尹洋

（信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000）

轉(zhuǎn)座子中關(guān)于轉(zhuǎn)座機(jī)制及相關(guān)技術(shù)的探究

尹洋

（信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000）

轉(zhuǎn)座子是基因組上可自主復(fù)制和移動(dòng)的DNA片段，廣泛存在于生物界.轉(zhuǎn)座子及相關(guān)技術(shù)在后基因組時(shí)代是研究基因組功能的重要手段和強(qiáng)大武器.概述轉(zhuǎn)座子的基本性質(zhì)、類型、調(diào)控機(jī)制及相關(guān)技術(shù)手段.

轉(zhuǎn)座子；調(diào)控機(jī)制；相關(guān)技術(shù)

轉(zhuǎn)座子即跳躍基因，它是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位，是基因組中可移動(dòng)的一段DNA序列，可以從基因組的一個(gè)位置“跳躍”到另一個(gè)位置.轉(zhuǎn)座子在實(shí)質(zhì)就是基因組上一段不必借助于同原序列就可直接從基因組內(nèi)的一個(gè)點(diǎn)跳躍到另一個(gè)點(diǎn)的可移動(dòng)的DNA片段，也被稱作可移動(dòng)元件.目前，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、轉(zhuǎn)座子激活標(biāo)簽技術(shù)等已被人們廣泛關(guān)注與應(yīng)用，相關(guān)研究也取得了一定成就.

1 轉(zhuǎn)座子特征及類型

轉(zhuǎn)座子具有末端反向重復(fù)序列，當(dāng)轉(zhuǎn)座發(fā)生插入作用時(shí)，受體分子中也會(huì)有一段靶序列自我復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子至于其中；在轉(zhuǎn)座子重新整合的位點(diǎn)會(huì)有一段正向DNA重復(fù)序列，其長度也會(huì)因轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)種類的不同而有所差異.轉(zhuǎn)座子插入發(fā)生時(shí)，會(huì)使受體基因失活，或者引起DNA缺失、倒位等變化.相反的，轉(zhuǎn)座子的插入作用也具有很強(qiáng)的作用.轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)本身也會(huì)因?yàn)槠滢D(zhuǎn)座作用、平行移動(dòng)、繁殖等活動(dòng)進(jìn)行擴(kuò)散，也會(huì)因自然選擇的壓力或者自我選擇性刪除作用而使轉(zhuǎn)座子丟失.

根據(jù)不同的轉(zhuǎn)座機(jī)制，可以將轉(zhuǎn)座子分為兩種類型：一類是DNA轉(zhuǎn)座子，也被稱作ClassII元件.DNA轉(zhuǎn)座子是通過“剪切-粘貼”機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)座.獲得可移動(dòng)片段有兩種方式：DNA復(fù)制或直接切出，得到移動(dòng)序列之后進(jìn)行轉(zhuǎn)座子的插入作用，引起基因的突變或重排.DNA轉(zhuǎn)座子有可以分為自主轉(zhuǎn)座子和非自主轉(zhuǎn)座子.前者本身可以編碼轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行轉(zhuǎn)座，后者則要在自主轉(zhuǎn)座子存在是才能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座.二類是逆轉(zhuǎn)座子，也被稱為Class I元件.逆轉(zhuǎn)座子通過“復(fù)制-粘貼”機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)座，其途徑為轉(zhuǎn)錄DNA-RNA-反轉(zhuǎn)錄DNA.逆轉(zhuǎn)座子的不斷復(fù)制積累使宿主的基因組擴(kuò)大.由于有啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等元件的存在，影響被插入基因組的表達(dá)，在生物進(jìn)化過程中具有不可忽略的影響.

2 轉(zhuǎn)座子分布特征

伴隨多種生物基因組測序序列的公布，基因組學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，在對這些測序的基因組的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子在這些生物的基因組中分布有一定的特征：（1）物種間的分布變化大；（2）轉(zhuǎn)座子的插入是非隨機(jī)模式；（3）轉(zhuǎn)座子的分布與重組率存在負(fù)相關(guān)；（4）具有靶點(diǎn)特異性.

己有研究表明轉(zhuǎn)座子占果繩基因組中的10-15%，在鼠基因組中轉(zhuǎn)座子的比例為40%，而人類基因組有44%為轉(zhuǎn)座子.在有些植物中轉(zhuǎn)座子所占比例更高,如在小麥中轉(zhuǎn)座子達(dá)到其基因組的80%,玉米中則達(dá)到基因組的84.2%.某些類型的轉(zhuǎn)座子可能傾向于分布在基因間區(qū),有的則傾向于基因內(nèi)部,在近著絲粒區(qū)域也有轉(zhuǎn)座子集中分布,而有的轉(zhuǎn)座子可插入到同類型轉(zhuǎn)座子內(nèi)部等，如蔣寧等的研究表明4個(gè)MITE家族序列傾向于插入到自身內(nèi)部，在對Copia和Gypsy轉(zhuǎn)座子的免疫炎光定位研究中表明這些轉(zhuǎn)座子傾向于分布在基因組的近著絲粒區(qū)一域.不同轉(zhuǎn)座子類型具有不同的生物學(xué)功能，轉(zhuǎn)座子分布的不隨機(jī)性也與其所具有的不同功能有關(guān).

