張 濤，樊慶燦，張向前，張跟喜，王金玉 *，顧玉萍

(1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2．江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室，揚(yáng)州 225009； 3.江蘇京海集團(tuán)，南通 226103)

京海黃雞體組成性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

張 濤1，2，樊慶燦1，2，張向前1，2，張跟喜1，2，王金玉1，2 *，顧玉萍3

(1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2．江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室，揚(yáng)州 225009； 3.江蘇京海集團(tuán)，南通 226103)

為了獲得影響京海黃雞體組成性狀的SNPs標(biāo)記及候選基因，為京海黃雞的進(jìn)一步遺傳改良提供新的方法，本研究使用Illumina公司的雞60K SNP芯片，對京海黃雞13個體組成性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。共篩選出13個與體組成性狀達(dá)到5%Bonferroni全基因組顯著相關(guān)的SNPs(P<1.8E-6)，130個達(dá)到5%Bonferroni全基因組潛在相關(guān)的SNPs(P<3.59E-5)。13個顯著SNPs位于GRIK1、NCAPG、KCNIP4和CACNA2D2等12個基因的附近或內(nèi)部，其中6個SNPs位于4號染色體上一個1.6 Mb區(qū)域(74.3～75.9 Mb)。130個潛在顯著的SNPs中，有25個集中分布在4號染色體上的一個7.4 Mb(71.5～78.9 Mb)的區(qū)域內(nèi)。共構(gòu)建了5 650種單倍型，其中，14個與京海黃雞6個體組成性狀顯著相關(guān)，14個單倍型中，9個位于4號染色體74.3～75.9 Mb區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域內(nèi)包括LCORL、QDPR、KCNIP4、LDB2和FAM184B在內(nèi)的多個功能基因。本研究結(jié)果表明，位于4號染色體的71.5～78.9 Mb區(qū)域以及該區(qū)域附近的GRIK1、NCAPG、KCNIP4、CACNA2D2、LCORL、QDPR、KCNIP4、LDB2和FAM184B基因?qū)┖｜S雞的體組成有重要影響。

京海黃雞；全基因組關(guān)聯(lián)分析；體組成；單倍型

體組成性狀是雞的重要經(jīng)濟(jì)性狀，直接影響雞的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。通過傳統(tǒng)育種對體組成進(jìn)行的遺傳改良取得了良好效果，然而，雞體組成性狀為復(fù)雜數(shù)量性狀，傳統(tǒng)育種方法已很難使體組成性狀取得較大的遺傳進(jìn)展。近些年來，隨著分子標(biāo)記輔助育種的快速發(fā)展，其已成為改良遺傳性狀的新方法，體組成和肉質(zhì)性狀分子標(biāo)記方面的研究已經(jīng)取得令人矚目的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了許多影響雞體組成和肉質(zhì)性狀的候選基因和QTLs[1-5]。

以往主要采用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法來鑒定與雞不同性狀相關(guān)的SNPs，但這兩種方法存在明顯的局限性，尤其是對于復(fù)雜數(shù)量性狀而言。目前，全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(GWAS)在篩選人類和動物復(fù)雜性狀相關(guān)候選基因的方面得到了廣泛的應(yīng)用[6-13]。X.Gu等[6]使用Illumina公司雞的60K SNP芯片對隱性白羽肉雞和絲羽烏骨雞F2雜交群體的體重性狀和日增重性狀進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)4號染色體上71.6～80.2 Mb是影響雞生長性狀SNPs的集中分布區(qū)域。L.Xie 等[7]使用雞Illumina 60 K SNP芯片，對白洛克和杏花雞的F2代雜交群體的體重性狀和日增重進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)雞1號染色體的173.5～175.0 Mb是與雞的體重和日增重性狀關(guān)聯(lián)顯著的SNPs集中區(qū)域，該區(qū)域存在極為明顯的連鎖不平衡現(xiàn)象。W.Liu等[8]利用Illumina 60 K SNP芯片，以矮小型褐殼蛋雞和白來杭為試驗動物，研究雞的繁殖性狀和蛋品質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了8 個與雞的繁殖性狀和蛋品種性狀關(guān)聯(lián)顯著的SNPs(P<0.05)和部分潛在顯著的SNPs。除了以上研究找到的與生長繁殖等性狀相關(guān)的SNPs外，雞無尾、體組成及肉品質(zhì)、抗馬立克及新城疫等性狀相關(guān)的一些位點也通過GWAS被找到[9-13]。

京海黃雞是本課題組在長期開展我國地方雞種質(zhì)資源調(diào)查、評價與保護(hù)的基礎(chǔ)上，經(jīng)多年連續(xù)攻關(guān)成功培育而成的我國目前唯一通過國家畜禽遺傳資源委員會審定的具有小型、優(yōu)質(zhì)、早熟和抗逆四大特點的新雞種，京海黃雞的育成，即采用了常規(guī)育種方法，又采用了分子輔助選擇方法，是雞育種中理論與實踐相結(jié)合的一個范例。在本研究中，為了找到與京海黃雞體組成性狀顯著相關(guān)的SNPs位點及影響體組成性狀的候選基因，使用Illumina 公司的60K SNP 芯片對體組成性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。旨在發(fā)現(xiàn)與雞體組成性狀相關(guān)的候選基因和區(qū)域，為京海黃雞標(biāo)記輔助選擇工作的開展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗群體及表型檢測

