徐建春，孫慧彬，于水見

（青島瑯琊臺集團股份有限公司，山東青島 266400）

衣康酸發(fā)酵過程工藝研究

徐建春，孫慧彬，于水見

（青島瑯琊臺集團股份有限公司，山東青島 266400）

研究了不同因素對發(fā)酵法生產衣康酸的影響，確定了衣康酸發(fā)酵生產的最佳溫度為36～37°C和最佳初始pH為3.2～3.6。研究輔助有機氮源對衣康酸發(fā)酵生產的影響，從生產實際和經濟方面考慮，采用麥麩作為輔助氮源比較合適。

衣康酸；氮源；溫度；pH

衣康酸（Itaconic acid）學名為甲叉琥珀酸，亞甲基丁二酸，是一種不飽和二元有機酸（分子式：C5H6O4；分子量：130.1；熔點：165～169°C；化學文摘號：97-65-4。溶于水、乙醇和丙酮等溶劑，微溶于氯仿、苯和乙醚）。因衣康酸中含不飽和雙鍵，使其化學性質很活潑，可進行自身間的聚合，能與其他單體如丙烯腈等聚合，也能進行各種反應，如加成反應、酯化反應和聚合反應等，是重要的生產原料。

衣康酸生產方法有發(fā)酵法和化學合成法。生物發(fā)酵法的生產工藝和生產條件容易控制、工藝條件溫和，且原料主要是玉米淀粉水解糖，屬于可再生的資源，而且原料易得，來源豐富，生產成本受其影響較小，相對較穩(wěn)定，在經濟上占有一定優(yōu)勢。因此，目前國際國內大多都采用生物發(fā)酵的方法。

微生物發(fā)酵的生產水平不僅取決于生產菌種本身的性能，還需要有合適的環(huán)境條件即發(fā)酵工藝加以配合，才能使其生產能力充分表現(xiàn)出來。因此必須研究生產菌種的最佳發(fā)酵工藝條件，如營養(yǎng)要求、培養(yǎng)溫度、pH條件和氧的供需等。自從人們發(fā)現(xiàn)土曲霉（Aspergillus terreus）可以利用葡萄糖轉化生產衣康酸后，便開始致力于研究發(fā)酵法生產衣康酸的工藝技術，衣康酸的生產技術水平也不斷提高，其轉化率由一開始的30%提高到62%以上。后來，人們又對不同形式的衣康酸發(fā)酵進行了研究，如深層發(fā)酵工藝、表面發(fā)酵工藝、半連續(xù)發(fā)酵工藝等。在衣康酸原料利用方面，研究了將纖維素水解糖、蔗糖和淀粉作為原料發(fā)酵生產衣康酸的可行性。同時，衣康酸發(fā)酵與所有的好氧發(fā)酵一樣，還受到很多因素的影響，如pH、溫度、溶解氧、攪拌轉速、微量元素、碳氮源等，對影響衣康酸發(fā)酵因素的研究一直是人們關注的重點。1997年，賈士儒等人[1]研究報道了氣升式罐發(fā)酵衣康酸的情況以及氧的供給對土曲霉IFO-6365菌株衣康酸發(fā)酵的影響；1995年，Gyamerah等人[2]研究報道了發(fā)酵培養(yǎng)基的組成對土曲霉（Asp.terreus NRRL1960）菌株生長形態(tài)及產酸情況的影響。

本研究以玉米淀粉水解糖為原料，對高產菌株土曲霉KHT1（Asp.terreus KHT1）衣康酸發(fā)酵工藝進行了研究，主要探索溫度、裝液量、初始PH、輔助有機氮源對發(fā)酵產酸的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種

實驗室保藏菌株：土曲霉KHT1（Asp.terreus KHT1）。

1.2 原料、儀器、設備

表1 試劑及設備

1.3 培養(yǎng)基

種子麩曲培養(yǎng)基：1000 mL三角瓶裝，干麩皮20～30 g，加水比為1∶0.5～0.8，120°C條件下滅菌30 min。待麩皮冷卻后，在無菌操作臺上接種，然后轉入培養(yǎng)間，在33°C條件下培養(yǎng)7 d，種子成熟冷藏待用。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖123，NH4NO33.9，MgSO4·7H2O 0.4～0.6，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.04，ZnSO4· 7H2O 0.02，pH為3.6～4.0。

