菊科植物青蒿細(xì)胞色素P450基因家族分析

郭書巧， 束紅梅， 鞏元勇， 蔣 璐， 朱靜雯， 倪萬潮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇 南京 210095)

細(xì)胞色素P450(P450)廣泛存在于各種形式的生命體中，它是自然界中最大且最古老的家族［1-2］。在植物中，P450主要參與植物體內(nèi)初級(jí)和次級(jí)代謝反應(yīng)，并發(fā)揮重要的催化作用。其催化反應(yīng)的底物包括內(nèi)源性物質(zhì)，如脂類、黃酮類、萜類、生物堿類等以及外源性物質(zhì)，如農(nóng)藥、除草劑等［3］。P450底物與功能的多樣性是為了適應(yīng)各種組織中不同的代謝途徑和環(huán)境脅迫而進(jìn)化的結(jié)果［4］。

菊科中含有多種芳香族植物，其中青蒿屬(Artemisiaannua)植物能產(chǎn)生一種倍半萜內(nèi)酯過氧化物—青蒿素，青蒿素是目前世界公認(rèn)的抗瘧疾首選藥物。紫穗槐-4，11-二烯(Amorphadiene)合酶是一種來源于青蒿的細(xì)胞色素P450單加氧CYP71AV1，它是一種多功能倍半萜內(nèi)酯環(huán)化酶，能將萜類前體法尼基焦磷酸(FPP)氧化成紫穗槐-4，11-二烯(Amorpha-4，11-diene)，并進(jìn)一步氧化成青蒿素合成的前體青蒿酸(Artemisinic acid)［5］。同時(shí)青蒿中還含有大量其他萜類化合物，青蒿植物精油主要成分包括單萜和倍半萜［6-7］。因此，了解青蒿P450，對(duì)于進(jìn)一步了解P450在植物初生代謝和次生代謝中的作用具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所采用的青蒿(A.annua)P450氨基酸序列下載自NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ protein/?term=Artemisia+P450)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，水稻(Oryzas ativa)和擬南芥(Arabidopsis thaliana) P450氨基酸序列下載自P450蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 (http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html)。

1.2 方法

1.2.1 菊科植物青蒿P450基因的鑒定 從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中下載菊科植物青蒿中所有的P450全長(zhǎng)序列，對(duì)其逐一進(jìn)行氨基酸的一致性鑒定。對(duì)還沒有進(jìn)行家族分類的P450進(jìn)行NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，結(jié)合下載的擬南芥和水稻序列尋找與其一致性較高序列。根據(jù)國際命名標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行分類:氨基酸序列一致性(Identity)在40%至55%之間的序列為同一家族(Family)，一致性為55%～97%的序列歸入同一亞家族(Subfamily)，氨基酸序列的一致性大于97%的序列是由同一基因的不同位點(diǎn)即等位基因編碼［8］。

1.2.2 菊科植物青蒿P450系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 根據(jù)青蒿P450的氨基酸序列，通過MUSCLE［9］對(duì)所鑒定的P450氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA 6.0軟件Neighbor joining法構(gòu)建進(jìn)化樹，重復(fù)次數(shù)為1 000次［10］。

1.2.3 青蒿和擬南芥、水稻P450系統(tǒng)進(jìn)化樹對(duì)比

在水稻和擬南芥P450中選擇在青蒿中存在的11個(gè)家族所有P450全長(zhǎng)氨基酸序列，采用MEGA 6.0軟件中Neighbor joining法對(duì)已鑒定的青蒿中氨基酸序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)次數(shù)為1 000次［10］。

1.2.4 青蒿P450蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

1.2.4.1 青蒿P450蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)理化特性分析

利用在線軟件Protparam(http://web.expasy.org/ protparam)對(duì)氨基酸數(shù)目、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、分子式、脂肪族氨基酸、蛋白質(zhì)疏水性、不穩(wěn)定系數(shù)等蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)理化特性進(jìn)行分析。

1.2.4.2 青蒿P450蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位和信號(hào)肽預(yù)測(cè) 使用 TargetP在線程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對(duì)青蒿 P450蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位［11］。信號(hào)肽預(yù)測(cè)使用在線軟件SingaIP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行［12］。

