紅色亞棲熱菌耐熱木聚糖酶的克隆表達(dá)及生物信息學(xué)分析

俞潔瓊， 王洪成， 何正文， 樂(lè)易林， 邵蔚藍(lán)

(江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院/生物質(zhì)能源研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

中國(guó)農(nóng)作物秸稈資源極其豐富，在2009年其總產(chǎn)量已達(dá)到7×108t，其中主要是稻草和玉米秸稈，分別為2.5×108t和2.3×108t。然而每年約占總量13%～17%的秸稈被焚燒處理，這是造成近年來(lái)被高度關(guān)注的霧霾的直接原因之一。目前，秸稈再利用的主要途徑是秸稈還田和飼料化，而由于秸稈的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，半纖維素與木質(zhì)素通過(guò)酯鍵形成緊密的外圍，阻礙飼用禽畜體內(nèi)消化酶與秸稈內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸，影響禽畜的生長(zhǎng)性能。木聚糖是半纖維素的主要成分，自然界儲(chǔ)量大，在被子植物中約占總干質(zhì)量的15%～30%，同時(shí)也是秸稈等飼料的一個(gè)主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子［1］。往秸稈飼料中投放能夠降解木聚糖的酶類，降低食糜粘度，可以有效地減少或消除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用［2-5］。秸稈木聚糖降解的傳統(tǒng)方法是使用物理和化學(xué)處理，相對(duì)而言，酶制劑的使用具有反應(yīng)高度特異性，反應(yīng)條件溫和，以及不會(huì)由于化學(xué)條件限制造成底物損耗以及環(huán)境問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)，因而受到越來(lái)越多的關(guān)注。同時(shí)木聚糖酶的投入還可以幫助實(shí)現(xiàn)秸稈在其他方面的清潔利用，如秸稈粗纖維造紙以及在食品行業(yè)中生產(chǎn)低聚木糖等。然而木聚糖酶活性在實(shí)際應(yīng)用中受到各方面的影響，例如飼料生產(chǎn)過(guò)程的高溫、動(dòng)物腸道內(nèi)環(huán)境溫度等都會(huì)抑制其催化降解活性，因此供應(yīng)的木聚糖酶不僅要具有很高的熱穩(wěn)定性，其分解木聚糖反應(yīng)最適溫度也要接近動(dòng)物腸道內(nèi)環(huán)境溫度，這樣才能減少損失和最大程度發(fā)揮它的催化作用。因此，適合實(shí)際應(yīng)用的木聚糖酶的研究與開發(fā)工作仍然十分緊迫。

