì) 上海盛磁儀器有限公司；滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；SZX-ZP超凈工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

脈沖強(qiáng)光裝置由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院自行設(shè)計(jì)[18]，采用氙燈發(fā)出脈沖強(qiáng)光。光脈沖的脈沖寬度為20 μs，波長(zhǎng)范圍為200～1 100 nm，最大輸出電壓為5 000 V，最大輸入能量為644 J。

1.3方法

1.3.1 啤酒酵母生長(zhǎng)曲線的繪制

采用比濁法，即測(cè)定菌液在600 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD600 nm）值來(lái)確定菌種數(shù)，繪制啤酒酵母生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 菌懸液的制備

取實(shí)驗(yàn)中心斜面保存的啤酒酵母菌1 環(huán)接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量轉(zhuǎn)接于另外的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)8 h，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增殖中期，離心分離，將沉淀下來(lái)的菌體用生理鹽水洗滌兩次，懸浮于適量的生理鹽水中，制成細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL的菌懸液。

1.3.3 脈沖強(qiáng)光處理與誘變處理?xiàng)l件的確定

在滅菌后的培養(yǎng)皿中加入10 mL實(shí)驗(yàn)菌懸液，取下培養(yǎng)皿蓋，放入殺菌處理室內(nèi)，保證培養(yǎng)皿在氙燈的正下方。在脈沖強(qiáng)光閃照8 次、菌液厚度3.4 mm、菌液透光率100%、菌液濃度一定的條件下，分別考察輸入電壓為500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 V時(shí)對(duì)菌體致死率的影響；以及在輸入電壓1 500 V、菌液厚度3.4 mm、菌液透光率100%、菌液濃度一定的條件下，分別考察脈沖強(qiáng)光閃照4、8、16、32、48 次時(shí)對(duì)菌體致死率的影響[19]。

1.3.4 菌株初篩

一般認(rèn)為可遺傳穩(wěn)定變異最可能出現(xiàn)在致死率90%以上的區(qū)域內(nèi)[20]。由此，對(duì)脈沖強(qiáng)光處理后從第1代到第5代致死率都在90%以上的菌株，挑取菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和邊緣整齊的菌落12 株，接種至斜面固體YPD培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.5 菌株復(fù)篩

供復(fù)篩的菌株于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃培養(yǎng)24 h，再保藏于冷藏室內(nèi)，待用于耐受性實(shí)驗(yàn)，并以此作為復(fù)篩的標(biāo)準(zhǔn)[21-23]。

1.3.6 分析測(cè)定方法

菌株凝聚性的測(cè)定采用光密度法[24]；雙乙酰產(chǎn)量的測(cè)定采用分光光度法[25]；酒精度的測(cè)定采用比重瓶法；發(fā)酵度的測(cè)定參照文獻(xiàn)[26]的方法進(jìn)行；發(fā)酵速率的測(cè)定參照文獻(xiàn)[23]的方法進(jìn)行。

2　結(jié)果與分析

2.1啤酒酵母出發(fā)菌株的生長(zhǎng)曲線

圖1　啤酒酵母出發(fā)菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of S. cerevisiae

由圖1可知，啤酒酵母菌株的遲滯期為6 h（0～6 h），對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為12 h（6～18 h），隨后開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期。因此在研究脈沖強(qiáng)光對(duì)啤酒酵母生理特性的影響和啤酒酵母對(duì)脈沖強(qiáng)光的抗性時(shí)，選擇在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至10～17 h的菌體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在研究脈沖強(qiáng)光對(duì)啤酒酵母的致死機(jī)理時(shí)，選擇同步培養(yǎng)至18 h的菌體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2脈沖強(qiáng)光處理菌株的致死率曲線

在脈沖強(qiáng)光閃照8 次、菌液厚度3.4 mm、菌液透光率100%、菌液濃度一定的條件下，分別考察輸入電壓為500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 V時(shí)對(duì)菌體致死率的影響。

圖2　不同電壓條件下的菌體致死率Fig.2 Mortality of S. cerevisiae at different voltages

如圖2所示，隨著輸入電壓的增加，對(duì)菌體的致死率快速上升。在輸入電壓增加至1 500 V后對(duì)菌體的致死率上升速率開(kāi)始減緩。在輸入電壓為1 500 V時(shí)，對(duì)菌體的致死率達(dá)到了87%；當(dāng)輸入電壓為2 500 V時(shí)，對(duì)菌體的致死率達(dá)到了98%以上。

在輸入電壓1 500 V、菌液厚度3.4 mm、菌液透光率100%、菌液濃度一定的條件下，分別考察脈沖強(qiáng)光閃照4、8、16、32、48 次時(shí)對(duì)菌體致死率的影響。

