胡 雪，余 捷

(1．武漢市第十一醫(yī)院，武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院藥劑科，湖北武漢 430015;

2．武漢市第一醫(yī)院門(mén)診藥劑科，湖北 武漢 430022)

1974年由意大利史克比切姆公司最先合成，是一種促智藥［2]，目前上市劑型有片劑和注射液，奧拉西坦注射液于1990年在意大利上市，規(guī)格為5 mL∶1 g，奧拉西坦藥理作用廣泛，可有效改善患者的記憶學(xué)習(xí)能力［3－4]，臨床上用于腦損傷及引起的神經(jīng)功能缺失、記憶與智能障礙等癥的治療［5－6]，特別對(duì)預(yù)防老年人癡呆癥有顯著療效［7]。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)有多家廠家生產(chǎn)奧拉西坦注射液，商品名有“歐蘭同”，“倍清星”等。本文使用氰基鍵合硅膠柱建立了高效液相色譜法檢測(cè)奧拉西坦注射液的有關(guān)物質(zhì)，并對(duì)奧拉西坦注射液進(jìn)行了影響因素試驗(yàn)和加速試驗(yàn)，考察了奧拉西坦注射液的穩(wěn)定性。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 BT124S型十萬(wàn)分之一分析天平(Sartorius公司);UV2600紫外分光光度計(jì)(島津);pHS－3C酸度計(jì)(上海精科);LC－10AT島津高效液相色譜儀(LC－10AT泵、SPD－10A紫外檢測(cè)器，日本島津株式會(huì)社，配有島津工作站)。

1．2 試藥 奧拉西坦對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)101032－201301);奧拉西坦注射液(自制，規(guī)格 5 mL∶1．0 g，批號(hào) 140607，140618，20140701，20140702，20140703);磷酸氫二鉀(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠);乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher)，磷酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 色譜柱:氰基鍵合硅膠柱 (300 mm×4．6 mm，填料孔徑 5μm);流動(dòng)相;乙腈 －5 mmol·L－1;磷酸氫二鉀－(5∶95)(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至 5．0);檢測(cè)波長(zhǎng):214 nm;柱溫:室溫;流速:0．6 mL·min－1;進(jìn)樣量:20 μL。

2．2 樣品處理 精密量取本品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL約含奧拉西坦0．5 mg的溶液，作為供試品溶液;精密量取供試品溶液1．0 mL，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。取對(duì)照溶液20μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿(mǎn)量程的10% ～20%;再精密量取取供試品溶液與對(duì)照溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液中如顯雜質(zhì)峰，水解產(chǎn)物(相對(duì)保留時(shí)間約為0．8)峰面積不得大于對(duì)照主峰面積的1/2(0．5%)，各雜質(zhì)峰面積的和:不得大于對(duì)照溶液的主峰面積(1．0%)。

2．3 專(zhuān)屬性考察 分別按“2．2”中方法配置對(duì)照品溶液和供試品溶液，同時(shí)按該方法配置奧拉西坦注射液處方比例的空白溶劑，空白輔料溶液，按“2．1”中色譜條件進(jìn)行樣品測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖1，由色譜圖可知，奧拉西坦主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度為4．0，大于 1．5，空白溶劑和輔料均不出峰，不干擾本品有關(guān)物質(zhì)的檢查。表明該色譜條件適用于本品有關(guān)物質(zhì)的檢查。

圖1 奧拉西坦注射液有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)專(zhuān)屬性考察圖譜

2．4 破壞試驗(yàn) 取奧拉西坦注射液(批號(hào):140607)5．0 mL，置200 mL瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品貯備液。精密稱(chēng)取按處方配制的空白輔料63．0 mg，置100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò);精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為空白輔料貯備液。分別量取供試品貯備液和空白輔料貯備液各5 mL進(jìn)行如下處理:(1)加1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液1 mL，水浴加熱1．0 h，放冷，用1 mol·L－1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。(2)加0．1 mol·L－1的鹽酸溶液 1 mL，水浴加熱 1．0 h，放冷，用0．1 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。(3)水浴加熱3．0 h，放冷，將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。(4)置50 mL量瓶中，于照度為(4 500±500)Lx的條件下放置6 h，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。(5)置50 mL量瓶中，加雙氧水1μL，室溫放置2．0 h，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

上述溶液濾過(guò)取續(xù)濾液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖即得堿、酸、高溫、光照、氧化破壞色譜圖。由圖可知，本品經(jīng)堿、酸、高溫、光照、氧化破壞試驗(yàn)后降解產(chǎn)物均能與奧拉西坦有效分離，主峰純度良好，理論塔板數(shù)、分離度均符合規(guī)定，說(shuō)明該色譜條件適用于本品有關(guān)物質(zhì)檢查。

