劉念+熊燕飛+彭俊講+許瀚之+廖立菁+蔡小雨+許云

摘要：水下固形物表面微生物的黏附生長是生物污損層形成和生物腐蝕的初級階段。從長江水體分離得到三株淡水黏附菌，在前期對其形態(tài)特征進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，對其黏附生長進(jìn)行了初步研究，探討了殼聚糖和魚精蛋白兩種物質(zhì)對它們生長、黏附的抑制作用。結(jié)果顯示，3種菌株在玻璃片上能迅速黏附，殼聚糖與魚精蛋白處理菌體后能明顯改變菌株生長或黏附情況；處理材料表面后能顯著改變材料表面能，引起不同的微生物黏附現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：淡水黏附菌；殼聚糖；魚精蛋白；細(xì)菌生長；黏附

中圖分類號：O636.1；Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0027-04

水下設(shè)施及船體表面形成的生物污損層[1]是由多種生物及其附屬物構(gòu)成的開放生態(tài)系統(tǒng)。研究表明，放在海水中的任何物體表面很快就被單層的有機(jī)質(zhì)所覆蓋，稱為調(diào)節(jié)膜[2]，其后，細(xì)菌和其他微小的浮游生物，如原生動(dòng)物和各種微藻及其孢子等開始黏附，這些微生物在調(diào)節(jié)膜的滋養(yǎng)下形成生物膜[3，4]，最先附著的微生物的生長會(huì)增加表面的粗糙度和疏水性[5]，防垢層表面的有機(jī)物又能作為微生物再生長的碳源[6]，進(jìn)一步引導(dǎo)海綿、水螅、海藻、石灰蟲以及藤壺、貝類等次級附生物附著。生物污損是不可逆的，會(huì)導(dǎo)致膜的損壞從而增加操作成本[7]，給航運(yùn)、海防及水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失和安全隱患。

殼聚糖薄膜的潤濕性與膜表面的粗糙度有關(guān)，自然干燥的膜具有較大的粗糙度，穩(wěn)定的具有微納米結(jié)構(gòu)的殼聚糖膜有望成為防污、防水、防霧、自清潔、無損運(yùn)輸?shù)攘己玫哪げ牧蟍8，9]。

本試驗(yàn)重點(diǎn)研究了殼聚糖、魚精蛋白及利用它們改性之后的材料對分離得到的三種淡水黏附菌的生長、黏附帶來的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌株：長江武漢市段黃鶴樓輪渡引橋水線下約20 cm處懸片取樣分離的菌株，分別記為AB-w，AB-y，AB-ly，作為試驗(yàn)菌株。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

主要試劑：殼聚糖，平均相對分子質(zhì)量300.00，脫乙酰度85%（青島海洋研究所）；硫酸魚精蛋白，生化試劑（BR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；戊二醛，分析純（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他常用試劑均為分析純（AR）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)菌株的分離培養(yǎng)與純化 長江武漢市段黃鶴樓輪渡引橋水線下約20 cm處，懸掛滅菌載玻片，分別于0.5、1 、2 、6、24 h取出，采用影印法，將載玻片上菌體印跡至牛肉膏蛋白胨固體平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察比較掛片不同時(shí)長后玻片黏附菌的數(shù)量及種類。選取優(yōu)先黏附、數(shù)量較多的菌落，用平板劃線法進(jìn)行二次分離純化，革蘭氏染色觀察。

1.2.2 試驗(yàn)菌株的生長、黏附觀察 將試驗(yàn)菌株從37 ℃過夜活化牛肉膏蛋白胨固體斜面保種管中取兩環(huán)，接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃，100 r/min空氣搖床培養(yǎng)3 h后作為菌液。

取菌液700 μL加入50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，分別添加700 μL無菌去離子水、20 mg/mL殼聚糖溶液、10 mg/mL魚精蛋白溶液，每瓶培養(yǎng)基中以銅絲籠置入兩片蓋玻片，37 ℃，100 r/min空氣搖床培養(yǎng)。到預(yù)定時(shí)間后觀察培養(yǎng)基情況后將蓋玻片取出，以4 mL無菌去離子水輕輕沖洗兩面后，在無菌濾紙上晾干，取未接觸濾紙一面連續(xù)兩次印跡于牛肉膏蛋白胨固體平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 殼聚糖和魚精蛋白對試驗(yàn)菌株的抑制生長觀察 取200 μL菌液，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面，略微靜置，分別滴加50 μL 100.0、33.3、20.0 mg/mL殼聚糖溶液與10.0 mg/mL魚精蛋白溶液，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.4 殼聚糖溶液對菌株生長的影響 利用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板探究不同濃度殼聚糖溶液對菌株生長的影響。設(shè)置空白培養(yǎng)液組及試驗(yàn)菌株培養(yǎng)組，調(diào)節(jié)殼聚糖終濃度分別為0.000 0、0.037 5、0.075 0、0.150 0、0.300 0、0.600 0 mg/mL，每個(gè)濃度4次重復(fù)，每孔溶液總量100 μL。酶標(biāo)儀中等強(qiáng)度振蕩10 s后630 nm處測量每孔的吸光度，37 ℃靜置培養(yǎng)20 h后重復(fù)測量。