試驗群體為212只來自同一批次19個半同胞家系的京海黃雞，同一天孵化，籠養(yǎng)，自由采食和飲水，飼料符合[NRC]國際標(biāo)準(zhǔn)，所有雞均健康。66周齡采集血液，并屠宰分割稱重，記錄其活重(BW)、屠體重(CW)、腳重(FW)、翅重(WW)、胸肌重(BMW)、腿肌重(LMW)、腹脂重(AW)、全凈膛重(EW)和半凈膛重(SEW)，同時計算胸肌率(BMP)、腿肌率(LMP)、腹脂率(AWP)和全凈膛率(EWP)。采用SPSS19.0軟件對體組成性狀進(jìn)行統(tǒng)計分析(表1)，數(shù)據(jù)使用Minitap(v16)軟件中的Johnson法轉(zhuǎn)換以符合正態(tài)分布。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因分型 使用上海生工生物工程(上海)股份有限公司的Dzup Genomic DNA Isolation Reagent(Blood) kit 提取基因組DNA，提取后經(jīng)分光光度法檢測濃度和質(zhì)量，于-20 ℃保存，然后送至加拿大DNA LandMarks 股份有限公司使用60K SNP 芯片進(jìn)行基因分型，具體步驟：將雞DNA 濃度統(tǒng)一稀釋為 50 ng·μL-1。保證基因組DNA在250 ng以上；加入 0.1 mol·L-1NaOH 使 DNA雙鏈變?yōu)閱捂?，加入中和劑中和，再加入全基因組擴(kuò)增試劑， 37 ℃恒溫過夜孵育；對擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行過程利用終點式(End-point)片段化方法片段化；加入異丙醇使DNA 片段沉淀，4 ℃離心；將雜交緩沖液加入沉淀后的DNA中，使DNA完全溶解在雜交緩沖液中；將雜交緩沖液中的 DNA 與雞60 K SNP芯片在雜交爐中雜交過夜；沖洗芯片以除去多余的DNA。以檢測到的片段為模板，進(jìn)行處理過的單堿基延伸反應(yīng)，加入標(biāo)簽基團(tuán)，以區(qū)分檢測到的SNP 類型；使用XC4 試劑對反應(yīng)后的芯片進(jìn)行包被，真空條件下干燥1 h。iScan 芯片掃描儀掃描芯片的標(biāo)簽基因，使用 GenomeStudio 軟件分析掃描后的圖片，獲得分型結(jié)果。

表1 體組成性狀的描述性統(tǒng)計

Table 1 Descriptive statistics of body composition traits

性狀Trait最大值Max最小值Min平均值A(chǔ)verage標(biāo)準(zhǔn)差Standarddeviation最佳擬合Best?fit正態(tài)分布NormaldistributionBW66/g292512902062．9306．1-是CW/g275512101852．3285．3-是FW/g702546．38．81．25近似WW/g953562．711．80．94是BMW/g15550103．820．50．61是BMP/%21．310．216．41．90．83是LMW/g21070138．525．1-是LMP/%27．312．621．92．30．63是AW/g245597．4530．25是AWP/%15．60．57．33．2-是EW/g19507251270210-是EWP/%89．447．661．64．5-是SEW/g21901441430．9245．50．8是

1.2.2 質(zhì)量控制 使用Plink(v1.07)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制[14]，剔除最小檢出率低于90%的個體以及最小檢出頻率低于95%、最小哈代溫伯格平衡小于1.0E-6和最小等位基因頻率小于3%的SNPs。1.2.3 群體結(jié)構(gòu) 試驗樣本的群體結(jié)構(gòu)使用Plink軟件中的多維尺度分析法(Multidimensional scaling analysis，MDS)進(jìn)行計算，具體方法是以常染色體上25個SNPs為一個SNP窗，計算內(nèi)部成對SNPs的r2值，高于0.2則剔除一個標(biāo)記，并每5個單位進(jìn)行步移檢測，最后得到12 877個獨立的SNPs標(biāo)記，利用找到的標(biāo)記，在Plink中計算所有個體間成對的IBS(Identity-by-state distances)距離，再以IBS矩陣進(jìn)行MDS分析，以第一和第二主成分作MDS圖。MDS圖使用R(2.15.1)軟件繪制[15]，使用GCTA軟件進(jìn)行主成分分析法(PCA)，主成分PCA1和PCA2作為協(xié)變量代入模型中以減小群體分層效應(yīng)[15-17]。采用Plink軟件基于46 665個SNPs進(jìn)行單倍型分析，具體方法為計算同一染色體上200 kb內(nèi)的堿基對間的R2值，若大于0.8則認(rèn)為兩個SNPs為連鎖。

