陳皮總黃酮測定方法及水提取動力學(xué)模型的建立

夏振文 趙陽 張欣 楊春靜 薛丹 尹興斌 倪健

陳皮(Citri Reticulatae Pericarpium)為蕓香科植 物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮［1］，是一種藥食同源的中藥。陳皮辛、苦，溫，歸脾、肺經(jīng)，具有理氣健脾，燥濕化痰的功效，主治脘腹脹滿，食少吐瀉，咳嗽痰多等癥。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，陳皮含有很多化學(xué)成分，主要有黃酮類化合物、揮發(fā)油類、檸檬苦素類、生物堿類和微量元素(鈣、鉀、鎂、鈉、鋰、鐵、鋅、錳)等［2］。

黃酮作為陳皮中一大類主要活性成分，種類繁多，主要包括橙皮苷(陳皮苷、橘皮苷)，新陳皮苷、川陳皮素(蜜橘黃素)、柚皮苷元(柑橘素)、二氫川陳皮素、紅橘素等［3］，現(xiàn)代研究表明黃酮類化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、防癌、抗菌、抗炎、抗病毒、抗過敏及抗糖尿病并發(fā)癥等多種生理活性及藥理作用，且無毒無害，對腫瘤、心血管病等多種疾病的治療和預(yù)防有重要意義。由此可見，陳皮中總黃酮具有很好的開發(fā)前景和利用價值，有必要對陳皮中總黃酮的提取進行研究。參考本課題組已建立的黃酮類成分的提取動力學(xué)模型［6-10］，本實驗對陳皮中總黃酮的水提取動力學(xué)過程進行了研究，建立陳皮總黃酮成分水煎煮提取的動力學(xué)模型，以擴大提取動力學(xué)方程的適用范圍，建立黃酮類成分普適的提取預(yù)測模型的驗證，豐富數(shù)據(jù)庫資源，提高預(yù)測準(zhǔn)確性。

1 儀器與藥物

陳皮藥材(生產(chǎn)批號:401003645，北京同仁堂有限責(zé)任公司)，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系劉春生教授鑒定;橙皮苷對照品(生產(chǎn)批號:1807/16335，純度＞98%，月旭材料科技上海有限公司);Tu180型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);DZKW-4型水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);甲醇為分析純(北京化工廠)，水為蒸餾水。

2 方法

2．1 陳皮總黃酮測定方法的建立

2．1．1 對照品溶液和供試品溶液的制備 精密稱取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品11．78 mg到50 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，得到0．2356 mg/mL的橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取陳皮15．00 g，加300 mL蒸餾水回流提取60分鐘，濾過，得陳皮水提液作為供試品溶液。

圖1 橙皮苷、陳皮水提液紫外吸收光譜圖

2．1．2 測定波長的選擇 取上述2種溶液，取適量蒸餾水稀釋后用紫外可見分光光度計在紫外區(qū)(190～600 nm)進行掃描，結(jié)果，供試品溶液在28～285 nm處均有最大吸收，而橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液在284 nm處有最大吸收，故選定284 nm作為測定波長［5］。

2．1．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 精密吸取上述橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．5 mL 分別置于10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，以相應(yīng)蒸餾水溶液為空白對照，在284 nm處測定其吸光度。結(jié)果表明，在0．004712～0．03534 mg/mL范圍內(nèi)，吸光度(Y)和橙皮苷質(zhì)量濃度(X)呈良好線性關(guān)系，其回歸方程為:Y=30．877X －0．0072，r=0．9991。

2．1．4 精密度實驗 取濃度為0．2356 mg/mL的橙皮苷溶液0．8 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，重復(fù)進樣6次，計算其RSD為0．0876%，表明精密度良好。

2．1．5 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于配置后 10、20、30、40、50、70、90、120、150 分鐘進行含量測定，測定其吸光度并計算 RSD為0.15%，試驗證明穩(wěn)定性良好。

2．1．6 重復(fù)性實驗 取15．00 g陳皮藥材，加水300 mL回流提取60分鐘，濾過，取提取液100μL至10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，測定含量，以上實驗重復(fù)進行6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果RSD為1．29%，試驗證明重復(fù)性良好。