3 轉(zhuǎn)座子的調(diào)控機(jī)制

3.1 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)本身介導(dǎo)的調(diào)控

主要有母本遺傳以及過量抑制兩種機(jī)制.就以DNA轉(zhuǎn)座子型中的piggyBac轉(zhuǎn)座子為例，來自棉鈴蟲HnPLE和來自銀紋夜蛾AaPLE的轉(zhuǎn)座酶,構(gòu)建了Helper輔助質(zhì)粒構(gòu)建二元轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，用不同轉(zhuǎn)座子的亞末端類型對不同宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)座，在轉(zhuǎn)座子酶AaPLE沒有活性的情況下，但HaPLE可以識別自身與赤擬谷盜亞末端反向重復(fù)序列組合的重組供體，表明HaPLE具有轉(zhuǎn)座活性并可以正常進(jìn)行轉(zhuǎn)座活動(dòng).當(dāng)轉(zhuǎn)座子缺失自身亞末端反向重復(fù)序列時(shí),在宿主細(xì)胞中幾乎不會(huì)表現(xiàn)出精確剪切.

3.2 宿主介導(dǎo)的調(diào)控

主要有轉(zhuǎn)座子結(jié)合因子、DNA甲基化等因素影響.轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)以反向重復(fù)序列、轉(zhuǎn)座酶基因、調(diào)控基因、阻遏物基因構(gòu)成，另外，在復(fù)合型轉(zhuǎn)座子中還會(huì)有較多類型的附加基因.在其構(gòu)成中，轉(zhuǎn)座子結(jié)合不同的因子，會(huì)影響基因組的調(diào)控和表達(dá).例如玉米Mu轉(zhuǎn)座子中，由于Mu1因子發(fā)生不同程度的切離轉(zhuǎn)座，兩種不同活性的Mu突變體中Mu1因子的多態(tài)性水平明顯地比對照植株要高，再通過限制性酶切和重亞硫酸鹽測序兩種方法相結(jié)合，對玉米MuDR調(diào)控因子的TIRA和TIRB末端區(qū)域的DNA甲基化位點(diǎn)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，在突變體MuDR調(diào)控因子的TIRA和TIRB末端，發(fā)生了不同程度的去甲基化變異，這些位點(diǎn)的去甲基化變異直接影響著MuDR調(diào)控因子的活性變化，從而影響玉米Mu轉(zhuǎn)座子的功能表達(dá).

3.3 重復(fù)誘導(dǎo)的基因沉默

在轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座中，DNA序列的復(fù)制、插入等作用影響宿主基因組，為基因組的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)化提供了重要的機(jī)制，影響著基因的表達(dá)和調(diào)控.在其中主要因素有基因誘導(dǎo)的點(diǎn)突變，以及RNA的干擾.RNA干擾是指進(jìn)化過程中與靶基因序列同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后特異性降解引發(fā)基因沉默現(xiàn)象，也是一種抑制轉(zhuǎn)座子生理活動(dòng)、影響基因表達(dá)調(diào)控的監(jiān)查控治機(jī)制.

3.4 環(huán)境影響

通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，植物在逆境脅迫條件下表觀遺傳變化是引起轉(zhuǎn)座子活性變異的重要機(jī)制.通過對一些模式植物如擬南芥和水稻的研究，人們已經(jīng)對植物在逆境脅迫條件下控制轉(zhuǎn)座子活性的表觀遺傳現(xiàn)象已經(jīng)有了初步的認(rèn)識.反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中長末端重復(fù)（LTR)是類似于反轉(zhuǎn)錄病毒的元件，其活性受到自身甲基化和環(huán)境因素的影響，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座因DNA甲基化抑制，而外界環(huán)境的刺激卻能夠刺激并激活轉(zhuǎn)座子，從而影響轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)周邊基因的表達(dá).通過對LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中Gypsy超家族和Copia超家族編碼部分同義非同義突變的分析表明，它們?nèi)匀皇艿捷^強(qiáng)的選擇壓力,而且似乎Gypsy超家族受到比Copia超家族更強(qiáng)的選擇壓力.

4 轉(zhuǎn)座子相關(guān)技術(shù)

隨著DNA測序及分子生物學(xué)的發(fā)展，關(guān)于轉(zhuǎn)座子也出現(xiàn)許多新技術(shù)的應(yīng)用.運(yùn)用Southern雜交、原位雜交等方法捕獲轉(zhuǎn)座子，然后對其進(jìn)行進(jìn)一步研究.