1.3 統(tǒng)計分析

本研究使用一般線性回歸模型(GLM)進(jìn)行統(tǒng)計分析，模型：

Y為觀察值向量，G為遺傳效應(yīng)向量，X為包括第一、第二主成分(PCA1和PCA2)在內(nèi)的固定效應(yīng)矩陣，α和β為關(guān)聯(lián)矩陣，e為隨機(jī)殘差向量。此外，采用GLM對單倍型和體組成性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。運用連鎖不平衡修正的Bonferroni校正，對P值進(jìn)行校正，此處獨立標(biāo)記計算r2值設(shè)為0.4[18]，得到27 824個獨立SNPs標(biāo)記，因此Bonferroni校正后全基因組顯著P值為1.80E-6(0.05/27 824)，全基因組潛在顯著P值為3.59E-5(1/27 824)。使用R(2.15.1)軟件作QQ和曼哈頓圖。

2 結(jié) 果

2.1 群體結(jié)構(gòu)分析

圖1 多維等級分析顯示的群體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Population structure identified by multidimensional scaling analysis

群體結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示(圖1)，京海黃雞19個半同胞家系的分布有一定的分層現(xiàn)象，分層現(xiàn)象是影響全基因組關(guān)聯(lián)分析準(zhǔn)確性的重要因素，若不考慮群體結(jié)構(gòu)因素的影響，那么分層效應(yīng)會被誤認(rèn)為是基因效應(yīng)，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此后續(xù)分析中必須使用某種方法來降低群體分層對分析結(jié)果的影響。本研究采用主成分分析法來校正群體分層，將主成分分析中的第一、第二主成分代入模型中來降低群體分層效應(yīng)。

2.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析

經(jīng)質(zhì)控后，最終200個樣本和46 665個SNPs可用于全基因組關(guān)聯(lián)分析，質(zhì)量控制后的SNPs分布見表2。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，本研究共篩選出13個與體重、腳重、翅重、胸肌重、腿肌重、腹脂重、腹脂率、全凈膛重和半凈膛重達(dá)到全基因組水平顯著關(guān)聯(lián)(P<1.80E-6)的SNPs位點(表3)。其中6個SNPs位點位于4號染色體上74.3～75.9 Mb區(qū)域內(nèi)，影響活體重、腳重、翅重、胸肌重、全凈膛重和半凈膛重6個體組成性狀。另外一個位于4號染色體34.5 Mb處，顯著影響腳重。另外3個影響腳重和翅重的SNPs 分別位于5號和7號染色體上。與胸肌重、腹脂重、腹脂率關(guān)聯(lián)的6個SNPs分別位于1、2、12和15號染色體上。未篩選出與屠體重、胸肌率、腿肌率和全凈膛率關(guān)聯(lián)顯著的位點，此外，還篩選出130個達(dá)到全基因組潛在顯著的SNPs，其中，大部分位點主要位于2、4和13號染色體上，有25個位點集中分布在4號染色體71.5～78.9 Mb區(qū)域內(nèi)。有顯著相關(guān)位點的性狀的曼哈頓圖和QQ圖見圖2和圖3。

2.3 與多個性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點

本研究篩選出的13個顯著位點中，5個SNPs與多個性狀顯著相關(guān)，位于4號染色體75.5 Mb附近的rs14710787和rs16023603與7個體組成性狀顯著相關(guān)；而位于4號染色體75.3 Mb附近的rs14490981與活體重、腳重、全凈膛重和半凈膛重4個性狀顯著相關(guān)；此外，位于1號染色體上的rs15368284與胸肌重、腿肌重、全凈膛重和半凈膛重4個性狀顯著相關(guān)，位于2號染色體上的rs14210468與活體重、屠體重、全凈膛重和半凈膛重顯著相關(guān)。

2.4 單倍型關(guān)聯(lián)分析

本研究對5 650個單倍型和13個體組成性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)了14個與活體重(1)、腳重(6)、翅重(2)、腹脂重(2)、腹脂率(2)和半凈膛重(1)達(dá)到全基因組水平顯著關(guān)聯(lián)的單倍型(表5)。14個單倍型中，有9個單倍型分布于4號染色體74.3～75.9 Mb區(qū)域內(nèi)，影響活體重、腳重、翅重和半凈膛重。其他單倍型分布于13、15、21和Z染色體上，14個單倍型中，有7個單倍型是由基因組水平關(guān)聯(lián)顯著的SNPs組成。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)與體組成性狀潛在關(guān)聯(lián)的單倍型58個(未列出)。

3 討 論

全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)是以遍布于整個基因組的單核苷酸多態(tài)性為分子標(biāo)記，以發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜性狀發(fā)生的遺傳標(biāo)記和遺傳標(biāo)記的分布特征為目的，對復(fù)雜經(jīng)濟(jì)性狀直接進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。全基因組關(guān)聯(lián)分析被認(rèn)為是一種確定影響重要經(jīng)濟(jì)性狀或?qū)е氯祟惸承┻z傳疾病分子標(biāo)記的有效方法。為了尋找影響京海黃雞體組成性狀的SNP位點，本研究采用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法篩選與京海黃雞體組成性狀相關(guān)的SNPs標(biāo)記，結(jié)果共篩選出13個與活體重、腳重、翅重、胸肌重、腿肌重、腹脂重、腹脂率、全凈膛重和半凈膛重達(dá)到全基因組水平顯著關(guān)聯(lián)(P<1.80E-6)的SNPs位點。其中，5個SNPs與多個性狀顯著相關(guān)，位于4號染色體75.5 Mb附近的rs14710787和rs16023603與7個體組成性狀顯著相關(guān)，兩個SNPs均位于NCAPG基因內(nèi)部。而位于4號染色體75.3 Mb附近的rs14490981與活體重、腳重、全凈膛重和半凈膛重4個性狀顯著相關(guān)。此外，位于1號染色體上的rs15368284與胸肌重、腿肌重、全凈膛重和半凈膛重4個性狀顯著相關(guān)，位于2號染色體上的rs14210468與活體重、屠體重、全凈膛重和半凈膛重顯著相關(guān)。這些影響多個屠宰性狀的SNPs也具有更高的研究價值，其所在基因可能為重要候選基因。