1.2.5 改性材料檢測及微生物黏附情況觀察 蓋玻片經(jīng)高溫蒸氣滅菌，浸入1%戊二醛溶液中，60 ℃恒溫水浴1 h。取出后放入15 mL無菌去離子水中浸洗3次，無菌濾紙上晾干。分別置入現(xiàn)制的6 mg/mL殼聚糖溶液、20 mg/mL魚精蛋白溶液、無菌去離子水中，4 ℃靜置8 h，取出晾干，置于無菌培養(yǎng)皿中暫存。

將處理后的材料分為4組，一組以水在空氣中測量接觸角，重復(fù)測量5次，運(yùn)用MATLAB R2012a，根據(jù)改進(jìn)的Berthelot規(guī)則[10]，計(jì)算材料表面能。

取兩組以銅絲籠固定，于武漢市黃鶴樓輪渡引橋處水線下分別懸吊15、30 min取出，以少量無菌去離子水沖洗表面雜質(zhì)后自然干燥，其中30 min組經(jīng)結(jié)晶紫簡單染色后使用奧林巴斯倒置熒光顯微鏡觀察，15 min組與剩下一組材料使用Hitachi S-4800場發(fā)射掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)菌株分離結(jié)果

獲得3種主要菌株，根據(jù)菌落顏色分別命名為AB-w（Adhesion bacteria-white），AB-ly（Adhesion bacteria-light yellow），革蘭氏染色陰性；AB-y（Adhesion bacteria-yellow），革蘭氏染色陽性。

2.2 試驗(yàn)菌株生長、黏附情況

3種試驗(yàn)菌株在添加有殼聚糖溶液（終濃度0.30 mg/mL）的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，開始時(shí)無明顯異常，37 ℃搖床培養(yǎng)1 h后皆出現(xiàn)絮狀沉淀，培養(yǎng)基明顯較空白對照組清澈。而添加有魚精蛋白溶液（終濃度0.14 mg/mL）的培養(yǎng)瓶明顯較空白對照組渾濁。如圖1所示，AB-y、AB-w菌株與AB-ly菌株情況類似。前期試驗(yàn)結(jié)果顯示3組培養(yǎng)瓶在添加相應(yīng)溶液之前菌體數(shù)量無數(shù)量級差異，推知此現(xiàn)象為添加相應(yīng)溶液所引起，若降低殼聚糖終濃度至0.20 mg/mL則無明顯絮狀沉淀出現(xiàn)。endprint

通過與對照組對比可知，在培養(yǎng)時(shí)間為1 h時(shí)，添加殼聚糖可以部分減少AB-ly、顯著抑制AB-y在蓋玻片上的黏附；添加魚精蛋白可以有效減少AB-ly、明顯抑制AB-y在蓋玻片上的黏附；而兩種物質(zhì)對AB-w均無明顯的抑制黏附作用。若縮短培養(yǎng)時(shí)間為15 min，兩種物質(zhì)對AB-y的抑制黏附作用明顯減弱，如圖2所示。推知0.14 mg/mL的魚精蛋白溶液對于AB-ly、AB-y的抑制黏附效果優(yōu)于0.30 mg/mL殼聚糖的效果。實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)時(shí)間適當(dāng)延長可以增強(qiáng)兩種物質(zhì)抑制AB-y黏附的效果。

2.3 抑菌圈大小

3種菌株對于兩種物質(zhì)的敏感性不一。其中AB-y、AB-ly對于兩種物質(zhì)的敏感性類似，隨著殼聚糖溶液濃度的降低，溶液黏度明顯降低，抑菌圈增大較明顯；10.0 mg/mL的魚精蛋白溶液可以顯著抑制兩種菌的生長。對于AB-w，3種濃度下殼聚糖抑制效果不明顯，魚精蛋白抑制效果一般（圖3）。

2.4 低濃度殼聚糖溶液對菌株生長的影響

大幅度降低殼聚糖濃度后，3種菌株的反應(yīng)不同。AB-y生長未受明顯影響；AB-ly在濃度為0.300 0 mg/mL前生長有小幅增強(qiáng)，0.300 0 mg/mL后生長受到抑制；AB-w在試驗(yàn)濃度下都出現(xiàn)受抑制現(xiàn)象，隨著濃度的升高抑制效果增強(qiáng)，在0.150 0 mg/mL到0.300 0 mg/mL區(qū)間內(nèi)變化顯著，隨后變化幅度的降低。結(jié)合抑菌圈試驗(yàn)推知為得到良好的抑制生長效果，AB-y需要較高的殼聚糖溶液濃度，AB-ly相對較低，AB-w最低。過高的殼聚糖溶液濃度因?yàn)槠漯ざ鹊娘@著增加會(huì)明顯降低抑制生長效果（圖4）。