1.2.4.3 青蒿P450蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 利用ExPaSy在線程序SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)分析α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角等;蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)信息來源于 RCSB PBD(http://www.rcsb.org)，共 4個(gè)細(xì)菌 P450［P450cam(CYP101)、P450BM3(CYP102)、P450eryF(CYP107A1)和P450terP(CYP108)］，1 個(gè) 哺 乳 動(dòng) 物 P450 (CYP2C5)，1個(gè)擬南芥丙二烯氧化合酶(CYP74A，)1個(gè)灰白銀膠菊(Parthenium argentatum)丙二烯氧化合酶AOS(CYP74A2)［13］。將6個(gè)氨基酸序列與青蒿的P450用ClustalW軟件進(jìn)行同源比對(duì)，選擇一致性較高的P450(CYP2C5)為模板［14］，應(yīng)用在線ESPript程序(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)及基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的的預(yù)測(cè)［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊科植物青蒿P450基因的鑒定結(jié)果

從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中共下載76條青蒿P450蛋白質(zhì)氨基酸序列。其中具有全長(zhǎng)的氨基酸序列57條，包含8條P450還原酶蛋白質(zhì)氨基酸序列。將剩余的49條序列進(jìn)行氨基酸的一致性鑒定，最后獲得41個(gè)編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶的基因(表1)，其中有14個(gè)基因目前沒有經(jīng)過正式的家族分類。對(duì)沒有分類的P450進(jìn)行NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并結(jié)合下載的擬南芥和水稻P450氨基酸序列找到與其一致性較高的序列，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，鑒定結(jié)果見表2。

2.2 青蒿P450基因系統(tǒng)進(jìn)化

從青蒿P450系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)可以看出，青蒿的41個(gè)基因分布相對(duì)集中，共分布在3個(gè)基因簇的11個(gè)家族中。其中 Clan72中的 CYP72有2個(gè)，Clan85中的CYP90有1個(gè)，CYP716有4個(gè)。其余全部分布于Clan 71中，且大多集中在CYP71家族中。來源于青蒿中的16個(gè)基因，除AaABG49366.1外，都在一個(gè)分支中，一致性在97%～99%，在分類上被視為同一基因的等位基因［8］。來源于青蒿屬的其他物種的P450一致性為82%～86%。

表1 預(yù)測(cè)的青蒿細(xì)胞色素P450基因分布Table 1 Distribution of the P450 genes from Artemisia annua

表2 預(yù)測(cè)的青蒿細(xì)胞色素P450與其同源序列的一致性Table 2 Similarity of P450 amino acid sequence from A.annua and other species

2.3 青蒿、擬南芥和水稻P450系統(tǒng)進(jìn)化樹的對(duì)比

從青蒿和擬南芥和水稻的P450系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)中可以看出，雙子葉植物擬南芥中所特有的［21］，水稻中不存在的CYP82、CYP83和CYP716 3個(gè)家族在青蒿中都出現(xiàn)了。有趣的是在擬南芥中不存在，而在單子葉植物中特有的CYP92家族居然在青蒿中出現(xiàn)。而Nelson等［21］提到的菊科中出現(xiàn)的8個(gè)家族 CYP73、CYP75、CYP76、CYP81、CYP93、CYP701、CYP74、CYP87，在青蒿中只有 CYP73和CYP81 2個(gè)家族出現(xiàn)。

2.4 青蒿P450蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性

選擇代表不同家族和亞家族的19個(gè)青蒿P450分析其特征特性。代表性P450氨基酸數(shù)為473～528，平均為500;相對(duì)分子量在53 977.9至61 127.3之間，平均為56 882.1(表3)。根據(jù)理論等電點(diǎn)(pI)將青蒿P450蛋白質(zhì)分為2類:一類呈酸性，pI值介于6.00和6.69之間，包括CYP706、CYP83和 CYP82共3個(gè)家族中的5個(gè)蛋白質(zhì);另一類呈堿性，pI值介于8.03和9.25之間，包括CYP90、CYP716、CYP73、CYP72、CYP92、CYP71、CYP81、CYP98共8個(gè)家族中的14個(gè)蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定指數(shù)介于32.19和42.58之間，平均值為39.64，總體上青蒿P450穩(wěn)定性不太好。脂溶性指數(shù)在89.75和102.11之間，平均值也高達(dá)96.37，而其親水性指數(shù)皆為負(fù)值，故青蒿P450都是親脂性蛋白質(zhì)。從表3可以看出，青蒿 P450中除 ADO16185.1(CYP92A)、ABC94480.1(CYP706)、ADO16181.1(CYP73A)外，其余都是分泌途徑中的蛋白質(zhì)。信號(hào)肽分析結(jié)果表明，除ADO16181.1(CYP73A)外，其余都含有跨膜區(qū)，為跨膜蛋白質(zhì)。

圖1 青蒿P450基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of P450 from A.annua