表2 質(zhì)控后SNPs信息統(tǒng)計

Table 2 Basic statistics of SNPs after quality control

染色體Chromosome物理圖譜/MbPhysicalmapSNPs數(shù)/個No．ofSNPsSNP密度/(kb·SNP-1)SNPdensity1200．95724427．742154．79546628．323113．62416527．28494．20339627．74562．23219228．39635．84172920．73738．30182920．94830．56135022．64924．02118720．241022．42130217．221121．87124117．621220．46140314．581318．27118615．411415．76101815．521512．93102912．56160．421137．991710．6184612．551810．8585712．66199．9083011．932013．9214849．38216．867668．95223．9030012．99236．0260110．02246．387438．58252．0216812．00265．076407．82274．8347910．07284．475607．99LGE22C19W28＿E50C230．881098．10LGE640．0236．00z74．58194238．40005890Total1026．954666522．04

表3 京海黃雞體組成性狀的顯著SNPs位點

Table 3 Significant SNPs for body composition traits in Jinghai Yellow chicken

性狀TraitSNP染色體Chromosome位置/bpPosition等位基因Allele最小基因頻率MAFP值Pvalue最近基因NearestgenesBWrs16023603475511560AC0．37503．19E?08NCAPGrs14710787475506561GA0．35486．24E?08NCAPGFWrs16023603475511560AC0．37506．28E?10NCAPGrs14710787475506561GA0．35486．05E?09NCAPGrs15540258434549951CT0．22476．53E?08FAM13Ars14490981475328284AG0．29671．27E?07LCORLrs14623099728298959CT0．34472．16E?07INSIG2rs14491150475878632CT0．20635．37E?07LDB2GGaluGA265809474348560TC0．43296．18E?07KCNIP4GGaluGA2714895188004AG0．20711．22E?06未知WWrs16023603475511560AC0．37506．22E?08NCAPGrs14710787475506561GA0．35481．20E?07NCAPGrs13755802524218477AG0．23369．27E?07TYRO3BMWrs153682841103569548TC0．29871．04E?06GRIK1LMWrs16023603475511560AC0．37507．33E?07NCAPGrs14710787475506561GA0．35481．33E?06NCAPGAWrs15630799121468774CT0．43063．81E?07CACNA2D2rs14162502234138769TC0．065823．98E?07CHN2AWPrs15630799121468774CT0．43063．42E?08CACNA2D2rs14162502234138769TC0．065821．19E?06CHN2rs14089935154913876AG0．31141．27E?06ATP6V0A2EWrs14710787475506561GA0．35483．15E?07NCAPGrs16023603475511560AC0．37504．43E?07NCAPGSEWrs14710787475506561GA0．35481．92E?07NCAPGrs16023603475511560AC0．37502．35E?07NCAPG

本研究篩選出與體組成性狀關(guān)聯(lián)顯著的13個位點主要位于4號染色體上74.3～75.5 Mb區(qū)域內(nèi)，130個潛在顯著地位點中有25個集中位于4號染色體71.4～78.9 Mb區(qū)域，這表明4號染色體的71.5～78.9 Mb區(qū)域?qū)┖｜S雞體組成具有重要的調(diào)控作用，這與之前報道的生長和屠宰性狀的GWAS結(jié)果是一致的。X.Gu等[6]對烏骨雞-白洛克雞組建的F2代資源群進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)4號染色體 71.6～80.2 Mb區(qū)域與7～14周齡體重和日增重顯著相關(guān)。L.Xie等[7]對F2代資源群進(jìn)行GWAS分析，在該區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)一些與生長性狀潛在顯著關(guān)聯(lián)的位點，而R.Liu等[11]對北京油雞的屠宰性狀進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)78.4～79.5 Mb區(qū)域與屠體重和全凈膛重關(guān)聯(lián)顯著。這也說明該區(qū)域?qū)﹄u生長和屠宰都具有重要的調(diào)節(jié)作用。

X軸1～28表示1～28號染色體，29、30和31分別代表LGE22、LGE64染色體片段和Z染色體；圖中上線代表潛在顯著的閾值(3.59E-5)，下線代表全基因組顯著的閾值(1.80E-06)1-28 on the x-axis indicate chromosomes 1-28，and 29，30 and 31 indicate LGE22，LGE64 and chromosome Z，respectively.The upper line in each figure shows the potential significant threshold：-log10(3.59E-5)，and the lower one shows the genome-wide significant threshold：-log10(1.80E-06)圖2 體組成性狀全基因組顯著位點的曼哈頓圖Fig.2 Manhttan plots for the body composition triats with genome-wide significant SNPs

