鄧鵬程，鄺滿元，王岐本，張如勝

（1.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖教研室，湖南郴州423000；2.長(zhǎng)沙市疾病預(yù)防控制中心，湖南410001）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法與臨床常規(guī)方法檢測(cè)淋球菌效果比較

鄧鵬程1，鄺滿元1，王岐本1，張如勝2

（1.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖教研室，湖南郴州423000；2.長(zhǎng)沙市疾病預(yù)防控制中心，湖南410001）

目的將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）法與涂片及細(xì)菌培養(yǎng)法2種臨床常規(guī)檢測(cè)淋球菌的方法進(jìn)行比較研究，探討LAMP法用于快速診斷淋球菌感染的可行性。方法同時(shí)采用LAMP法與涂片及細(xì)菌培養(yǎng)2種方法，對(duì)2011年10月至2013年8月長(zhǎng)沙市疾病預(yù)防控制中心性病門診疑似淋菌感染患者86例的生殖道分泌物進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)3種檢測(cè)方法分別獲得的陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果運(yùn)用LAMP法檢測(cè)得到淋球菌陽(yáng)性率[91%（78/86）]高于涂片法[60%（52/ 86）]和細(xì)菌培養(yǎng)法[53%（46/86）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論使用LAMP法檢測(cè)淋球菌具有快速、簡(jiǎn)便、直觀、特異、敏感及不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，有望成為一種新型實(shí)用的淋球菌核酸檢測(cè)手段。

奈瑟球菌，淋病； 基因擴(kuò)增； 培養(yǎng)技術(shù)； 涂片

淋病是淋病奈瑟菌（簡(jiǎn)稱淋球菌）引起的以泌尿生殖系統(tǒng)化膿性感染為主要表現(xiàn)的性傳播疾病，其發(fā)病率高居我國(guó)性傳播疾病第2位。比較不同的淋球菌檢測(cè)方法并研發(fā)快速、高效的診斷方法，對(duì)于患者能進(jìn)行及時(shí)有效的治療和避免其在人群中快速傳播均意義重大。針對(duì)淋球菌的檢測(cè)，臨床常規(guī)檢測(cè)采用的是涂片法和細(xì)菌培養(yǎng)法。2010年國(guó)內(nèi)學(xué)者崔亞利等[1]以淋球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）法擴(kuò)增，成功建立了檢測(cè)淋球菌基因的LAMP法，為淋球菌的快速檢測(cè)提供了新的手段。為了比較用LAMP法和臨床常規(guī)方法檢測(cè)淋球菌的效果，本研究組同時(shí)運(yùn)用這3種技術(shù)對(duì)86例疑似淋菌感染患者的泌尿生殖道分泌物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 本組研究對(duì)象為2011年10月至2013年8月在長(zhǎng)沙市疾病預(yù)防控制中心性病門診就診的86例泌尿生殖系統(tǒng)感染患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：曾有不潔性生活史且尿道口或生殖道有明顯的膿性分泌物，經(jīng)主治醫(yī)師以上級(jí)別的醫(yī)生診斷疑為淋病患者，其中男56例，女30例；年齡18～58歲。

1.1.2 標(biāo)本采集

1.1.2.1 女性患者 月經(jīng)干凈后10～14 d，將采樣無(wú)菌棉拭子（常規(guī)檢查一般用生理鹽水浸濕的棉拭子取材）置于陰道深部或陰道后穹隆轉(zhuǎn)動(dòng)并停留10～30 s取分泌物。

1.1.2.2 男性患者 將采樣無(wú)菌棉拭子深入到距離男性患者尿道口2～3 cm處，輕輕轉(zhuǎn)運(yùn)并停留10～15 s取出帶有黏膜細(xì)胞的膿性分泌物。

1.2 方法

1.2.1 涂片法 將淋病患者的泌尿生殖道分泌物標(biāo)本涂片經(jīng)革蘭染色后，在顯微鏡下觀察多核白細(xì)胞，其內(nèi)有革蘭陰性雙球菌出現(xiàn)診斷為陽(yáng)性。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)法 標(biāo)本采集后立即分區(qū)接種于經(jīng)室溫（25℃）平衡的選擇性培養(yǎng)基中，接種后的平皿置于35～36℃、5%CO2和濕度大于70%的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行24～28 h菌株培養(yǎng)，再通過(guò)半自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)標(biāo)本進(jìn)行鑒定。

