羅依雨, 羅　維, 劉峻熙, 楊志民, 倪　賀, 李海航

(華南師范大學生命科學學院， 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室， 廣州 510631)

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啤酒廢酵母自溶提取物的制備及抗氧化活性研究

羅依雨, 羅維, 劉峻熙, 楊志民, 倪賀*, 李海航

(華南師范大學生命科學學院， 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室， 廣州 510631)

摘要：以廣州本地啤酒廠廢酵母為材料，通過單因素實驗研究其最佳自溶條件及最佳微波水解條件.比較自溶、微波水解與外加酶制劑處理法制備酵母提取物的效果，研究了該提取物的抗氧化活性. 結果表明，啤酒酵母的最佳自溶條件為固液比1∶20、溫度45.0 ℃、pH 6.0、時間48 h，在此條件下，酵母蛋白質的水解度為41.5%，提取蛋白質得率為42%. 自溶法制備啤酒酵母提取物的效率與外加酶制劑處理的效果相當，而顯著高于微波水解法，提取物具有較高的抗氧化活性. 研究表明，自溶法是開發(fā)利用啤酒廠廢棄的酵母和制備酵母提取物的較好方法.

關鍵詞：啤酒酵母； 提取物； 自溶； 微波水解； 蛋白質得率； 抗氧化活性

啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 是一種用于啤酒生產(chǎn)的繁殖極快的單細胞微生物，其蛋白質含量高達50%，且氨基酸組成齊全，富含人體所缺乏的各種維生素和微量元素，兼?zhèn)涿廊?、瘦身、養(yǎng)生的功效，具有很高的開發(fā)價值[1]. 中國啤酒產(chǎn)量連續(xù)10年保持世界第一，每年產(chǎn)生約50 萬t的啤酒廢酵母，除很少部分用作飼料外，大部分被直接排放[2].由于啤酒廢酵母的蛋白質具有較高的營養(yǎng)價值和安全性，用啤酒廢酵母提取和制備食用功能蛋白引起了研究者的關注. 但酵母具有非反芻動物難以消化的堅固的細胞壁，其細胞內(nèi)各種營養(yǎng)物質很難釋放出來；細胞內(nèi)還含有較高的核酸，需將其分解，否則易引起人體的尿酸偏高，導致痛風癥. 因此，開發(fā)高效和經(jīng)濟的啤酒廢酵母蛋白質利用方法尤為重要[3].

外加酶制劑處理可使啤酒酵母細胞破壁，提高營養(yǎng)物的提取率、縮短提取時間，成為國內(nèi)食品加工業(yè)的研究熱點.研究[4-5]表明，利用蛋白內(nèi)切酶、外切酶、磷酸二酯酶和AMP-脫氨酶聯(lián)合酶解酵母細胞22 h，酵母固形物得率能夠達到53%. 但酶制劑價格昂貴，作用效果不一.

利用活性酵母自身的水解酶(如蛋白酶、核酸酶)將啤酒酵母細胞內(nèi)的大分子水解成多肽、氨基酸和核苷酸等. 影響酶促反應的因素，如溫度、pH和時間等，均會影響自溶效果.研究[6-7]發(fā)現(xiàn)啤酒酵母在45～60 ℃、近中性pH條件下水解48～121 h，自溶效果較好. 經(jīng)自溶后的酵母提取物具有廣泛的生理藥理活性，包括降血壓、抗菌、抗癌、免疫調節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)調節(jié)等，具有保健食品和藥品的開發(fā)潛力. 目前，關于酵母自溶與酶解法等相關研究尚少，其在生產(chǎn)中的優(yōu)越性并未完全體現(xiàn).

本研究對啤酒廢酵母的自溶條件進行了研究，并與微波水解法和外加酶制劑水解法的效果進行了比較，測試了自溶法制備的酵母多肽的抗氧化活性，為進一步開發(fā)利用啤酒廢酵母資源提供依據(jù).

1材料與方法

1.1實驗材料

啤酒廢酵母由廣州市本地啤酒廠提供，酵母泥經(jīng)水洗、烘干得到干酵母，-20 ℃保存?zhèn)溆? 酵母復合水解酶購于廣東五洲藥業(yè)有限公司，保存于-20 ℃.