和半凈膛重顯著相關(guān)。這些影響多個屠宰性狀的SNPs也具有更高的研究價值，其所在基因可能為重要候選基因。

本研究篩選出與體組成性狀關(guān)聯(lián)顯著的13個位點主要位于4號染色體上74.3～75.5 Mb區(qū)域內(nèi)，130個潛在顯著地位點中有25個集中位于4號染色體71.4～78.9 Mb區(qū)域，這表明4號染色體的71.5～78.9 Mb區(qū)域?qū)┖｜S雞體組成具有重要的調(diào)控作用，這與之前報道的生長和屠宰性狀的GWAS的結(jié)果是一致的。X.Gu等[6]對烏骨雞-白洛克雞組建的F2代資源群進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)4號染色體 71.6～80.2 Mb區(qū)域與7～14周齡體重和日增重顯著相關(guān)。L.Xie等[7]對F2代資源群進(jìn)行GWAS分析，在該區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)一些與生長性狀潛在顯著關(guān)聯(lián)的位點，而R.Liu[11]對北京油雞的屠宰性狀進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)78.4～79.5 Mb區(qū)域與屠體重和全凈膛重關(guān)聯(lián)顯著。這也說明該區(qū)域?qū)﹄u生長和屠宰都具有重要的調(diào)節(jié)作用。

從NCBI和Ensembl獲取每個顯著SNP周圍1 Mb區(qū)域內(nèi)的最近基因作為影響體組成性狀的可能候選基因。最終，共找到13個可能的候選功能基因，這些基因中，NCAPG基因?qū)钪?、腳重、翅重、腿肌重、全凈膛重和半凈膛重6個性狀有顯著影響，說明NCAPG基因可能為影響京海黃雞體組成的重要候選基因。同時，GRIK1基因內(nèi)的SNP對胸肌重有顯著影響，CACNA2D2基因內(nèi)的SNP對腹脂重和腹脂率有顯著影響。以上結(jié)果表明，NCAPG、GRIK1和CACNA2D2基因可能為影響京海黃雞體組成的重要候選基因。

NCAPG基因是編碼凝縮蛋白復(fù)合體的一個亞基，該復(fù)合體在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中，調(diào)節(jié)染色體的穩(wěn)定和壓縮。有報道顯示，牛的NCAPG基因是影響牛體型和屠宰性狀的一個新的候選基因，該基因內(nèi)部的SNPs能夠影響不同品種牛不同時期的體重、體型以及屠宰性狀[19-24]，目前該基因的研究在雞上尚未見報道。GRIK1同時被稱為GluR5，是哺乳動物主要的神經(jīng)遞質(zhì)受體，參與多種日常神經(jīng)的生理過程。GluR5和家族成員GluR6、GluR7的蛋白形成同聚體時可形成功能性的離子通道[25]，該基因被認(rèn)為是抗癲癇的重要候選基因[26-28]。CACNA2D2基因表達(dá)的蛋白屬于L型鈣離子通道復(fù)合體蛋白。L型鈣離子通道復(fù)合體由α1、α2δ、β和γ亞基以1∶1∶1∶1比例組成。該復(fù)合體通過調(diào)節(jié)Ca離子轉(zhuǎn)運，從而進(jìn)行細(xì)胞調(diào)節(jié)[29-30]。CACNA2D2編碼α2δ亞基，是α2δ蛋白的一個亞型，該基因被認(rèn)為是多種腫瘤的抑制基因，此外，一些研究人員發(fā)現(xiàn)，另外一個亞型編碼基因CACNA2D1是牛屠宰性狀和肉品質(zhì)性狀的重要候選基因[31-33]。

圖3 京海黃雞體組成性狀的QQ圖Fig.3 QQ-plot of body composition traits of Jinghai Yellow chicken

表4 與超過兩個體組成性狀相關(guān)的SNPs

Table 4 SNPs associated with more than 2 body composition traits

名稱SNPID染色體Chromosome位置/bpPosition最近基因Nearestgenes性狀TraitP值Pvaluers153682841107693816GRIK1BMW1．04E?06LMW2．29E?06SEW3．71E?06EW5．12E?06rs14210468283654288LOC101750191CW2．20E?06EW9．81E?06SEW1．10E?05BW663．40E?05rs14490981478563545LOC101750905FW1．27E?07SEW9．59E?06EW2．05E?05BW662．07E?05rs14710787478797460FAM184BFW6．05E?09BW666．24E?08WW1．20E?07SEW1．92E?07EW3．15E?07LMW1．33E?06CW3．34E?05rs16023603478802461FAM184BFW6．28E?10BW663．19E?08WW6．22E?08SEW2．35E?07EW4．43E?07LMW7．33E?07CW1．74E?05BMW2．26E?05