2．1．7 回收率實驗 精密稱取陳皮藥材1．00 g，置50 mL的圓底燒瓶中，再分別加入橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品1.698 mg，加20 mL蒸餾水，回流提取30分鐘，提取液放冷，取續(xù)濾液60μL至10 mL量瓶中，平行6份，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，進行含量測定。以上實驗重復(fù)進行6次，結(jié)果平均回收率99．98%，RSD 為1．77%。

可以看出，所建立的陳皮總黃酮測定方法的各項方法學(xué)考察符合規(guī)定，因此根據(jù)此方法對其水提過程中的陳皮總黃酮含量進行考察，建立其提取動力學(xué)模型并進行驗證。

2．2 陳皮水提取動力學(xué)模型的研究

2．2．1 基于FICK定律得到的中藥材提取通用的動力學(xué)模型 基于FICK定律以及希格比理論對提取過程的微觀闡釋，同時也根據(jù)實際應(yīng)用的需求，選取重要的影響因素如提取時間、溶劑倍量、顆粒粒度作為實驗參數(shù)，簡化或轉(zhuǎn)化復(fù)雜的非必求參數(shù)例如傳質(zhì)系數(shù)、藥材密度、顆粒數(shù)目，以減小方程的復(fù)雜程度。但文獻(xiàn)中應(yīng)用到的方程大都存在方程形式復(fù)雜，需要求解的參數(shù)過多，且求解困難這一問題，因此欲建立與實際生產(chǎn)相適應(yīng)的模型，就必須解決上述問題，通過一系列假設(shè)和數(shù)學(xué)推導(dǎo)最終得到中藥材提取通用的動力學(xué)模型［6-7］:

它表示了煎煮出的有效成分濃度與提取時間、溶劑倍量及顆粒粒度之間的函數(shù)關(guān)系。CB為提取液中目標(biāo)成分的質(zhì)量濃度，單位為mg/mL。M為溶劑倍量，單位為mL/g。σ對于性狀不同的飲片代表不同的含義，對于葛根這種近似為正方體形的藥材，其代表飲片的一個邊長，單位是μm。f為方程中的一個固定參數(shù)，與藥材中目標(biāo)成分的含量有關(guān)。R為干藥材的吸溶劑率，由于本實驗使用溶劑為水，即為藥材的吸水率。n值與擴散系數(shù)有關(guān)，值為負(fù)。

2．2．2 理論基礎(chǔ) 由于中藥材飲片多數(shù)存在形狀不規(guī)則的問題，故每味藥材的粒徑值即σ1是不易通過實驗的方式確定的(除了少數(shù)形狀比較規(guī)則的中藥飲片如葛根等)。另外，在實際生產(chǎn)中，藥材多以飲片投料，粒徑這一因素是固定不變的。所以有必要對方程進行簡化，將σ1這個參數(shù)由需要實驗直接測定轉(zhuǎn)變?yōu)樽罱K固定參數(shù)a當(dāng)中的一部分。這樣減少藥材粒徑的直接測定能夠增加模型的準(zhǔn)確性，擴大模型的適用范圍，并且和實際生產(chǎn)情況更加接近。因此根據(jù)合理的數(shù)學(xué)推導(dǎo)［8］，得到了簡化后的模型:

兩邊同時取對數(shù)可以得到:

通過對不同時間和溶劑倍量作為自變量［t1/2/(M-R)］，提取液濃度CB為因變量。分別代入上述方程中，可以求得a和n值。從而得到提取動力學(xué)方程進行預(yù)測。

2．3 陳皮模型方程建立試驗方法

分別取藥材約 2．00、4．00、8．00、12．00、16．00、20．00 g置于500 mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水300 mL，加熱回流60分鐘，濾過，取出稱重。以藥材濕重與干重的差值為Y對藥材干重X做線性回歸，回歸方程的斜率即為中藥材吸收溶劑率R。平行進行3次，求算其平均值，求得陳皮的吸水率R為 2．8401 mL/g。