1.2啤酒廢酵母自溶水解

根據(jù)預實驗結果，料液比為1∶20時酵母自溶的蛋白質得率最高.向裝有1.0 g干酵母粉的錐形瓶中加入20.0 mL蒸餾水，分別在不同溫度和不同pH條件下置于振蕩培養(yǎng)箱中自溶不同時間，自溶后沸水浴5 min，以6 000 r/min離心10 min，收集上清液中的提取液，測定蛋白質水解度和蛋白質得率.

1.3啤酒廢酵母微波水解

向裝有1.0 g干酵母的錐形瓶中加入20.0 mL蒸餾水，分別在不同pH、微波水解次數(shù)等條件下置于微波爐中中低火處理6 min. 將提取液定容至5.0 mL，以6 000 r/min離心10 min，收集上清液中的提取液，測定蛋白質得率和蛋白質水解度.

1.4啤酒廢酵母酶水解

酵母蛋白質的酶水解在已有研究[8]所得的最佳酶解條件下進行. 向裝有1.0 g啤酒廢酵母的錐形瓶中加入20.0 mL蒸餾水、酵母復合水解酶∶干酵母質量比3.5∶100，調節(jié) pH至6.5，在60 ℃水浴中酶解6 h. 酶解后沸水浴5 min，以6 000 r/min離心10 min，收集上清液中的提取液，測定蛋白質得率和蛋白質水解度.

1.5蛋白質含量測定

采用雙縮脲法[9]測定蛋白質含量. 以不同質量濃度的牛血清白蛋白為標準品制作蛋白質定量標準曲線.取各種提取液1.0 mL，置于試管內(nèi)，加入雙縮脲試劑4.0 mL，混勻后靜置30 min，測其在540 nm下的吸光度，根據(jù)標準曲線可得提取液中蛋白質的質量濃度.

1.6蛋白質水解度測定

采用甲醛滴定法[10]，取啤酒廢酵母的各種提取液5.0 mL，置于250 mL的燒杯中，加入30.0 mL去二氧化碳的蒸餾水，調節(jié)pH至7.0，加入5.0 mL pH 9.2甲醛溶液，用磁力攪拌器混勻，再用 NaOH 標準溶液滴定至 pH 9.2，記錄NaOH標準溶液的消耗數(shù)V1(mL)，同時，取未水解的酵母提取液5.0 mL，按上述方法做空白實驗，記錄NaOH標準溶液的消耗數(shù)V2(mL),計算啤酒廢酵母的各種提取液中蛋白質水解度.

1.7蛋白質得率測定

用凱氏自動定氮法測定蛋白質的總得率[11]. 分別取啤酒廢酵母的各種提取液3.0 mL，置于消化管中，進行凱氏定氮，最后滴定的標準硫酸濃度為0.05 mol/L，記錄硫酸體積消耗數(shù)，并計算各水解條件下的蛋白質得率.

1.8DPPH·清除力測定

1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)清除力的測定參照文獻[12]的方法進行.配制120 μmol/L DPPH-乙醇溶液(體積比為50%)，取0.1 mL樣品溶液，加入2.9 mL DPPH，室溫靜置20 min后按以下式計算清除力：

清除力ORSC%=(1-(A-B)/Ao)×100%，

式中A為樣品與DPPH反應(樣品0.1 mL+2.9 mL DPPH)后的吸光度；B為樣品的空白(樣品0.1 mL+2.9 mL乙醇)的吸光度;Ao為未加樣的DPPH(2.9 mL DPPH+0.1 mL 50%乙醇)的吸光度.

1.9薄層色譜自顯影法測體積比抗氧化活性

將最佳自溶條件下所得的提取液在2塊硅膠薄層色譜板上展層分離，展層劑為正丁醇∶水∶乙酸體積比=3.5∶5.0∶1.5. 展層后的硅膠板置于室溫下，使展層溶劑充分揮發(fā). 將其中一塊展層的硅膠板置于碘蒸汽罐中顯色，觀察樣品成分的分離. 另一塊展層的硅膠板采取自顯影法測定抗氧化活性，用0.04% DPPH·的乙醇溶液均勻噴霧，于40 ℃加熱30 min，在硅膠板上直接觀察和記錄各分離物質的抗氧化活性[13].