棲熱菌是地?zé)岣邷鼐拇?，其產(chǎn)生的高溫酶由于擁有良好的熱穩(wěn)定性通常被開發(fā)應(yīng)用于科研和工業(yè)生產(chǎn)中。其中最為典型的是從水生棲熱菌(T.aquaticus)中分離純化而來(lái)的用于 PCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶［6］。紅色亞棲熱菌(Meiothermus ruber)屬于革蘭氏陰性、無(wú)芽孢好熱桿菌，形成紅色菌落，生長(zhǎng)溫度為35～70℃，最適生長(zhǎng)溫度為60℃［7］。亞棲熱菌屬中，除M.taiwanensis有較深入的研究外，其他菌研究很少。本實(shí)驗(yàn)室從云南騰沖熱海溫泉采集樣品中篩選出1株能夠降解結(jié)晶纖維素的嗜熱菌株，經(jīng)形態(tài)特征、理化性質(zhì)和16S rDNA序列同源性分析鑒定為紅色亞棲熱菌，并命名為Meiothermus ruber TC-1［8］。該菌株具有木聚糖酶活性，因此本研究主要通過(guò)設(shè)計(jì)引物從M.ruber TC-1中擴(kuò)增出木聚糖酶基因，測(cè)定木聚糖酶的溫度特性和降解產(chǎn)物，并對(duì)該酶進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為研發(fā)具有應(yīng)用價(jià)值的木聚糖酶制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅色亞棲熱菌Meiothermus ruber TC-1(CICIM B7007)由本實(shí)驗(yàn)室分離和保存，Escherichia coli DH5α購(gòu)自Novagen(Billerica，MA，USA)。蛋白酶K、Ex-Taq DNA聚合酶和rTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、RNase、DNA Marker、Protein Marker、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)，pHsh-T質(zhì)粒來(lái)自Shine E Biotech(中國(guó)南京)。2種細(xì)菌的生長(zhǎng)使用LB培養(yǎng)基，1 000 ml液體LB培養(yǎng)基中含蛋白胨(Trypton)10 g，酵母粉(Yeast Extract)5 g，NaCl 10 g，121℃高壓滅菌20 min。液體LB培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂制備固體LB培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌株木聚糖酶活性測(cè)定 取500 μl實(shí)驗(yàn)室保存的紅色亞棲熱菌TC-1菌液，涂布于斜面篩選培養(yǎng)基(含1%木聚糖、3%瓊脂的LB培養(yǎng)基)，以不添加木聚糖的斜面培養(yǎng)基作對(duì)照，60℃恒溫靜置培養(yǎng)4 d，觀察菌落生長(zhǎng)狀況。挑選具有透明圈的菌落進(jìn)行液體發(fā)酵，取上清液測(cè)定酶活性。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 M.ruber TC-1基因組文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序工作由Beijing Genomics Institute完成。將 M.ruber TC-1中木聚糖酶基因序列(GenBank accession no. JRGA01000001.1，GL000978)導(dǎo)入信號(hào)肽分析軟件SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)，獲知其融合一段含19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。根據(jù)去除信號(hào)肽的木聚糖酶基因序列設(shè)計(jì)引物:xyn-fw (5′-TTTGTATGGGCCCAGCCCGGCCC-3′)，xyn-rev (5′-CTCCGGTTGTTGTAAGGTGCGCTG-3′)。引物由上海生物工程公司合成。

1.2.3 木聚糖酶基因(Mru)PCR擴(kuò)增與克隆 根據(jù)堿裂解法提純紅色亞棲熱菌TC-1基因組DNA，以其為模板，xyn-fw和xyn-rev為引物擴(kuò)增去除信號(hào)肽的木聚糖酶基因片段，PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃5 min;94℃30 s，57℃30 s，72℃60 s，30個(gè)循環(huán);72℃5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化回收后，連接到pHsh-T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(自制)，涂布于含25 μg/ml氯霉素的固體LB培養(yǎng)基中，30℃倒置培養(yǎng)，然后篩選單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證和送上海生物工程公司測(cè)序。

1.2.4 重組酶粗酶液制備及酶活力測(cè)定 挑取含有重組質(zhì)粒 pHsh-xyn的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接入含 25 μg/ml氯霉素的3 ml LB培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6～0.8后，立即轉(zhuǎn)入42℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)6～10 h，培養(yǎng)結(jié)束后，以6 000 r/min離心2 min收集菌體，用2 ml無(wú)菌水重懸細(xì)胞，然后在冰水浴中用超聲破碎儀破碎菌體，每個(gè)循環(huán)超聲9 s，冷卻5 s，運(yùn)行2 min，細(xì)胞破碎液經(jīng)10 000 r/min離心5 min后，所得上清液即為粗酶液。木聚糖酶活性的測(cè)定以1%燕麥木聚糖為底物，方法為:往90 μl 50 mmol/L pH 6.0的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液中加入0.1 ml底物和10 μl酶液，65℃水浴10 min，反應(yīng)完成后往體系中加入600 μl PAHBAH溶液［0.5 mol/L NaOH和溶于0.5 mol/L HCl的5%PAHBAH儲(chǔ)存液4∶1(體積比)］終止反應(yīng)，最后將混合物沸水浴10 min，冰水冷卻后，測(cè)定410 nm光吸收值。木聚糖酶活性單位定義為在上述試驗(yàn)條件下，每分鐘催化反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol木糖的使用酶量。