2.5 改性材料性質(zhì)及微生物黏附情況對比

蓋玻片經(jīng)過改性后，材料表面能發(fā)生明顯變化，如表1和圖5所示。從表1和圖5可以看出，戊二醛處理后，材料接觸角稍微變大，表面能略有降低，疏水性小幅增加；戊二醛與殼聚糖共同處理后，材料接觸角明顯變大，表面能顯著降低，表現(xiàn)為疏水性；戊二醛與魚精蛋白共同處理后，魚精蛋白的加入使得材料接觸角、表面能、疏水性都與未經(jīng)處理的蓋玻片類似。

如圖6所示，從材料在江水中懸吊前后的掃描電鏡結(jié)果可以看出，浸泡之前，在放大20 000倍下空白對照可以看到明顯的劃痕；戊二醛處理后材料表面存在部分塊狀物；殼聚糖溶液處理后材料表面存在明顯的膜狀物，可解釋為殼聚糖膜干燥過程中，隨著溶劑及水分的蒸發(fā)，殼聚糖在溶液狀態(tài)下較為伸展的分子鏈由于脫溶劑化而不斷卷曲，分子鏈間的纏繞或結(jié)合趨于緊密。自然干燥條件下殼聚糖溶液蒸發(fā)速率較低，干燥時(shí)間長，分子鏈得到了充分卷曲和纏繞，因此形成膜的晶粒較粗大，使得薄膜結(jié)構(gòu)粗糙[9]；魚精蛋白溶液處理后可看到部分不規(guī)則顆粒。在江水中懸吊浸泡15 min之后，材料表面都發(fā)生了較大變化。其中以空白對照最為明顯。

比較之后可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過殼聚糖與魚精蛋白處理過后的材料表面雖然有層狀堆積，但層狀堆積大小不一，堆積無明顯規(guī)律，堆積較松散，懸吊前原有結(jié)構(gòu)被層狀堆積覆蓋依稀可見；空白對照層狀堆積明顯，有一定的規(guī)律性，原有結(jié)構(gòu)無法分辨；戊二醛處理組原本塊狀物消失，出現(xiàn)成片的堆積物。

從倒置熒光顯微鏡下觀察懸吊材料可知，不同處理后微生物的黏附情況有很大不同。其中空白對照吸附有大量的細(xì)菌，細(xì)菌間無明顯聚集成團(tuán)現(xiàn)象，細(xì)菌排列有一定的規(guī)律，無其他微生物的黏附；戊二醛處理材料表面細(xì)菌數(shù)量較少，分布較散，無明顯規(guī)律性，無其他微生物黏附；殼聚糖處理材料表面有多種微生物黏附，存在明顯的聚集成團(tuán)現(xiàn)象，細(xì)菌黏附相對較少；魚精蛋白處理材料無多種微生物黏附現(xiàn)象，細(xì)菌黏附相對較少，部分分散，部分存在多個(gè)細(xì)菌有序排列成三叉狀（圖7）。推測上述現(xiàn)象是由于戊二醛處理后一定程度上降低了細(xì)菌對材料的黏附，有機(jī)物殼聚糖由于良好的成膜性，在材料表面形成了一層有機(jī)膜，一定程度上吸引了比細(xì)菌高等級的微生物的黏附；魚精蛋白在材料表面分散分布，不會(huì)形成明顯的有機(jī)膜，所以不像殼聚糖處理材料那樣會(huì)黏附其他種類的微生物，而且由于魚精蛋白的存在，導(dǎo)致部分細(xì)菌發(fā)生比較規(guī)律的聚集。猜想殼聚糖與魚精蛋白處理后隨著時(shí)間的延長，這些聚集的細(xì)菌會(huì)被剝落，從而達(dá)到抑制細(xì)菌黏附的作用。

3 小結(jié)與討論

1）殼聚糖與魚精蛋白對分離得到的3種黏附菌確實(shí)有一定的抑制生長或黏附的作用，但是分離得到的3種黏附菌間對于殼聚糖及魚精蛋白處理后的響應(yīng)具有一定的區(qū)別。0.14 mg/mL魚精蛋白對抑制AB-y與AB-ly的黏附效果較好，對AB-w沒有明顯的抑制效果。10.0 mg/mL魚精蛋白對AB-y與AB-ly有著相似的抑制生長作用，但是對AB-w作用一般。為得到良好的抑制生長效果，AB-y需要較高的殼聚糖濃度，AB-ly相對較低，AB-w最低。

2）針對AB-y菌株，相同濃度的殼聚糖與魚精蛋白溶液處理下，適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間更有利于抑制AB-y在材料表面的黏附。

3）材料經(jīng)過處理后有了明顯的改變，殼聚糖處理的材料表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性，魚精蛋白處理的材料表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性，二者都能顯著改變微生物在其表面的黏附狀態(tài)。

4）殼聚糖與魚精蛋白抑制分離得到的3種黏附菌生長或黏附的最佳濃度還有待進(jìn)一步確認(rèn)，魚精蛋白抑制黏附的濃度不同可能對促進(jìn)細(xì)菌生長的效果不同。

5）殼聚糖與魚精蛋白處理材料的方法、材料的耐久性以及抑制黏附的機(jī)理還需要進(jìn)一步探究。這二者的共同點(diǎn)是帶有大量的正電荷，這一點(diǎn)可能是抑制細(xì)菌黏附，避免生物污損的一個(gè)方法。

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