1.2.3 LAMP法 LAMP檢測(cè)采用深圳博睿祥輝生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的通用型LAMP反應(yīng)液試劑盒，標(biāo)本DNA提取和LAMP擴(kuò)增均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，主要操作步驟為：反應(yīng)模板DNA提取，將棉拭子采集的標(biāo)本置于1mL生理鹽水的無(wú)菌離心管中浸泡10min，管內(nèi)壁擠干丟棄，離心10min，棄上清液，加入終質(zhì)量濃度0.1 g/L蛋白酶K和終濃度1%十二烷基磺酸鈉（SDS），55℃水浴60min，酚氯仿法提取目標(biāo)基因。引物設(shè)計(jì)，利用Primer-ExplorerV3軟件設(shè)計(jì)淋球菌16S rRNA基因的引物，16S rRNA是16S核糖體rRNA基因，其特點(diǎn)是穩(wěn)定，在細(xì)胞內(nèi)含量較高，具有特異性和敏感性。16S rRNA：F3 GCGGTGGATGATGTGGATT，B3 CCGGCAGTCTCATTAGAGTG，F(xiàn)IP CTCCTCCGTCTCCGGAGGATTCGATGCAACGCGAAGAACCT，BIP TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT-CCCAACCGAATGATGGCA，LF CGCACATGTCAAAACCAGGTA，LB GTTGGGTTAAGTCCCGCAACG。LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系建立：引物BIP和FIP各2μL，F(xiàn)3及B3各0.2μL，LF和LB各1μL，10mmol/L的dNTPs 4μL，5mol/L的betaine4μL，160mmol/L的MgSO41μL，10×BstDNA Polymerase Buffer2.5μL，BstDNA Polymerase8 U，DNA模板 2μL，加雙蒸水（ddH2O）至反應(yīng)液為25μL，置于恒溫（65℃）水浴箱經(jīng)60min完成擴(kuò)增反應(yīng)，后將其迅速置于80℃水浴箱反應(yīng)2min終止反應(yīng)。加SYBRGreen 1μL，肉眼觀察顏色變化，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)管變綠為淋球菌陽(yáng)性，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)管呈現(xiàn)棕色則為淋球菌陰性。取擴(kuò)增產(chǎn)物1.5μL經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)梯狀條帶出現(xiàn)判斷結(jié)果，檢測(cè)管擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后呈梯狀條帶為淋球菌陽(yáng)性，而檢測(cè)管擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后未出現(xiàn)梯狀條帶為淋球菌陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

LAMP技術(shù)檢測(cè)的淋球菌陽(yáng)性率明顯高于涂片及細(xì)菌培養(yǎng)法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3種淋球菌檢測(cè)方法結(jié)果

3 討 論

淋病是由淋球菌所引起的一種泌尿生殖道黏膜傳染性疾病，淋病的病原菌為淋球菌，是一種革蘭陰性雙球菌，呈卵圓或腎形，成對(duì)排列。淋病潛伏期為2～10 d，在臨床上有5%～2%的男性和60%的女性感染后可無(wú)明顯癥狀，如不及時(shí)診斷與治療，常誘發(fā)不孕不育癥、性功能障礙及其他各種并發(fā)癥。淋病通過(guò)性接觸直接傳染，也可通過(guò)患者分泌物污染物及醫(yī)療器械間接傳染，特別是幼女常通過(guò)間接途徑感染，新生兒可通過(guò)患淋病母親的產(chǎn)道感染，引起淋菌性結(jié)膜炎，如延誤治療，可能導(dǎo)致失明。淋病在人群中的快速傳播極其嚴(yán)重的危害不容忽視，開(kāi)發(fā)快速準(zhǔn)確的淋球菌檢測(cè)方法意義重大。

目前臨床上較常用的淋球菌檢測(cè)法是涂片和細(xì)菌培養(yǎng)法，男性急性淋病直接涂片檢測(cè)到多形核白細(xì)胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌即可成立診斷，不足之處是對(duì)慢性患者靈敏度較低，而女性陰道分泌物中雜菌多，大大降低了敏感性和特異性，陽(yáng)性率不高且有假陽(yáng)性。培養(yǎng)出淋球菌是診斷淋病的重要佐證，細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)癥狀很輕或無(wú)癥狀的男性及女性患者都是較好的方法，只要培養(yǎng)陽(yáng)性就可確診，但培養(yǎng)法耗時(shí)且很受患者用藥影響。細(xì)菌培養(yǎng)法是世界衛(wèi)生組織推薦淋球菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，但在臨床工作中，用細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)淋球菌受到操作技術(shù)、菌株存活環(huán)境、檢測(cè)時(shí)間、試劑質(zhì)量以及患者在檢測(cè)前是否使用過(guò)抗生素等因素的限制[2]。