2．5 線(xiàn)性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱(chēng)取奧拉西坦對(duì)照品28．00 mg，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密量取上述溶液5 mL，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。分別精密量取對(duì)照品貯備溶液 0．05、0．1、0．2、0．5、0．8、1．0、1．5、1．8 mL，分別置 10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以?shī)W拉西坦對(duì)照品峰面積A為縱坐標(biāo)，以?shī)W拉西坦?jié)舛菴(mg·L－1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得線(xiàn)性方程A=227 45C－883．11，相關(guān)系數(shù) r=0．999 8。結(jié)果表明奧拉西坦在0．28 ～10．08 mg·L－1的濃度范圍內(nèi)，其濃度與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

2．6 量限和檢測(cè)限試驗(yàn) 精密稱(chēng)取奧拉西坦對(duì)照品25．00 mg，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，逐級(jí)稀釋?zhuān)芰咳∪芤?0 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以檢測(cè)器信號(hào)/儀器噪音(S/N)=10時(shí)為定量限，以檢測(cè)器信號(hào)/儀器噪音(S/N)=3時(shí)為檢測(cè)限，經(jīng)測(cè)定奧拉西坦的定量限和檢測(cè)限分別為1．32 ng和0．45 ng。

2．7 精密度試驗(yàn) 精密稱(chēng)取本品(批號(hào):140607)適量，按2．2中對(duì)照品溶液配制方法配制樣品，精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，奧拉西坦樣品峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0．81%。試驗(yàn)結(jié)果表明本法精密度良好。

2．8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密量取本品(批號(hào):140607)適量，加流動(dòng)相稀釋制成每1 mL約含奧拉西坦0．5 mg的溶液，作為供試品溶液。放置與室溫(25 ℃)條件下，分別于第 0、1、2、4、6、8 h 時(shí)，精密量取供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 奧拉西坦注射液有關(guān)物質(zhì)檢查溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

由試驗(yàn)結(jié)果可知，供試品溶液在25℃條件下放置8 h，與0 h比較，單雜和總雜變化不大，主峰面積基本無(wú)變化，說(shuō)明有關(guān)物質(zhì)檢查供試品溶液在室溫(25℃)條件下放置8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．9 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定 精密量取本品適量，按2．2中樣品處理方法配置供試品溶液和對(duì)照品溶液;按2．1中色譜條件測(cè)定樣品有關(guān)物質(zhì)。各批樣品及測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 奧拉西坦注射液有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，自制奧拉西坦注射液多批產(chǎn)品水解產(chǎn)物、總雜質(zhì)均控制在較小范圍內(nèi)。

2．10 穩(wěn)定性考察 參照中國(guó)藥典2015版附錄XIXC原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則，對(duì)自制奧拉西坦注射液(批號(hào)20140701)進(jìn)行影響因素試驗(yàn)，影響因素試驗(yàn)條件為高溫60℃，高溫40℃。光照(4500±500)Lx以及低溫4℃，樣品使用棕色玻璃安瓿瓶包裝，于0、5、10 d檢測(cè)樣品有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表3。同時(shí)對(duì)自制奧拉西坦注射液(批號(hào)20140701、20140702、20140703)進(jìn)行加速試驗(yàn)，加速試驗(yàn)條件為(40±2)℃，相對(duì)濕度(75±5)%，于0、1、2、3、6 月檢測(cè)樣品有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 奧拉西坦注射液影響因素試驗(yàn)有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果

表4 奧拉西坦注射液加速試驗(yàn)有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道奧拉西坦注射液有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法多為等度洗脫和梯度洗脫高效液相色譜法等，檢測(cè)用色譜柱有 C8柱、C18柱［8－11]、氨基柱［12－13]以及氰基柱［14]等。使用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)奧拉西坦進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)奧拉西坦為末端吸收，參照奧拉西坦原料標(biāo)準(zhǔn)確定采用214 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了摸索，水相使用純化水時(shí)樣品容易渾濁，并且色譜圖中奧拉西坦峰存在拖尾現(xiàn)象，通過(guò)使用磷酸氫二鉀水溶液作為水相可以避免色譜峰拖尾，獲得對(duì)稱(chēng)性良好的色譜峰，并且沒(méi)有渾濁現(xiàn)象，奧拉西坦峰與相關(guān)雜質(zhì)的分離效果良好。

通過(guò)對(duì)自制奧拉西坦注射液進(jìn)行影響因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)樣品在高溫，低溫，光照條件下有關(guān)物質(zhì)均較穩(wěn)定，說(shuō)明自制制劑的制備工藝是合理的，加速試驗(yàn)6個(gè)月結(jié)果表明藥物在6個(gè)月內(nèi)有關(guān)物質(zhì)呈上升趨勢(shì)，但是變化不大，變化幅度均在要求范圍內(nèi)，進(jìn)一步說(shuō)明產(chǎn)品工藝的合理性及產(chǎn)品的穩(wěn)定性，同時(shí)還需要通過(guò)性狀，含量，澄明度等的穩(wěn)定性考察情況進(jìn)一步確定自制奧拉西坦注射液的穩(wěn)定性。

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