1.2.5 木聚糖酶解產(chǎn)物分析

1.2.5.1 酶解液制備 用50 mmol/L pH 6.0緩沖液配制濃度為0.5%的燕麥木聚糖溶液，取出200 μl加入50 μl木聚糖酶(20 U/ml)，65℃保溫12 h。向酶解液中加入等體積無(wú)水乙醇沉淀未水解的大分子聚合物和酶蛋白，10 000 g離心5 min去除沉淀，將上清液風(fēng)干后再加入100 μl無(wú)菌水重新溶解水解產(chǎn)物。

1.2.5.2 TLC法測(cè)定酶解產(chǎn)物 薄層板購(gòu)自Merck公司，型號(hào)為 60 F254。展開劑為正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1(體積比)，顯色劑為濃硫酸∶甲醇=2∶8(體積比)和100 mg 5-甲基-1，3-苯二酚。展開劑距離頂部2 cm時(shí)停止展層，取出薄層板自然風(fēng)干，再均勻噴上顯色劑，于85℃顯色。

1.2.6 木聚糖酶(Mru)的生物信息學(xué)分析 一級(jí)結(jié)構(gòu)分析:保守區(qū)和蛋白家族分析預(yù)測(cè)采用在線CCD和Pfam程序(http://pfam.sanger.ac.uk/)結(jié)合BlastP，氨基酸序列推測(cè)采用 http://www.biosoft.net/sms/，信號(hào)肽分析使用 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/服務(wù)器，蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析預(yù)測(cè)采用ProParam服務(wù)器http://www.expasy.ch/tools/，將氨基酸序列輸入NCBI進(jìn)行在線“tblastP”同源性檢索，采用MEGA5.05構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，計(jì)算方法為鄰位相連法(Neighbor joining)，并運(yùn)用自展內(nèi)部分枝法(Bootstrapping)來(lái)評(píng)定進(jìn)化樹的置信度，重復(fù)次數(shù)為1 000。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析:蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)采用在線工具SOPMA(https:// npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page =npsa_sopma.html)，疏水性分析在線服務(wù)器http://web.expasy.org/protscale/。同源建模:蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù) http://www.rcsb.org/pdb/home/ home.do;蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)使用Modeller軟件;同源建模評(píng)價(jià) http://services.mbi.ucla.edu/ SAVES/。

2 結(jié)果

2.1 木聚糖酶基因Mru克隆

根據(jù)堿裂解提取基因組方法，得到 M.ruber TC-1基因組DNA，然后使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取結(jié)果(圖1a)。以M.ruber TC-1的基因組DNA為模板，用引物xyn-fw和xyn-rev PCR擴(kuò)增M.ruber TC-1基因組中的木聚糖酶DNA片段，得到約950 bp大小的片段，與預(yù)期目的基因長(zhǎng)度一致(圖1b)。測(cè)序結(jié)果表明，其開放閱讀框的長(zhǎng)度為951 bp，序列與紅色亞棲熱菌 DSM1279木聚糖酶(登錄號(hào)為WP_015586289.1)一致性達(dá)100%。

2.2 重組木聚糖酶的表達(dá)及溫度特性

將空載質(zhì)粒pHsh轉(zhuǎn)化菌E.coli DH5α和攜帶木聚糖酶基因的pHsh-xyn質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌E.coli DH5α的表達(dá)結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)比分析，得出重組酶木聚糖酶蛋白大小約為36 000(圖2)。在65℃下，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液濃度設(shè)定為 50 mmol/L，pH 4.5～8.5，測(cè)得木聚糖酶最適反應(yīng)pH為6.0。在pH為6.0的條件下，將反應(yīng)體系分別以55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃保溫10 min，酶活性測(cè)定結(jié)果如圖3，由圖3可知，木聚糖酶Mru最適反應(yīng)溫度為65℃，但在55～70℃范圍內(nèi)酶活性均很高，在75℃酶活性仍達(dá)最大酶活性的60%左右。在pH6.0、溫度為65℃條件下，重組木聚糖酶粗酶液的比酶活性為20 U/ml。