1.4 玉米淀粉水解糖的制備

淀粉與水按比例1∶1.0～1.5（w/v）混合，然后調pH至6.0，按12 U/g干淀粉（以純淀粉計）的量加入高溫淀粉酶，然后液化、糖化、壓濾制得糖液備用。

1.5 發(fā)酵實驗

在50 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵實驗，按發(fā)酵培養(yǎng)基配方組成將所需的原輔料投加到發(fā)酵罐中，罐的填充系數(shù)控制在50%～60%。主要考查不同的發(fā)酵溫度對發(fā)酵產酸的影響，更換不同的輔助有機氮源，觀察發(fā)酵產酸的變化情況。

1.6 分析方法

1.6.1 總酸的測定

酸堿滴定法[3]。

N1—標準NaOH摩爾濃度（mol/L）；

V1—消耗NaOH溶液毫升數(shù)（mL）；

65.05—1 /2衣康酸摩爾量（g）；

1—吸取發(fā)酵液l mL。

1.6.2 還原糖的測定

斐林試劑法。

S-殘?zhí)呛浚?0-2g/mL）；

V0—空白滴定消耗葡萄糖標液毫升數(shù)（mL）；

V1—正滴定消耗葡萄糖標液毫升數(shù)（mL）；

0.1—葡萄糖標準溶液的濃度（10-2g/mL）；

0.2—吸取試樣的毫升數(shù)（mL）。

1.6.3 糖酸轉化率的計算

1.6.4 菌體量的測定

血球計數(shù)板法。

2 實驗結果和討論

2.1 溫度對Asp.terreus KHT1發(fā)酵產酸的影響

溫度是影響有機體生長繁殖最重要的因素之一，因為任何生物化學的酶促反應都是直接與溫度變化有關的。對微生物發(fā)酵來說，溫度的影響是多方面的，可以影響各種發(fā)酵條件，最終影響微生物的生長和產物的形成。對微生物細胞的生長來說，隨著溫度的上升，酶促反應速度加快，呼吸加強加快，導致細胞的生長繁殖加快，菌體衰老提前，發(fā)酵周期縮短，這對發(fā)酵生產是不利的，最終導致產量下降。在適合溫度下，菌體將發(fā)揮其最大的能力，以最高的轉化率生成產物。溫度還可以通過改變發(fā)酵液的物理性質間接的影響菌體的生物合成，如溫度可以影響基質和氧在發(fā)酵液中溶解和傳遞速率，菌對某些基質的分解吸收速率，因此，最適溫度的確定要考慮多種因素的影響。50 L發(fā)酵罐中，溫度對發(fā)酵結果的影響見表2。

從表2的數(shù)據可以看出，發(fā)酵溫度在36～37°C時發(fā)酵產酸結果最好，而且菌體生長繁殖速度正常，轉化率也較高。從發(fā)酵過程來看，在36～37°C溫度間進行產衣康酸的發(fā)酵，菌體生長速度比較均勻，發(fā)酵24 h后，發(fā)酵液中菌體開始分叉生長，同時就有衣康酸的產生。在較低的溫度條件下發(fā)酵，發(fā)酵液顏色淺，菌體濃度低，產酸低。在較高溫度下，料液顏色相對變深，由原來的微黃色變?yōu)槲⒓t色，產酸也很低。

表2 溫度對Asp.terreus KHT1發(fā)酵的影響

2.2 裝液量對發(fā)酵的影響

圖1 裝液量對發(fā)酵的影響

實驗結果表明，500 mL三角瓶中裝液量在50～60 mL之間時，產酸最高。低于50 mL時，因為種子萌芽階段水的蒸發(fā)，造成培養(yǎng)基中成分的比例變化較大，水的活度下降，影響了營養(yǎng)物的吸收代謝。裝液量高于60 mL時，因為料液量大，造成溶氧不足，使發(fā)酵結果差。