本研究中，單倍型分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)了14個與6個屠宰性狀關(guān)聯(lián)顯著的單倍型，這些顯著的單倍型中，有7個單倍型由顯著的SNPs構(gòu)建而成。其他6個關(guān)聯(lián)顯著的單倍型并不含有顯著SNPs，這一方面證明了關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，另一方面還說明，單倍型分析綜合考慮多個等位基因，能夠發(fā)現(xiàn)SNP關(guān)聯(lián)分析所不能發(fā)現(xiàn)的位點。此外，本研究發(fā)現(xiàn)的14個單倍型中，有9個單倍型位于4號染色體74.3～75.9 Mb區(qū)域內(nèi)，影響活體重、腳重、翅重和半凈膛重。說明4號染色體74.3～75.9 Mb是影響京海黃雞體組成性狀的一個重要區(qū)域。該區(qū)域內(nèi)共發(fā)現(xiàn)了15個與體組成性狀關(guān)聯(lián)顯著的SNPs，這進(jìn)一步說明了該區(qū)域?qū)﹄u體組成性狀的重要性。這一區(qū)域單倍型涉及到的基因有LDB2、LCORL、QDPR、KCNIP4和FAM184B。LDB2基因通過與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，參與血管形成和腦的發(fā)育過程[34-35]。X.Gu等[6，36]對雞生長性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究均報道了該基因。LCORL基因能夠影響精子發(fā)生，該基因內(nèi)的多態(tài)位點與成年人骨骼尺寸及身高關(guān)聯(lián)顯著[37]。吳丹[36]對雞生長性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析中報道了該基因。QDPR基因編碼二氫喋啶還原酶，該基因功能的報道較少。KCNIP4編碼蛋白是一種K離子通道互作蛋白，K離子通道具有廣泛的生理調(diào)節(jié)作用，包括神經(jīng)遞質(zhì)釋放、平滑肌收縮、心率調(diào)節(jié)和胰島素分泌等[38-39]。FAM184B的研究較少，有研究表明，該基因與牛的采食、日增重和屠體重顯著相關(guān)[40]。

表5 與京海黃雞體組成性狀顯著相關(guān)的單倍型

Table 5 Significant haplotypes associated with body composition traits in Jinghai Yellow chicken

性狀Trait染色體ChromosomeSNPⅠ位置Ⅰ/bpPositionⅠSNPⅡ位置Ⅱ/bpPositionⅡBW664GGaluGA26596975407174rs1602360375511560FW4rs1449115075878632rs13663919758885934GGaluGA00155875575851GGaluGA001559755758554GGaluGA00155875575851GGaluGA001559755758554GGaluGA26580674347058GGaluGA265809743485604GGaluGA26595775317389rs14490981753282844GGaluGA26596975407174rs1602360375511560WW4GGaluGA26596975407174rs160236037551156013rs1406017011175823rs1569980511184629AW21rs161793112725645rs142833102726966Zrs1373401723821902rs1610496124024728AWP15rs150200284911528rs140899354913876Zrs1373401723821902rs1610496124024728SEW4GGaluGA26596975407174rs1602360375511560性狀Trait染色體Chromosome單倍型Haplotype頻率FrequencyP值PvalueBW664CATTGA0．3462．10E?07FW4CC0．2061．53E?074AG0．3331．10E?074GA0．6671．10E?074CT0．4333．36E?074AA0．292．03E?084CATTGA0．3462．34E?09WW4CATTGA0．3462．63E?0713CC0．5582．55E?07AW21CA0．5211．69E?06ZGATACATC0．3661．59E?07AWP15CA0．3111．64E?06ZGATACATC0．3662．97E?08SEW4CATTGA0．3461．18E?06

4 結(jié) 論

本試驗對京海黃雞體組成性狀進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，共篩選出13個與體組成性狀達(dá)到全基因組顯著關(guān)聯(lián)的SNPs，130個達(dá)到全基因組潛在顯著地SNPs。位于4號染色體的71.5～78.9 Mb區(qū)域內(nèi)有多個SNPs與多個屠宰性狀關(guān)聯(lián)顯著，表明該區(qū)域可能為影響京海黃雞體組成的重要候選區(qū)域，同時，在顯著SNPs附近篩選出12個可能的候選基因。

[1] 程篤學(xué).豬肉質(zhì)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012. CHENG D X.Genome-wide association study for meat trait in swine[D].Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2012.(in Chinese)

[2] ABASHT B，LAMONT S.Genome-wide association analysis reveals cryptic alleles as an important factor in heterosis for fatness in chicken F2 population[J].AnimGenet，2007，38(5)：491-498.

[3] ATZMON G，BLUM S，F(xiàn)ELDMAN M，et al.QTLs detected in a multigenerational resource chicken population[J].JHeredity，2008，99(5)：528-538.

[4] FANG M，Q NIE，C LUO，et al.Associations ofGHSRgene polymorphisms with chicken growth and carcass traits[J].MolBiolRep，2010，37(1)：423-428.

[5] TANG S,OU J,SUN D，et al.A novel 62‐bp indel mutation in the promoter region of transforming growth factor‐beta 2(TGFB2) gene is associated with body weight in chickens[J].AnimGenet，2011，42(1)：108-112.

[6] GU X，F(xiàn)ENG C，MA L，et al.Genome-wide association study of body weight in chicken F2 resource population[J].PLoSONE，2011，6(7)：e21872.