2結果與討論

2.1啤酒酵母最佳自溶條件研究

2.1.1溫度的影響已知酵母自溶中起主要作用的是蛋白酶、核酸酶和葡聚糖酶，最適反應溫度一般在40～60 ℃[14].將干酵母按照1∶20的料液比加入到pH 7.0的水中，在40～60 ℃的不同溫度下自溶24 h. 當溫度為40 ℃時(圖1A)，提取液中的蛋白質含量和水解度都較低.當溫度升高到45 ℃時，其蛋白質含量(3.73 g/L)和水解度(28%)均達到最大.隨著溫度的繼續(xù)升高，提取液的蛋白質含量和水解度都隨溫度的上升降低.因此，確定啤酒酵母的最佳自溶溫度為45 ℃.

2.1.2pH的影響啤酒酵母細胞內(nèi)的蛋白酶一般在pH 5.0～8.0時有活性. 在45.0 ℃條件下自溶24 h、pH 6.0時(圖1B)兩者都達到最高值. 因此，確定啤酒酵母的最佳自溶pH為6.0.

2.1.3水解時間的影響在溫度為45.0 ℃、pH為6.0的自溶條件下，探究自溶時間對啤酒酵母自溶的影響. 在12～48 h(圖1C)，提取液中蛋白質含量和水解度均隨自溶時間的增加而增加，在48 h時達到最高.之后，水解度不再增加，而蛋白質含量則下降. 因此，確定啤酒酵母的最佳自溶時間為48 h. 本研究采用雙縮脲法測定蛋白質含量，只能測定蛋白質中肽鍵的量，自溶48 h后的蛋白質含量下降可能由于有部分蛋白質被水解成氨基酸.

綜上所述，確定啤酒酵母的最佳自溶條件為溫度45 ℃、pH 6.0，自溶48 h.在此條件下，提取液中蛋白質含量為5.15 g/L，水解度為41.5%.凱氏定氮法測得自溶蛋白質的得率為42.3%.

圖1　溫度(A)、pH(B)和時間(C)對酵母自溶的影響

2.2微波水解對啤酒酵母蛋白質提取效果的影響

2.2.1pH的影響根據(jù)提取液全部蒸干的時間確定啤酒酵母的微波水解時間.將含有1 g酵母粉的20.0 mL蒸餾水，在中低火的微波條件下處理6 min后，提取液被全部蒸干，由此確定微波水解啤酒酵母的處理時間為6 min. 在中低火的微波條件下水解啤酒酵母6 min，在pH 5.0～8.0(圖2A)，提取液中蛋白質含量隨pH的升高逐漸增加，pH為8.0時達到最高，pH大于8.0時，蛋白質含量下降. 由此確定啤酒酵母微波水解的最佳pH為8.0.

2.2.2微波水解次數(shù)的影響在中低火、pH 8.0的微波條件下處理酵母6 min，發(fā)現(xiàn)提取液中蛋白質含量隨著水解次數(shù)的增加而升高(圖2B)，微波水解4次時，提取液的蛋白質含量達到最高(4.40 g/L). 因此，確定微波水解啤酒酵母的最佳條件為料液比1∶20、pH 8.0的水溶液、用微波爐的低檔能量處理4次，每次6 min.在此條件下得到的提取液的蛋白質含量為4.40 g/L.前述的最佳自溶條件下，提取液的蛋白質含量為5.15 g/L，表明微波水解法水解酵母蛋白的效率顯著低于自溶處理.

圖2　pH(A)和微波水解次數(shù)(B)對酵母提取效果的影響

Figure 2Effects of pH (A) and microwave hydrolysis times (B) on yeast extraction

2.3啤酒酵母自溶水解效果

有研究[15]表明，酵母復合水解酶在其最佳反應條件下(酵母復合水解酶∶干酵母質量比為3.5∶100，反應溫度60 ℃、pH 6.5、時間6 h)水解酵母蛋白，90%的蛋白質被提取并水解，水解度為25.3%. 本研究比較了酵母自溶和酵母復合水解酶酶解對啤酒廢酵母制備效果的影響(圖3)，在啤酒酵母最佳自溶條件下，酵母蛋白質得率與外加酶制劑處理的蛋白質得率相當，均能達到42%.將啤酒酵母自溶后再加酶制劑處理，提取液中的蛋白質含量較單因素處理僅提高了2.6%. 表明自溶處理能有效水解啤酒酵母中的蛋白質，蛋白質提取率與外加酶制劑處理相當，高于微波處理. 與外加酶制劑處理和微波處理相比，自溶處理簡單，可大幅度降低酵母蛋白制備的成本或能耗，是一種理想的制備啤酒廢酵母蛋白質的方法.