如圖3所示，隨著閃照次數(shù)增加，對(duì)菌體的致死率逐漸增加。在閃照次數(shù)為8時(shí)，對(duì)菌體的致死率達(dá)到了89%；當(dāng)閃照次數(shù)為32時(shí)，對(duì)菌體的致死率為99.8%，菌體幾乎全部死亡。

為研究脈沖強(qiáng)光對(duì)啤酒酵母菌是否具有誘變作用，根據(jù)以上結(jié)果來(lái)確定抗性篩選的脈沖處理?xiàng)l件，篩選具有一定耐受性的菌株。

圖3　不同閃照次數(shù)條件下的菌體致死率Fig.3 Mortality of S. cerevisiae with different pulsed light cycles

2.3初篩結(jié)果

表1　啤酒酵母菌對(duì)脈沖強(qiáng)光的抗性Table 1 Mortality of S. cerevisiae treated by pulsed lightt

由表1可知，選擇不同強(qiáng)度脈沖強(qiáng)光對(duì)啤酒酵母菌作用后，選取存活的啤酒酵母菌種進(jìn)行斜面試管接種，重復(fù)刺激5 代后，脈沖條件為2 000 V/16 次和2 500 V/32 次的啤酒酵母菌的致死率有所下降。當(dāng)處理強(qiáng)度達(dá)到3 000 V/48 次時(shí)，第5 代啤酒酵母的致死率為99.80%，此時(shí)第1～5代的致死率均達(dá)到95%以上。說(shuō)明隨這處理強(qiáng)度的提高，致死作用加強(qiáng)，因此菌株在低處理強(qiáng)度時(shí)表現(xiàn)出抗性，而在高處理強(qiáng)度時(shí)表現(xiàn)為大量死亡。對(duì)脈沖條件為2 000 V/16 次和2 500 V/32 次下第5代存活的啤酒酵母菌種進(jìn)行篩選得到12 株菌株（編號(hào)為1#～12#），并接種到斜面試管中保存，用于研究其耐滲性和發(fā)酵性能是否發(fā)生變化。

2.4復(fù)篩結(jié)果

2.4.1 不同殺滅溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

表2　不同殺滅溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of temperature on the growth of original and variant S. cerevisiae strains

由表2可知，出發(fā)菌株、1#、2#和3#菌株的殺滅溫度為54 ℃，4#、5#、6#、8#和9#菌株的殺滅溫度為56 ℃，而7#、10#、11#和12#菌株在56 ℃時(shí)仍然可以存活，因此選擇7#、10#、11#和12#菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 菌株耐糖性與耐酒精性

對(duì)7#、10#、11#和12#菌株進(jìn)行耐糖性與耐酒精性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表3　不同葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下各菌株產(chǎn)氣結(jié)果Table 3 Gas production by original and variantS. cerevisiae strains at different glucose concentrations

每隔24 h觀察試管產(chǎn)氣情況，結(jié)果見(jiàn)表3。在葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的條件下培養(yǎng)72 h后，所有菌株均產(chǎn)氣；而在葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的條件下培養(yǎng)72 h后，只有10#和12#菌株產(chǎn)氣，而出發(fā)菌株不能耐受此條件下的滲透壓。

表4　不同酒精度條件下各菌株產(chǎn)氣情況Table 4 Gas production by original and variantS. cerevisiae strains at different alcohol concentrations

由表4可知，出發(fā)菌株在酒精度為10%時(shí)就已經(jīng)不產(chǎn)氣，10#和12#菌株在酒精度為16%時(shí)依然產(chǎn)氣。與出發(fā)菌株相比，10#和12#菌株的耐酒精性更強(qiáng)。

由以上結(jié)果可知，脈沖強(qiáng)光可以篩選出具有高耐糖性與耐酒精性的變異菌株10#和12#，用這兩株菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5出發(fā)菌株和變異菌株凝聚性比較結(jié)果

圖4　出發(fā)菌株和變異菌株凝聚性的比較Fig.4 Comparison of flocculation ability between variant and original strains

由圖4可知，10#菌株的凝聚性較強(qiáng)，也相對(duì)適中，對(duì)照菌株和12#菌株的凝聚性相差不多。這說(shuō)明10#菌株在發(fā)酵結(jié)束時(shí)沉淀速率較快，發(fā)酵液澄清速率也快。對(duì)照菌株和12#菌株發(fā)酵結(jié)束時(shí)沉淀速率慢，發(fā)酵液也不易澄清。