[7] XIE L，LUO C，ZHANG C，et al.Genome-wide association study identified a narrow chromosome 1 region associated with chicken growth traits[J].PLoSONE，2012，7(2)：e30910.

[8] LIU W，LI D，LIU J，et al.A genome-wide SNP scan reveals novel loci for egg production and quality traits in white leghorn and brown-egg dwarf layers[J].PLoSONE，2011，6(12)：e28600.

[9] WOLC A，ARANGO J，SETTAR P，et al.Genom-wide association analysis and genetic architecture of egg weight and egg uniformity in layer chickens[J].AnimGenet，2012，43(S1)：87-96.

[10] NOORAI R E，F(xiàn)REESE N H，WRIGHT L M，et al.Genome-wide association mapping and identification of candidate genes for the rumpless and ear-tufted traits of the araucana chicken[J].PLoSONE，2012，7(7)：e40974.

[11] LIU R，SUN Y，ZHAO G，et al.Genome-wide association study identifies loci and candidate genes for body composition and meat quality traits in Beijing-You chickens[J].PLoSONE，2013，8(4)：e61172.

[12] LI D F，LIAN L，QU L J，et al.A genome-wide SNP scan reveals two loci associated with the chicken resistance to Marek’s disease[J].AnimGenet，2013，44(2)：217-222.

[13] LUO C，QU H，MA J，et al.Genome-wide association study of antibody response to Newcastle disease virus in chicken[J].BMCGenet，2013，14(1)：42.

[14] PURCELL S，NEALE B，TODD-BROWN K，et al.PLINK：a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses[J].AmJHumGenet，2007，81(3)：559-575.

[15] WANG D，SUN Y，STANG P，et al.Comparison of methods for correcting population stratification in a genome-wide association study of rheumatoid arthritis：principal- component analysis versus multidimensional scaling[J].BMCProceed，2009，3(Suppl 7)：S109.

[16] WALL M E，A RECHTSTEINER，L M ROCHA.Singular value decomposition and principal component analysis.A practical approach to microarray data analysis[M].US：Springer，2003：91-109.

[17] RAMOS A M，CROOIJMANS R P，AFFARA N A，et al.Design of a high density SNP genotyping assay in the pig using SNPs identified and characterized by next generation sequencing technology[J].PLoSONE，2009，4(8)：e6524.

[18] JOHNSON R C，NELSON G W，TROYER J L，et al.Accounting for multiple comparisons in a genome-wide association study(GWAS)[J].BMCGenomics，2010，11：724.

[19] EBERLEIN A，TAKASUGA A，SETOGUCHI K，et al.Dissection of genetic factors modulating fetal growth in cattle indicates a substantial role of the non-SMC condensin I complex，subunit G(NCAPG) gene[J].Genetics，2009，183(3)：951-964.

[20] GLENSKE K，BRANDT H，ERHARDT G.Association of the Ile-442-Met substitution inNCAPGwith birth weight in German Angus and German Simmental cattle(Brief Report)[J].ArchivfurTierzucht-ArchAnimBreed，2011，54(1)：104-106.

[21] PAUSCH H，F(xiàn)LISIKOWSKI K，JUNG S，et al.Genome-wide association study identifies two major loci affecting calving ease and growth-related traits in cattle[J].Genetics，2011，187(1)：289-297.

[22] SETOGUCHI K，F(xiàn)URUTA M，HIRANO T，et al.Cross-breed comparisons identified a critical 591-kb region for bovine carcass weight QTL(CW-2) on chromosome 6 and the Ile-442-Met substitution in NCAPG as a positional candidate[J].BMCGenet，2009，10(1)：43.

[23] SETOGUCHI K，WATANABE T，WEIKARD R，et al.The SNP c.1326T> G in the non‐SMC condensin I complex，subunit G(NCAPG) gene encoding a p.Ile442Met variant is associated with an increase in body frame size at puberty in cattle[J].AnimGenet，2011，42(6)：650-655.

[24] SORANZO N，RIVADENEIRA F，CHINAPPEN-HORSLEY U，et al.Meta-analysis of genome-wide scans for human adult stature identifies novel Loci and associations with measures of skeletal frame size[J].PLoSGenet，2009，5(4)：e1000445.

[25] MAYER M L.Crystal structures of theGluR5 andGluR6 ligand binding cores：molecular mechanisms underlying kainate receptor selectivity[J].Neuron，2005，45(4)：539-552.

[26] MULLE C，SAILER A，PéREZ-OTAO I，et al.Altered synaptic physiology and reduced susceptibility to kainate-induced seizures inGluR6-deficient mice[J].Nature，1998，392(6676)：601-605.

[27] ROGAWSKI M A，GRYDER D，CASTANEDA D，et al.GluR5 kainate receptors，seizures，and the amygdala[J].AnnalsNewYorkAcadSci，2003，985(1)：150-162.

[28] SMOLDERS I，BORTOLOTTO Z A，CLARKE V R，et al.Antagonists ofGLUK5-containing kainate receptors prevent pilocarpine-induced limbic seizures[J].NatNeurosci，2002，5(8)：796-804.