2.3 木聚糖酶的水解產(chǎn)物

以燕麥木聚糖為底物，將木聚糖酶Mru的水解產(chǎn)物同其他已報(bào)道的1個(gè)第10家族來(lái)自Thermotoga maritima的木聚糖酶B［9］和2個(gè)第11家族分別來(lái)自Bacillus pumilus ARA［10］和Thermomyces lanuginosus［11］的木聚糖酶的水解產(chǎn)物對(duì)比分析(圖4)。木聚糖酶Mru和木聚糖酶B對(duì)燕麥木聚糖的水解產(chǎn)物主要是木糖和木二糖;Bacillus pumilus ARA木聚糖酶對(duì)燕麥木聚糖的主要水解產(chǎn)物是木糖、木二糖和木三糖;Thermomyces lanuginosus木聚糖酶對(duì)燕麥木聚糖的主要水解產(chǎn)物是木二糖。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis

圖2 SDS-PAGE分析重組表達(dá)的木聚糖酶Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant xylanase

圖3 溫度對(duì)木聚糖酶Mru活性的影響Fig.3 Effect of temperature on Mru xylanase activity at pH6.0

2.4 木聚糖酶Mru的生物信息學(xué)

2.4.1 木聚糖酶Mru一級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4.1.1 保守區(qū)預(yù)測(cè) 利用NCBI中的BlastP和CCD程序以及Pfam對(duì)序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行保守區(qū)和蛋白家族預(yù)測(cè)。木聚糖酶Mru具有第10家族糖基水解酶的保守區(qū)域，位于Leu18～Leu317。

圖4 不同來(lái)源木聚糖酶水解燕麥木聚糖的產(chǎn)物Fig.4 Thin-layer chromatography of the products from the hydrolysis of oat spelt xylan

2.4.1.2 木聚糖酶Mru同源性分析 通過(guò)Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)的Blastp程序，對(duì)木聚糖酶Mru序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示其與來(lái)源M.ruber DSM1279(WP_015586289.1)的木聚糖酶一致性為 100%，與來(lái)源 Meiothermus cerbereus(WP_ 027878488)、Meiothermus rufus(WP_027881275)、Meiothermus chliarophilus(WP_027891604)、Meiothermus timidus(WP_018467010)的木聚糖酶一致性分別為89%、78%、65%、61%。選取表1中14種已有報(bào)道的第10家族木聚糖酶進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析，結(jié)果表明，木聚糖酶Mru具有第10家族木聚糖酶通常所包含的2個(gè)谷氨酸催化殘基E150和E255，這2個(gè)殘基被認(rèn)為在木聚糖酶催化反應(yīng)中具有重要作用［12-13］。另外，比對(duì)的14個(gè)木聚糖酶有5個(gè)高度保守區(qū)，即靠近N端的ENVMKW、GHTLVWH、WDVVNE、YNDY以及TELD。根據(jù)酶的溫度耐受性，木聚糖酶可劃分為中溫酶(40～60℃)、高溫酶(50～80℃)和超高溫酶(＞80℃)［14］，耐受性低于40℃的酶稱為低溫酶。對(duì)14個(gè)木聚糖酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖5)表明，木聚糖酶Mru與7種高溫酶聚為一類，另2種高溫酶(Tthx、Tspx)與4種低溫酶聚為另一類。

表1 14個(gè)第10家族木聚糖酶的溫度特性Table 1 Temperature characters of 14 GH10 xylanases

圖5 對(duì)14種第10家族木聚糖酶系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 The phylogenetic tree of 14 GH10 xylanases

2.4.2 木聚糖酶Mru二級(jí)結(jié)構(gòu) 木聚糖酶Mru的疏水性最大值是1.478，位于第26位點(diǎn)處。疏水性最小值是-2.133，位于第263位點(diǎn)處。從圖6可以看出親水性氨基酸殘基均勻分布于整條肽鏈，且多肽鏈整體疏水值小于零，該蛋白表現(xiàn)為一定的親水性。經(jīng)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析得出，木聚糖酶Mru不穩(wěn)定系數(shù)是39.40，脂肪系數(shù)為90.22，疏水性平均值為-0.234，表明木聚糖酶Mru是穩(wěn)定的親水性蛋白。