2．3．2 提取時間對提取率的影響 采用圓底三口燒瓶，電熱套加熱進行水煎煮提取，為減少水分蒸發(fā)，安裝了回流冷凝裝置。固定溶劑倍量 M=12 mL/g，在提取時間點為10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘時分別取出5 mL提取液后再補充5 mL。提取液放冷，待測;固定溶劑倍量M=16 mL/g，在提取時間點為10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘分別取出5 mL提取液后再補充5 mL。提取液放冷，待測。

2．3．3 溶劑倍量對提取的影響 固定提取時間為20分鐘，分別于 10、12、14、16、18 和 20 溶劑倍量下，取出一定體積提取液，放冷，待測;固定提取時間為40 分鐘，分別于不同10、12、14、16、18 和20 溶劑倍量下，取出一定體積提取液，放冷，待測。

3 結(jié)果

3．1 提取時間和溶劑倍量對提取的影響結(jié)果

采用上述建立的紫外分光光度法進行含量測定。對上述所有提取數(shù)據(jù)進行整理，求得ln［t1/2/(M-R)］和ln CB進行線性回歸。結(jié)果見表1，圖2。

3．2 模型的檢驗結(jié)果

把圖2中的回歸方程和(1-3)式中相應(yīng)數(shù)值聯(lián)立，1/(1 － n)=0．5902，1/(1 － n)lnαf1=1．2506?？梢郧蟮?n= －0．6943，α =92．9600，代入(1-2)式中求得本次研究所建立的陳皮總黃酮水煎煮提取過程 動 力 學(xué) 模 型:CB=(8．3223 × t0．5/M － 2．8401)0．5902。根據(jù)所建立的動力學(xué)方程式，可以計算出不同提取時間、不同溶劑倍量條件下陳皮水提液中總黃酮的濃度，計算結(jié)果見表2。

以上檢驗數(shù)據(jù)表明，本次研究所建立的動力學(xué)模型能比較好地與試驗結(jié)果相吻合，各條件下的試驗數(shù)值與計算數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差基本能滿足工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)偏差要求(小于10%)。

表1 不同t和M下的提取結(jié)果

圖2 ln［t1/2/(M－R)］和ln CB回歸方程

表2 模型檢驗結(jié)果

4 討論

本實驗陳皮總黃酮的測定方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率均符合要求，穩(wěn)定可行，可以用于陳皮總黃酮的測定。推導(dǎo)出的提取動力學(xué)模型對陳皮總黃酮的水提過程也有很好的適用性。但在實驗中發(fā)現(xiàn)，超過一定范圍后預(yù)測誤差就會偏大，實驗中超過80分鐘后，濃度增長很緩慢。分析原因可能是因為陳皮果皮質(zhì)地柔軟，總黃酮的成分容易煎出，因此陳皮煎煮過程中溶液能較快的達(dá)到飽和。在工業(yè)生產(chǎn)時，綜合考慮到效率、能耗，一次提取時間不長，因此本動力學(xué)模型具有一定的參考價值［11］。

由實驗結(jié)果可知，陳皮中總黃酮測定，通過簡化后的模型，對兩邊同時取對數(shù)，得到了提取液濃度與提取時間和溶劑倍量之間的線性關(guān)系。然后在此基礎(chǔ)上求解a和n更加方便，同時可以根據(jù)所有實驗數(shù)據(jù)回歸得到整體擬合度更高的回歸方程，把兩個因素之間共同作用的關(guān)系體現(xiàn)出來。相比課題組之前［6-8］研究中選擇的求取n、a平均值更能反映整體趨勢。

黃酮類成分藥材的提取動力學(xué)模型的建立和推廣，可以為含黃酮類成分中藥材的提取工藝標(biāo)準(zhǔn)化、最佳化提供理論基礎(chǔ)和應(yīng)用工具。通過建立的動力學(xué)模型，可以快速判斷各因素變化對提取物質(zhì)量的影響，不僅可以減少提取環(huán)節(jié)的研究周期，降低成本和消耗，而且可以規(guī)范中藥提取行為，保證提取物質(zhì)量的穩(wěn)定性、一致性。由黃酮類成分提取動力學(xué)模型可以推測，中藥中其他幾大類的成分(如生物堿、皂苷、甾體類，多糖等)的提取也可能適用此提取動力學(xué)模型，這有待于后續(xù)研究證明。

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