利用在線程序SOPMA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果(表3)表明，本研究所涉及的P450家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主要構(gòu)成元件，平均所占比例達(dá)39.64%，其次是無規(guī)則卷曲、β-折疊和轉(zhuǎn)角，平均所占比例分別為28.48%、16.57%和8.28%。以編號(hào)為BAM68808.1的蛋白質(zhì)為例，繪制蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)。從圖3中可見，α-螺旋為主要構(gòu)成元件，無規(guī)則卷曲、β-折疊和轉(zhuǎn)角分散在整個(gè)蛋白質(zhì)中。

表3 青蒿P450家族蛋白質(zhì)的生物信息Table 3 The biological information of P450 protein from A.annua

利用ESPript在線程序?qū)η噍颬450進(jìn)行同源比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)青蒿P450一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性不高，但它們卻有著非常類似的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)。將這些序列與CYP2C5(1DT6)的X-射線晶體結(jié)構(gòu)圖比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)基質(zhì)識(shí)別位點(diǎn)(SRSs)，且所有基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)都分布在不同結(jié)構(gòu)元件中，識(shí)別特異的底物。所有青蒿P450都含有典型的保守結(jié)構(gòu)域: PERF結(jié)構(gòu)域(PxRx)、K螺旋(ExxR)、C末端的血紅素結(jié)合域(FxxGxxxCxG)以及N端的跨膜區(qū)(圖4)。血紅素結(jié)合域是P450蛋白的特征結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域中存在與鐵元素形成硫醇鹽離子鍵的絕對(duì)保守的半胱氨酸殘基。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，青蒿中不同P450氨基酸序列間存在嚴(yán)格的保守基序，這些保守的基序通常分散于P450氨基酸序列中的5個(gè)區(qū)域，它們與血紅素結(jié)合區(qū)(FXXGXXXCXG)，共同組成保守的P450結(jié)構(gòu)中心［14］。

圖2 青蒿、擬南芥和水稻的P450系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree ofP450 from A.annua，Arabidopsis and rice

圖3 利用程序SOPMA進(jìn)行青蒿P450蛋白質(zhì)(BAM68808.1)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of secondary structure of P450(BAM68808.1)from A.annua by SOPMA

圖4 利用程序ESPript進(jìn)行青蒿P450蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of secondary structure of P450 from A.annua using ESPript

3 討論

P450 是生物界無處不在的超級(jí)大家族，植物P450 超家族被歸為10個(gè)基因簇，127個(gè)家族，其中水稻中有48個(gè)家族，擬南芥中有45個(gè)家族［21-22］，有9個(gè)家族是雙子葉植物擬南芥所特有的，10個(gè)家族是單子葉植物水稻所特有。本研究共鑒定了41個(gè)青蒿P450，分布在3個(gè)基因簇的11個(gè)家族中。有趣的是，作為雙子葉植物的青蒿，目前鑒定的僅有的11個(gè)家族中，既包括了擬南芥所特有的3個(gè)家族CYP82、CYP83和CYP716，又包括了水稻特有的1個(gè)家族CYP92。而Nelson等提到的菊科中出現(xiàn)的8個(gè)家族中［21］，只有CYP73和CYP81 2個(gè)家族出現(xiàn)。造成這種現(xiàn)象的原因，主要是由于擬南芥和水稻的基因組測(cè)序已經(jīng)完成，其P450的鑒定已趨于飽和，而菊科基因組的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于擬南芥和水稻，故還會(huì)有新的P450不斷補(bǔ)充。另一方面，也提示我們菊科植物作為一個(gè)古老的物種，有著更為豐富的P450家族蛋白質(zhì)有待開發(fā)、鑒定。

所有的P450蛋白質(zhì)都呈現(xiàn)相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，盡管它們的序列一致性不高(低于20%)［23］。為了更好地理解P450結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，我們以CYP2C5(1DT6)的X-射線晶體結(jié)構(gòu)圖為模板［14］，對(duì)青蒿P450進(jìn)行了氨基酸序列聯(lián)配和次級(jí)結(jié)構(gòu)元件的預(yù)測(cè)。發(fā)現(xiàn)所有的青蒿P450都含有典型的保守結(jié)構(gòu)域，包括PERF結(jié)構(gòu)域(PxRx)、K螺旋(ExxR)和C末端的血紅素結(jié)合域(FxxGxxxCxG)，另外某些氨基酸殘基也具有高度的保守性，這些保守結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)的折疊、組裝中起著關(guān)鍵性作用［14］。而可變區(qū)主要出現(xiàn)在基質(zhì)結(jié)合區(qū)。P450是最大的酶家族之一，能催化多種底物，這就需要該蛋白質(zhì)能結(jié)合多種底物，行使各自的功能。

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