圖6 重組木聚糖酶Mru疏水性分析Fig.6 Hydrophobicity analysis of recombinant Mru xylanase

由于肽鏈內(nèi)部和多肽鏈之間的氫鍵，肽鏈在一維方向展示出許多周期性的結(jié)構(gòu)，如α-螺旋、β-折疊等。通過(guò)SOPMA分析預(yù)測(cè)木聚糖酶Mru的二級(jí)結(jié)構(gòu)，Mru木聚糖酶是由51.68%α-螺旋，15.90%β-折疊，7.34%β-轉(zhuǎn)角，25.08%無(wú)規(guī)則卷曲組成(圖7)。

圖7 木聚糖酶Mru二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Secondary structure prediction of Mru xylase

2.4.3 木聚糖酶Mru同源建模 為了提高同源建模的可信度，采用多序列比對(duì)同源建模方法。使用Blast工具在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)搜索相似的序列之后，選擇4個(gè)同源性較高的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。將這4個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作為模板，應(yīng)用Modeller構(gòu)建目標(biāo)序列構(gòu)象，結(jié)構(gòu)如圖8。利用PROCHECK對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)模型進(jìn)行合理性分析，模建的三維結(jié)構(gòu)96% 氨基酸的ψ角和φ角位于Ramachandran圖的合理區(qū)域，表明構(gòu)建的木聚糖酶Mru蛋白催化域的三維結(jié)構(gòu)是合理的。進(jìn)一步利用verfy3D軟件檢測(cè)模建結(jié)果的三維結(jié)構(gòu)(3D)與序列結(jié)構(gòu)(1D)的符合度，表明93.38%殘基的3D與1D符合度大于0.2，處于可接受水平。木聚糖酶Mru蛋白催化域的模建三維結(jié)構(gòu)為(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)。同源比對(duì)得到的5個(gè)保守區(qū)ENVMKW、GHTLVWH、WDVVNE、YNDY和TELD分別分布在木聚糖酶Mru蛋白的空間結(jié)構(gòu)中的β2末端、β3末端、β4部分、β5部分和β7部分，位于(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)壁。酸堿催化活性氨基酸E150位于β4折疊的尾巴上，另外一個(gè)谷氨酸催化殘基(E255)位于β7上。從木聚糖酶Mru蛋白CD區(qū)三維結(jié)構(gòu)可以看出，α螺旋幾乎不含有保守氨基酸殘基，保守性遠(yuǎn)低于β折疊。催化位點(diǎn)位于β折疊區(qū)有利于保持酶的熱穩(wěn)定性，同時(shí)β折疊區(qū)的高度保守性說(shuō)明了嗜熱酶在進(jìn)化過(guò)程中形成了獨(dú)特的熱穩(wěn)定結(jié)構(gòu)模式。

圖8 木聚糖酶Mru蛋白催化域的模建三維結(jié)構(gòu)Fig.8 Overall structure of the CD domain of Mru xylanase predicted by Modeller

3 討論

本研究從亞棲熱菌中成功克隆出了木聚糖酶基因，通過(guò)蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，初步論斷該酶屬于第10家族，且是一個(gè)較穩(wěn)定的親水蛋白。以往許多研究者通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)分析、序列比對(duì)和突變研究結(jié)果說(shuō)明中溫酶和耐熱酶一級(jí)結(jié)構(gòu)上很相似，于是推測(cè)影響木聚糖酶熱穩(wěn)定性的因素是蛋白分子進(jìn)行了一些微小的修飾，如二硫鍵、鹽鍵、氫鍵、表面帶電殘基及內(nèi)部堆積力等，同時(shí)提出了各種理論，如疏水核堆積或芳香族氨基酸粘性斑形成多聚體，脯氨酸規(guī)則，螺旋偶極子的穩(wěn)定，熱穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域(TSD)等［28］。本研究對(duì)已研究較深入的4種中低溫木聚糖酶，9種耐熱木聚糖酶和木聚糖酶Mru進(jìn)行同源性比對(duì)，這些酶均屬于第10家族木聚糖酶。分析得到的結(jié)果是，木聚糖酶Mru具有通常第10家族木聚糖酶所包含的2個(gè)谷氨酸催化殘基E150和E255，有5個(gè)高度保守區(qū)，即靠近N端的ENV MKW以及GHTLVWH、WDVVNE、YNDY、TELD，而且木聚糖酶Mru在進(jìn)化樹上體現(xiàn)出與其他耐熱木聚糖酶具有類似的進(jìn)化過(guò)程。木聚糖酶Mru蛋白催化域的模建三維結(jié)構(gòu)為(β/α)8桶裝結(jié)構(gòu)。催化位點(diǎn)位于β折疊區(qū)有利于保持酶的熱穩(wěn)定性，同時(shí)β折疊區(qū)的高度保守性說(shuō)明了嗜熱酶在進(jìn)化過(guò)程中形成了獨(dú)特的熱穩(wěn)定結(jié)構(gòu)模式。另外，該木聚糖酶在65～70℃酶活性最高，說(shuō)明具有良好的耐熱性，在55℃的酶活性也達(dá)到最大酶活性的70%左右。