2.3 初始pH值對發(fā)酵的影響

關于pH值對發(fā)酵產酸的影響早在1945年Lockwood等人[4]報道了土曲霉積累衣康酸的pH值在2.0左右；Batti等人[5]則指出衣康酸發(fā)酵的pH值對于雜酸的形成關系重大，pH高于5.0時無雜酸生成，pH低于3.0時土曲霉所產的酸有15%是雜酸，為了保證發(fā)酵產酸的純度，必須用堿將pH維持在3.0～5.0范圍內。2000年，Riscaldati等人[6]報道了pH值對土曲霉衣康酸發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中磷的濃度降到10 mg/L以下時，菌體停止生長而進入產酸階段。

圖2 pH值對發(fā)酵產酸的影響

圖2表明控制初始pH值在3.2～3.6之間，發(fā)酵的產酸會達到最高，殘?zhí)菚抵磷畹汀?/p>

2.4 輔助有機氮源對發(fā)酵影響的結果

1969年，Nowakowska-waszezu等人研究發(fā)現(xiàn)土曲霉在以葡萄糖為碳源，以NH4NO3、（NH4）2SO4或谷氨酸為氮源時，均不能生長和產衣康酸，添加0.1%的玉米漿，則產5%左右的衣康酸，如用0.01%的KH2PO4和Ca2+則可以達到同樣的產酸水平，在含有KH2PO4和Ca2+的培養(yǎng)基中再添加玉米漿，反而有抑制作用。發(fā)酵試驗中，控制起始糖濃度為155.0 g/L，初始pH值為3.6，分別采用玉米漿和麥麩作為輔助有機氮源，考察不同的添加量對產酸結果的影響，并綜合考慮其生產實用的經濟性。結果見表3。

從表3看出，用麩皮作為輔助有機氮源比用玉米漿總體來說產酸要高，而且發(fā)酵料液顏色淺。從生產實際考慮，麥麩的價格要比玉米漿便宜，而且麥麩容易保存，長時間保存不變質。

3 小結

對菌株Aspergillus terreus KHT1的發(fā)酵工藝條件和培養(yǎng)基做了研究，主要從發(fā)酵溫度、裝液量、pH值和氮源的應用對發(fā)酵產酸的影響進行了分析。發(fā)酵溫度控制在36～37°C時產酸最高；500 mL搖瓶中裝液量在50～60 mL時發(fā)酵結果最好，而初始pH值控制在3.2～3.6之間時，也能達到最好的產酸效果。對比了輔助有機氮源玉米漿和麥麩對發(fā)酵的影響，玉米漿用量0.24%時產酸最高，可以達到91.8 g/L，但是發(fā)酵液顏色微紅色較深；麥麩的用量0.04%～0.08%時，發(fā)酵產酸都較高，在用量為0.08%時達到92.3 g/L。從生產實際和經濟方面考慮，采用麥麩作為輔助氮源比較合適。

Studies on fermentative process of itaconic acid

XU Jianchun,SUN Huibin,YU Shuijian
(Qingdao Langyatai(Group)Co.,Ltd.,Qingdao 266400,China)

Effects of different factors on itaconic acid fermentation were studied.The optimal temperature and initial pH for itaconic acid fermentation were 36-37°C and 3.2-3.6,respectively. The effects of auxiliary organic nitrogen sources on itaconic acid fermentation were also studied.In the view of industrial production and economic benefits,wheat bran was selected as auxiliary nitrogen source.

itaconic acid;nitrogen source;temperature;pH

TQ921

A

1674-2214（2015）01-0019-03

2014-12-10

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）（SS2015AA021003）

徐建春（1973—），男，高級工程師，主要從事有機酸發(fā)酵工程研發(fā)、規(guī)劃、科技項目設計，E-mail∶xjclyt@126.com.