20世紀(jì)90年代以來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR檢測(cè)技術(shù)逐漸被運(yùn)用于淋球菌的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中，根據(jù)淋球菌的特異基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)淋球菌進(jìn)行PCR檢測(cè)逐漸成為傳統(tǒng)的涂片和淋菌培養(yǎng)法的協(xié)助診斷方法。PCR法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，不斷應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)，但針對(duì)淋球菌性淋病的PCR仍有一些限制，比如，費(fèi)用昂貴、污染的風(fēng)險(xiǎn)、不能提供抗生素抵抗的信息等。此外，還有序列相關(guān)性限制，尤其是假陽(yáng)性結(jié)果是一個(gè)主要需要考慮的問(wèn)題[3]。因此，需要新的檢測(cè)技術(shù)，LAMP法是2000年Notomi等[4]報(bào)道的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，其針對(duì)靶序列上的特異區(qū)域設(shè)計(jì)引物，用具有鏈置換活性的DNA聚合酶快速擴(kuò)增目的基因片段，形成大量具有大小不等莖環(huán)結(jié)構(gòu)的基因片段。其特異性強(qiáng)，快速高效擴(kuò)增，在30～60min內(nèi)擴(kuò)增出109～1010倍的目的基因，擴(kuò)增速度比傳統(tǒng)PCR高出2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，LAMP反應(yīng)還產(chǎn)生大量白色的焦磷酸鎂沉淀，肉眼觀察即可見(jiàn)沉淀，加SYBRGreen 1μL后反應(yīng)管顏色明顯變化，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)管變綠為陽(yáng)性，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)管呈現(xiàn)棕色則為陰性。取擴(kuò)增產(chǎn)物1.5μL經(jīng)2%～3%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)梯狀條帶出現(xiàn)即可判斷結(jié)果，檢測(cè)管擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后呈梯狀條帶則為陽(yáng)性，檢測(cè)管擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后未出現(xiàn)梯狀條帶則為陰性，結(jié)果易于鑒定，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)在恒溫下即可進(jìn)行，只需一臺(tái)恒溫箱，不要需昂貴的設(shè)備，操作簡(jiǎn)單方便而耗時(shí)少[5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多科研工作者[6-8]，應(yīng)用LAMP技術(shù)成功對(duì)炭疽芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌等細(xì)菌類病原微生物進(jìn)行檢測(cè)，而且通過(guò)對(duì)眾多細(xì)菌研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)PCR相比，LAMP法不僅快速、敏感，而且具有良好的特異性[9]。

本研究采用LAMP法對(duì)淋球菌特有16S rRNA基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行快速擴(kuò)增檢測(cè)淋球菌，通過(guò)對(duì)比3種檢測(cè)方法得出：運(yùn)用LAMP法、涂片及細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)到的淋球菌陽(yáng)性率分別為91%、60%和53%，用LAMP法檢測(cè)的淋球菌陽(yáng)性率明顯高于涂片及細(xì)菌培養(yǎng)法。與PCR技術(shù)相比，新型的LAMP法無(wú)需昂貴、精密的PCR儀器設(shè)備，也不需要DNA的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間的溫度循環(huán)以及一級(jí)產(chǎn)物后續(xù)檢測(cè)等步驟，LAMP法更為快速，而且操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本更低。

在實(shí)驗(yàn)個(gè)程中，本研究組對(duì)淋球菌檢出陽(yáng)性患者進(jìn)行追蹤回返，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)抗淋球菌治療后，患者疾病都有明顯好轉(zhuǎn)或痊愈，從而最大可能避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)。

綜上所述，LAMP法與臨床常用的涂片和細(xì)菌培養(yǎng)法相比，具有更高檢出率，可大幅度降低漏診且不受患者用藥影響，使用LAMP法檢測(cè)淋球菌具有快速（1 h）、簡(jiǎn)便（只需要1臺(tái)普通恒溫水箱）、直觀（肉眼可以觀察結(jié)果）、特異、敏感及不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，為淋球菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)提供了一種新的手段，有望成為臨床上淋球菌常規(guī)檢測(cè)的簡(jiǎn)便方法，特別是對(duì)條件不理想的基層疾控和醫(yī)療機(jī)構(gòu)淋病檢測(cè)的普及具有重要意義。

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2010年湖南省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（10C1240）。

鄧鵬程（1975-），男，湖南桂陽(yáng)人，碩士研究生，講師，主要從事分子寄生蟲(chóng)學(xué)、解剖教學(xué)與研究；E-mail：dpch333@163.com。