4.1 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)

由轉(zhuǎn)座子的插入可能引起生物體的突變，以引起突變的轉(zhuǎn)座子序列作為探針，再從突變體DNA文庫中篩選以得到突變基因，再根據(jù)此片段從野生型基因文庫中便可獲得完整的基因，這段插入序列像是在宿主基因上的一張標(biāo)簽，因此被稱作轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽.轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)就是運(yùn)用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽從野生型個(gè)體中分離并克隆出野生型基因，最終得到完整的基因的技術(shù)方法.轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)是在功能基因的研究中占有重要地位.轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)的科學(xué)依據(jù)是轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)插入會(huì)引起突變，從而發(fā)展起來的用于研究基因功能的方法,在初期僅用于克隆植物基因,近年來成功地應(yīng)用于酵母基因組功能研究之后,該技術(shù)才得以逐漸發(fā)展完善.設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽的時(shí)一般只保留完成轉(zhuǎn)座過程的必需的轉(zhuǎn)座子的片段,同時(shí)加入篩選標(biāo)記與報(bào)道基因以便于后續(xù)基因的表達(dá)和篩選.轉(zhuǎn)座標(biāo)簽中插入ORF,在其啟動(dòng)子控制下使不含有啟動(dòng)子的報(bào)道基因得以表達(dá),以便于用于檢測直接插入基因內(nèi)部的標(biāo)簽.

利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法分離基因時(shí)，通過含轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒載體的構(gòu)建，將之導(dǎo)入目的生物細(xì)胞中，然后對突變體進(jìn)行分離和鑒定、檢測轉(zhuǎn)座子在宿主體內(nèi)的活動(dòng)性能，就可以分離克隆得到我們所需的目的基因.轉(zhuǎn)座子進(jìn)行轉(zhuǎn)座時(shí)會(huì)因T-DNA整合到染色體中引起插入突變,并進(jìn)而分離基因，提高了分離基因的效率.目前應(yīng)用較為廣泛的轉(zhuǎn)座標(biāo)簽基礎(chǔ)是細(xì)菌中的Tn3轉(zhuǎn)座子、Mu噬菌體和酵母里的Ty結(jié)構(gòu).轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)可以精準(zhǔn)、高效的的找到與表型相關(guān)的基因，切操作簡便，在細(xì)菌、酵母以及植物、動(dòng)物中對基因組功能的研究起到重要作用.

4.2 基因增補(bǔ)技術(shù)

“睡美人”轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是一種易變的基因序列,在所有生物基因組中普遍存在并在其基因組中占據(jù)很大比例,對基因的表達(dá)調(diào)控產(chǎn)生很大影響,由于突變轉(zhuǎn)位能力不足使轉(zhuǎn)座子處于抑制狀態(tài)，引起基因沉默，影響基因組功能的表達(dá).基因增補(bǔ)技術(shù)，也就是非病毒轉(zhuǎn)座子“睡美人蘇醒”技術(shù).在“睡美人”轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)中具有兩套重復(fù)序列.當(dāng)轉(zhuǎn)座發(fā)生時(shí)，會(huì)插入到兩重復(fù)序列之間，致使攜帶有基因的質(zhì)粒載體在重復(fù)序列的末端形成轉(zhuǎn)座酶的作用位點(diǎn)，接著定位在兩重復(fù)序列外的轉(zhuǎn)座酶活化，進(jìn)而發(fā)生催化作用，使導(dǎo)入的基因可以很好的與宿主的基因組整合在一起，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)會(huì)在兩個(gè)重復(fù)序列末端分別加上特征性的標(biāo)志，整個(gè)系統(tǒng)從沉默中蘇醒進(jìn)行基因的表達(dá)或遺傳.

在植物中，具有轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽激活技術(shù).激活標(biāo)簽技術(shù)是指將增強(qiáng)子或強(qiáng)啟動(dòng)子隨機(jī)插入植物基因組，使增強(qiáng)子或強(qiáng)啟動(dòng)子插入位點(diǎn)側(cè)翼原先不表達(dá)或弱表達(dá)的基因得到過量表達(dá)，從而產(chǎn)生顯性的功能獲得型突變.激活標(biāo)簽誘變法在1992年被提出，并構(gòu)建啟動(dòng)子增強(qiáng)子序列載體，將其轉(zhuǎn)入植物中，獲得基因表達(dá)增強(qiáng)的突變體.激活標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)明促進(jìn)了對植物等基因功能的研究.

4.3 轉(zhuǎn)座子定點(diǎn)雜交技術(shù)

運(yùn)用DNA基因芯片繪圖技術(shù)將一個(gè)突變體系中所有插入轉(zhuǎn)座子的靶序列處理，可以確定全基因組樣本在不同情況下的差別，用來判斷基因的功能的技術(shù).轉(zhuǎn)座子定點(diǎn)雜交中宿主基因斷裂比較均勻，利于雜交而且雜交完全，又快速又準(zhǔn)確.

5 結(jié)語

轉(zhuǎn)座子普遍存在于幾乎每種生物中，在基因組功能的研究過程中，轉(zhuǎn)座子是高效的研究手段.轉(zhuǎn)座子在尋找新基因，確定生物體基因組功能，培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因物種，具有的修復(fù)與治療，轉(zhuǎn)座子插入微生物種群使之具有更高的生物降解能力改善并修復(fù)生態(tài)環(huán)境，另外還可以進(jìn)行群體多樣性的鑒別及系統(tǒng)發(fā)育分析等方面均有較多的應(yīng)用.

〔1〕馬艷平,劉永生，等.轉(zhuǎn)座子應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009,21(5):108-110.

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1673-260X（2015）09-0190-02