2.6出發(fā)菌株和變異菌株雙乙酰產(chǎn)量比較

雙乙酰是由丙酮酸形成的，雙乙酰及其相關(guān)產(chǎn)物都是酵母酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物，其產(chǎn)量甚微，但對(duì)酒的風(fēng)味形成有很大的影響，是評(píng)價(jià)啤酒成熟與否的主要依據(jù)，其含量多少直接影響啤酒的品質(zhì)。當(dāng)啤酒中雙乙酰含量超過(guò)風(fēng)味閾值時(shí)，會(huì)有一種不愉快的飯餿味。

圖5　出發(fā)菌株和變異菌株雙乙酰產(chǎn)量在發(fā)酵過(guò)程中的變化Fig.5 Change in diacetyl concentration during yeast fermentation

由圖5可知，對(duì)照菌株的雙乙酰產(chǎn)量在發(fā)酵第1天出現(xiàn)峰值，達(dá)到0.364 mg/L，10#、12#菌株的雙乙酰產(chǎn)量均在發(fā)酵第3天出現(xiàn)峰值，達(dá)到0.328、0.359 mg/L，對(duì)照菌株比10#菌株和12#菌株早2 d出現(xiàn)峰值，并且含量稍高，發(fā)酵完畢后，雙乙酰產(chǎn)量分別為對(duì)照菌株0.176 mg/L、10#菌株0.136 mg/L、12#菌株0.171 mg/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10#菌株的雙乙酰還原能力較對(duì)照菌株和12#菌株更加優(yōu)良。

2.7啤酒酵母的發(fā)酵速率

將出發(fā)菌株和變異菌株以1.8×107個(gè)/mL進(jìn)行接種，在25 ℃條件下培養(yǎng)，測(cè)定其發(fā)酵速率，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　對(duì)照菌株與變異菌株發(fā)酵速率的比較Fig.6 Comparison of fermentation rate between variant and original strains

由圖6可知，10#菌株的降糖速率最快，在第5天由接種糖度10 °Bx降至5.5 °Bx，12#菌株降糖速率慢些，在第8天由接種糖度10 °Bx降至5.5 °Bx，而對(duì)照菌株降糖速率最慢，在第10天由接種糖度10 °Bx降至5.5 °Bx。經(jīng)計(jì)算，對(duì)照菌株的發(fā)酵速率為0.5 °Bx/d、10#菌株的發(fā)酵速率為1.5 °Bx/d、12#菌株的發(fā)酵速率為0.64 °Bx/d。

2.8出發(fā)菌株與變異菌株的發(fā)酵性能比較

表5　出發(fā)菌株與變異菌株最終發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 5 Physicochemical indexes of fermentation products from variant and original strains

由表5可知，誘變后的10#菌株的真實(shí)發(fā)酵度比出發(fā)菌株高些，雙乙酰產(chǎn)量下降20.9%，酒精度上升。脈沖強(qiáng)光誘變處理并未對(duì)啤酒酵母的發(fā)酵度產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，而是有所提高或保持原酵母菌株的優(yōu)良發(fā)酵性能。

3　結(jié) 論

本研究采用脈沖強(qiáng)光誘變啤酒酵母菌，并對(duì)抗性強(qiáng)的菌株的耐受性和發(fā)酵性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：脈沖強(qiáng)光可以篩選出發(fā)酵速率較高的10#和12#菌株。脈沖強(qiáng)光誘變處理并未對(duì)啤酒酵母的發(fā)酵度產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，而是有所提高或保持原酵母菌株的優(yōu)良發(fā)酵性能。綜上所述，脈沖強(qiáng)光篩選出的菌株具有生產(chǎn)出優(yōu)良啤酒的能力。

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Mutagenic Effects of Pulsed Light Irradiation on Saccharomyces cerevis iae

ZHANG Baiqing, SUN Lanmeng
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Abstract:Pulsed light irradiation treatment was applied on Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) under varying conditions of voltage (1 000, 1 500, 2 000, 2 500, and 3 000 V) and pulse number (4, 8, 16, 32, and 48). A comparative analysis between the variant and original strains was performed for differences in flocculation ability, diacetyl production, physico-chemical properties of fermentation products and fermentation rate. Mutant strains 10# and 12# with good fermentation characteristics were obtained by primary and secondary screening. Our results showed that pulsed light irradiation did not negatively affect but maintained or even enhanced the fermentation performance of S. cerevisiae.

Key words:pulsed light; Saccharomyces cerevisiae; mutagenesis; variant strain; original strain

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507028

中圖分類號(hào)：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2015）07-0153-05

作者簡(jiǎn)介：張佰清（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称饭こ碳夹g(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。E-mail：sybaiqingxl@sina.com

收稿日期：2014-05-19