中國(guó)存在眾多的廉價(jià)木質(zhì)纖維原料，目前對(duì)其使用方式仍然十分粗放，不可避免的造成許多資源浪費(fèi)和環(huán)境問(wèn)題。木聚糖酶等酶制劑轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維生產(chǎn)實(shí)用產(chǎn)品，反應(yīng)溫和，效果突出，因而備受關(guān)注，但木聚糖酶在產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中尚存在許多限制因素。第一，酶的生產(chǎn)技術(shù)水平亟需提高。木聚糖酶要達(dá)到大批量生產(chǎn)要求，目前的有效途徑是通過(guò)基因工程篩選克隆子。第二，需要篩選出產(chǎn)生耐高溫、耐酸、耐堿性木聚糖酶的微生物，從而有利于酶貯存和應(yīng)用。第三，在投入實(shí)際使用方面還要考慮如何實(shí)現(xiàn)酶的最佳性能，如根據(jù)底物種類和濃度控制用酶量、復(fù)合酶制劑的配比以及酶載體的優(yōu)化等。因此，利用生物信息學(xué)分析方法結(jié)合基因工程手段是實(shí)現(xiàn)木聚糖酶制劑批量生產(chǎn)和有效應(yīng)用的一個(gè)優(yōu)良途徑。

［1］ WONG KKY，TAN LU L，SADDLER J N.Multiplicity of β-1，4-xylanase in microorganisms，functions and applications［J］.Microbiol Rev，1988，52(3):305-317.

［2］ 白雪峰.木聚糖酶在飼料中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2004，31(12):11-13.

［3］ TWOMEY L，PLUSKE J，ROWE J，et al.The effects of increasing levels of soluble non-starch polysaccharides and inclusion of feed enzymes in dog diets on faecal quality and digestibility［J］.An Feed Sci Technol，2003，108(1-4):71-82.

［4］ 郄衛(wèi)那，張?zhí)m英，何 健，等.1株飼用木聚糖酶產(chǎn)生菌的分離、鑒定、發(fā)酵、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42 (10):196-200.

［5］ 常桂英，王俊玲，徐亞維，等.木聚糖酶xynB基因序列分析及表達(dá)載體構(gòu)建［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(10):31-32.

［6］ 陳朝銀，劉 麗，賁 昆.棲熱菌屬熱穩(wěn)定DNA聚合酶［J］.生物技術(shù)，2001，11(4):31-34.

［7］ BRIAN J T，JOHANNES S，SUSAN L，et al.Complete genome sequence of Meiothermus ruber type strain(21T)［J］.Stand Genomic Sci，2010，3(1):26-36.

［8］ 吳窈畫，邵蔚藍(lán).產(chǎn)結(jié)晶纖維素酶的嗜熱菌鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)［J］.南京師大學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，30(2):84-88.

［9］ WU H，PEI J，WU G，et al.Overexpression of GH10 endoxy-lanase XynB from T.maritima in E.coli by a novel vector with potential for industrial application［J］.Enzyme Microb Technol，2008，42:230-234.

［10］QU W，SHAO W.Cloning，expression and characterization of glycoside hydrolase family 11 endoxylanase from Bacillus pumilus ARA［J］.Biotechnol Lett，2011，33:1407-1416.

［11］LE Y，PENG J，WU H，et al.An approach to the production of soluble protein from a fungal gene encoding an aggregation-prone xylanasein Escherichia coli［J］.PLoS ONE，2011，6 (4):e18489.