[29] DAVIES A，HENDRICH J，VAN MINH A T，et al.Functional biology of the alpha(2)deltasubunits of voltage-gated calcium channels[J].TrendsPharmacolSci，2007，28(5)：220-228.

[30] HOU G Y，YUAN Z R，GAO X，et al.Genetic polymorphisms of theCACNA2D1 gene and their association with carcass and meat quality traits in cattle[J].BiochemGenet，2010，48(9-10)：751-759.

[31] BIGOS K L，MATTAY V S，CALLICOTT J H，et al.Genetic variation inCACNA1Caffects brain circuitries related to mental illness[J].ArchGeneralPsychiat，2010，67(9)：939-945.

[32] GUTIéRREZ-GIL B，WILLIAMS J，HOMER D，et al.Search for quantitative trait loci affecting growth and carcass traits in a cross population of beef and dairy cattle[J].JAnimSci，2009，87(1)：24-36.

[33] LI J，YANG M，XU N.Single nucleotide polymorphism in 3UTR of porcineCACNA2D1 gene and its genetic effect on meat quality traits[J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica，2007，22(4)：76-79.

[34] JAVERZAT S，F(xiàn)RANCO M，HERBERT J，et al.Correlating global gene regulation to angiogenesis in the developing chick extra-embryonic vascular system[J].PLoSONE，2009，4(11)：e7856.

[35] OSTENDORFF H P，TURSUN B，CORNILS K，et al.Dynamic expression of LIM cofactors in the developing mouse neural tube[J].DevDynamics，2006，235(3)：786-791.

[36] 吳 丹.北京油雞體重和屠體性狀的全基因組關(guān)聯(lián)研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012. WU D.Genome-wide association study of loci affecting body weight and carcass traits in Beijing-You Chickens[D].Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2012.(in Chinese)

[37] SORANZO N，RIVADENEIRA F，CHINAPPEN-HORSLEY U，et al.Meta-analysis of genome-wide scans for human adult stature identifies novel Loci and associations with measures of skeletal frame size[J].PLoSGenet，2009，5(4)：e1000445.

[38] BONNE A，VREEDE L，KUIPER R P，et al.Mapping of constitutional translocation breakpoints in renal cell cancer patients：identification of KCNIP4 as a candidate gene[J].CancerGenetCytogenet，2007，179(1)：11-18.

[39] HIMES B E，SHEPPARD K，BERNDT A，et al.Integration of mouse and human genome-wide association data identifies KCNIP4 as an asthma gene[J].PLoSONE，2013，8(2)：e56179.

[40] LINDHOLM-PERRY A K，SEXTEN A K，KUEHN L A，et al.Association，effects and validation of polymorphisms within the NCAPG-LCORL locus located on BTA6 with feed intake，gain，meat and carcass traits in beef cattle[J].BMCGenet，2011，12(1)：103.

(編輯 郭云雁)

A Genome-wide Association Study on Body Composition of Jinghai Yellow Chicken

ZHANG Tao1，2，F(xiàn)AN Qing-can1，2，ZHANG Xiang-qian1，2，ZHANG Gen-xi1，2， WANG Jin-yu1，2*，GU Yu-ping3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China； 2.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，Breeding，ReproductionandMolecularDesignofJiangsuProvince，Yangzhou225009，China；3.JiangsuJinghaiPoultryGroupCo.，Ltd.，Nantong226103，China)

To scan SNPs and candidate genes affecting body composition traits and provide new methods for further genetic improvement of Jinghai Yellow chicken，a genome-wide association study on 13 body composition traits was carried out using the Illumina chicken 60K SNP Beadchip in Jinghai Yellow chicken in the present study.The result showed that a total of 13 SNPs reached 5% Bonferroni genome-wide significant level(P<1.8E-6) and 130 SNPs reached “suggestive” genome-wide significant level(P<3.59E-5) with body composition traits.The 13 significant SNPs were located nearby or in 12 candidate genes includingGRIK1，NCAPG，KCNIP4，CACNA2D2，and so on，among which 6 SNPs were located in a region approximately 1.6 Mb in length on chicken chromosome 4(74.3-75.9 Mb).Among the 130 “suggestive” significant SNPs，25 SNPs were located in a region 7.4 Mb(71.5-78.9 Mb) in length on chicken chromosome 4.5 650 haplotpyes were established and 14 of them were found to be associated with 6 body composition traits.Nine out of 14 haplotypes were located in the region of 74.3-75.9 Mb on chicken chromosome 4.Five candidate genes ofLCORL，QDPR，KCNIP4，LDB2 andFAM184Bwere located in this region.The present study suggested that genes located in the region of 71.5-78.9 Mb on chicken chromosome 4 andGRIK1，NCAPG，KCNIP4，CACNA2D2，LCORL，QDPR，KCNIP4，LDB2，F(xiàn)AM184Bgenes might play important role in regulation of body composition of Jinghai Yellow chicken.

Jinghai Yellow chicken；GWAS；body composition；haplotype

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.004

2014-10-13

國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(nycytx-42-G1-05)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程；江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室

張 濤(1990-)，男，山東臨沂人，博士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：zt991279320@126.com

*通信作者：王金玉，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：jywang@yzu.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)09-1502-13