圖3酵母自溶與外加酶制劑處理對酵母蛋白的提取效果

Figure 3Effects of yeast autolysis and enzyme preparation on yeast extraction

2.4酵母提取物抗氧化活性

初步分析了具有抗氧化活性的酵母提取物的DPPH·清除能力.啤酒酵母的提取液的蛋白質含量為5.15 g/L(圖4)，其DPPH·的清除能力為20.6%.將提取液逐級稀釋后，其DPPH·清除能力逐漸下降；將提取液濃縮后，隨著蛋白質含量的增加，其DPPH·清除能力逐漸升高，當質量濃度為41.2 g/L時，其DPPH·清除能力達到62%. 與沒有明顯抗氧化性的酶解酵母多肽相比，自溶所得啤酒酵母提取液具有較好的抗氧化性，其DPPH·清除能力呈現(xiàn)質量濃度依賴性[21].

圖4　酵母自溶濃度對DPPH·清除力的影響

Figure 4Effect of concentration of yeast autolysis on DPPH· radical-scavenging activity

用硅膠薄層層析法對啤酒廢酵母的提取液成分進行分析，并在薄層板上進行了抗氧化活性分析. 將提取液點在硅膠薄層板上(圖5)，用展層劑(正丁醇∶水∶乙酸=3.5∶ 5.0∶1.5)展開后，在碘蒸汽罐中顯色可觀察到分離成3個主要組分(圖5A). 抗氧化活性自顯影結果(圖5B)顯示組分2、組分3部位DPPH·的紫色消失而組分1部位紫色依然存在，表明組分1無DPPH·清除活性，組分2和3具有DPPH·清除活性.

圖5　薄層色譜法分離(A)和酵母提取物抗氧化活性測定(B)

Figure 5Separation(A) and identification(B) of yeast antioxidant extract with TLC

3結論

探討了啤酒廢酵母的最佳自溶條件，并將其與微波水解和外加酶制劑處理的水解效果進行了比較. 結果顯示，啤酒酵母的最佳自溶條件為固液比1∶20、自溶溫度45.0 ℃、自溶pH6.0、自溶時間48 h，自溶后提取液中蛋白質質量濃度為5.15 g/L，水解度為41.5%，蛋白質得率均為42%. 利用該方法制備啤酒酵母提取物，其蛋白質的得率顯著高于微波水解法，且與外加酶制劑處理的作用效果相當，并能大幅縮減酶解法制備酵母多肽的生產(chǎn)成本. 抗氧化活性研究表明，自溶法制備的啤酒酵母提取液具有較高的抗氧化活性.

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【中文責編：成文英文責編：李海航】

Preparation and Antioxidant Activity of Peptides from Waste Saccharomyces Cerevisiae

LUO Yiyu, LUO Wei, LIU Junxi, YANG Zhimin, NI He*, LI Haihang

(Guangdong Provincial Key Lab of Biotechnology for Plant Development, School of Life Science,South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Abstract：The brewery waste yeast (Saccharomycescerevisiae) contains 50% proteins and has high values of application. The optimal conditions of autolysis ofS.cerevisiaecells were explored by the single-factor tests, and its efficiency was compared with the microwave-assisted hydrolysis and exogenous enzyme hydrolysis. The results showed that the optimal autolysis conditions of the yeast were with a solid-liquid ratio of 1∶20, at pH 6.0 and 45.0 ℃ for 48 h. Under these conditions, yeast proteins were hydrolyzed and extracted at the yield of 42%, the degree of hydrolysis was 41.5%. The autolysis method showed the same efficiency as the exogenous enzyme hydrolysis, but higher than that of the microwave-assisted hydrolysis. The prepared yeast extracts by autolysis showed high antioxidant activity.

Key words：Saccharomycescerevisiae; extract; autolysis; microwave-assisted hydrolysis; protein yield; antioxidant activity

收稿日期：2015-06-15《華南師范大學學報(自然科學版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

基金項目：廣東省自然科學基金項目(2014A030313423)；廣東省科技計劃項目 (2014A010107026)；教育部高等學校博士學科點專項科研基金新教師類項目(20134407120004)

*通訊作者:倪賀，講師，Email: 022524328@163.com.

中圖分類號：Q936

文獻標志碼：A

文章編號:1000-5463(2016)01-0089-05