［12］COUGHLAN M P，HAZLEWOOD G P.β-1，4-D-Xylan-degrading enzyme system:biochemistry，molecular biology and application［J］.Biotechnol Appl Biochem，1993，17:259-289.

［13］MOREAU A，ROBERGE M，MANIN C，et al.Identification of two acidic residues involved in the catalysis of xylanase A from Streptomyces lividans［J］.Biochem J，1994，302:291-295.

［14］POLIZELI MLTM，RIZZATTI ACS，MONTI R，et al.Xylanases from fungi:properties and industrial application［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，67:577-591.

［15］GUO B，CHEN X L，SUN C Y，et al.Gene cloning，expression and characterization of a new cold-active and salt-tolerant endo-β-1，4-xylanase from marine Glaciecola mesophila KMM 241［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2009，84:1107-1115.

［16］KUBATA B K，SUZUKI T，HORITSU H，et al.Purification and characterization of Aeromonas caviae ME-1 xylanase V，which produces exclusively xylobiose from xylan［J］.Appl Environ Microbiol，1994，60:531-535.

［17］LEE C C，SMITH M，KIBBLEWHITE-ACCINELLI R E，et al.I-solation and characterization of a cold-active xylanase enzyme from Flavobacterium sp.［J］.Curr Microbial，2006，52:112-116.

［18］ZHOU J，HUANG H，MENG K，et al.Molecular and biochemical characterization of a novel xylanase from the symbiotic Sphingobacterium sp.TN19［J］.Appli Microbiol Biotechnol，2009，85:323-333.

［19］OH HW，HEO SY，PARK DS，et al.Biochemical characterization and sequence analysis of a xylanase produced by an exo-symbiotic bacterium of Gryllotalpa orientalis，Cellulosimicrobium sp. HY-12［J］.Anton Leeuw，2008，3:437-442.

［20］LI N，MENG K，WANG Y，et al.Cloning，expression，and characterization of a new xylanase with broad temperature adaptability from Streptomyces sp.S9［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，80:231-240.

［21］INAGAKI K，NAKAHIRA K，MUKAI K，et al.Gene cloning and characterization of an acidic xylanase from Acidobacterium capsulatum［J］.Biosci，Biotechnol，Biochem，1998，62:1061-1067.

［22］ZHAO L，MENG K，SHI P，et al.A novel thermophilic xylanase from Achaetomium sp.Xz-8 with high catalytic efficiency and application potentials in the brewing and other industries［J］.Process Biochemistry，2013，48(12):1879-1885.

［23］FAN G，YANG S，YAN Q，et al.Characterization of a highly thermostable glycoside hydrolase family 10 xylanase from Malbranchea cinnamomea［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2014，70:482-489.

［24］JIANG Z Q，DENG W，ZHU Y P，et al.The recombinant xylanase B of Thermotoga maritima is highly xylan specific and produces exclusively xylobiose from xylans，a unique character for industrial applications［J］.J Mol Catal B:Enzym，2004，27: 207-213.

［25］UL HAQ I，HUSSAIN Z，KHAN MA，et al.Kinetic and thermodynamic study of cloned thermostable endo-1，4-β-xylanase from Thermotoga petrophila in mesophilic host［J］.Molecular Biology Reports，2012，39(7):7251-7261.

［26］SHI H，ZHANG Y，LI X，et al.A novel highly thermostable xylanase stimulated by Ca2+from Thermotoga thermarum:cloning，expression and characterization［J］.Biotechnol Biofuels，2013，6:26.

［27］SIMPSON H D，HAUFLER U R，DANIEL R M.An extremely thermostable xylanase from the thermophilic eubacterium Thermotoga［J］.Biochem J，1991，277:413-417.

［28］LO LEGGIO L，KALOGIANNIS S，BHAT M K，et al.High resolution structure and sequence of T.aurantiacus xylanase I:implications for the evolution of thermostability in family 10 xylanases and enzymes with(beta)alpha-barrel architecture［J］.Proteins: Structure，F(xiàn)unction，and Geneties，1999，36:295-306.