袁銘蘭，田玉芳，孫 晨

苦蕎為蓼科蕎麥屬植物苦蕎麥Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn .的干燥成熟種子[1]。近年來，隨著藥食兩用資源的不斷開發(fā)，有關(guān)苦蕎的研究逐漸增多?？嗍w富含蘆丁、山萘酚、山萘酚-3-O-蕓香糖苷及槲皮素等黃酮類化合物[1]，現(xiàn)代藥理研究其具有降糖降脂抗氧化等作用[2,3]。槲皮素是苦蕎中主要的黃酮成分之一，關(guān)于槲皮素單體的藥動(dòng)學(xué)研究已有報(bào)道[4,5]，但有關(guān)苦蕎提取物中槲皮素的藥動(dòng)學(xué)及在病理狀態(tài)下的藥動(dòng)學(xué)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)苦蕎提取物中槲皮素在正常大鼠及糖尿病大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了研究，以期對(duì)含苦蕎的藥品及保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 日本島津LC-20AT高效液相色譜儀（包括SPD-20A紫外檢測(cè)器，N2000色譜工作站）；高速離心機(jī)（美國Sigma公司）；METTLER AE240分析天平（梅特勒儀器有限公司）；SK-1快速混勻器（江蘇金壇中大儀器廠）。

槲皮素對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100081-200406）；苦蕎提取物（自制，HPLC法測(cè)得槲皮素含量為31.46 mg/g）；甲醇、乙腈（色譜純，美國天地試劑有限公司）；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)），其余試劑均為分析純。

雄性SD大鼠[江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2009-0002]15只，平均體重（250±20）g。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（250×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.2%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）按如下梯度洗脫：0～20 min，25%～40% B；20～23 min，40%～50% B；23～35 min，50%～75% B；流速：1 ml/min；檢測(cè)波長：370 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣20 μl。

1.2.2 苦蕎提取物的制備 稱取干燥的苦蕎粉末50 g，置1 L燒瓶中加入10倍量70%乙醇，加熱回流提取2次，每次1 h，過濾，濾渣用70%乙醇潤洗，合并濾液，濃縮并干燥即得，經(jīng)HPLC測(cè)得苦蕎提取物中槲皮素含量為31.46 mg/g。

1.2.3 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取槲皮素對(duì)照品適量置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得含槲皮素68.4 mg/L的對(duì)照品溶液。

1.2.4 血漿樣品預(yù)處理 精密吸取血漿0.1 ml，加0.2 ml乙腈沉淀蛋白，渦流振蕩1 min，13 000 r/min，離心5 min，取上清0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣20 μl。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 方法的專屬性 將空白血漿、空白血漿中加入槲皮素對(duì)照品、灌胃苦蕎提取物后正常大鼠血漿樣品及灌胃苦蕎提取物后糖尿病大鼠血漿樣品按“1.2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣，考察槲皮素主峰的特異性，是否與其他峰分離度良好。

1.2.5.2 線性范圍及檢測(cè)限 精密吸取槲皮素對(duì)照品溶液適量，置于1 ml離心管中，加入大鼠空白血漿100 μl，配制成槲皮素濃度為0.171、0.342、0.684、1.710、3.420、6.840 mg/L的血漿樣本，并進(jìn)行色譜分析，以峰面積Y對(duì)血藥濃度X進(jìn)行線性回歸。

1.2.5.3 準(zhǔn)確度和精密度 配制含槲皮素0.285、0.855、3.420 mg/L的低、中、高濃度的血漿樣品，各濃度測(cè)5次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算槲皮素的含量，求算方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.2.5.4 提取回收率 配制含槲皮素0.285、0.855、3.420 mg/L的低、中、高濃度的血漿樣品各5份，進(jìn)樣20 μl，測(cè)定得到峰面積（5次測(cè)定的平均值）A1；以同時(shí)配制等濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)樣得到的峰面積（5次測(cè)定的平均值）A2作為對(duì)照，計(jì)算得出低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品中槲皮素的提取回收率（R=A1/ A2×100%）。

1.2.5.5 穩(wěn)定性考察 配制含槲皮素的低、中、高3個(gè)濃度0.285、0.855、3.420 mg/L的血漿樣品，考察室溫放置穩(wěn)定性、臨時(shí)儲(chǔ)存穩(wěn)定性及長期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

1.2.6 藥動(dòng)學(xué)研究 將15只平均體重為（250±20）g的雄性SD大鼠分為2組，其中模型組10只，對(duì)照組5只。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，禁食1夜。模型組雄性SD大鼠10只高脂高糖飼料喂養(yǎng)2周后，一次性腹腔注射35 mg/kg STZ（溶于0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液中，pH 4.5）造糖尿病模型，對(duì)照組注射同體積的枸櫞酸緩沖液。48 h后大鼠禁食12 h，測(cè)定空腹血糖，取5只血糖高于14 mol/L的模型組大鼠用于實(shí)驗(yàn)研究[6]。將模型組和對(duì)照組大鼠同等條件下飼養(yǎng)4周。將飼養(yǎng)4周的模型組和對(duì)照組大鼠（于實(shí)驗(yàn)前3 d重新測(cè)定血糖）給藥前禁食12 h，自由飲水，兩組大鼠灌胃給藥苦蕎提取物0.5 g/kg（給藥劑量按槲皮素算為15.73 mg/kg），并于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h眼眶后靜脈叢取血，置于肝素化離心管中，分離血漿，-20℃保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 血藥濃度數(shù)據(jù)采用3P97軟件進(jìn)行處理，其余數(shù)據(jù)采用DAS 2.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 方法的專屬性 空白血漿、空白血漿中加入槲皮素對(duì)照品、灌胃苦蕎提取物正常大鼠血漿樣品、灌胃苦蕎提取物糖尿病大鼠血漿樣品色譜圖見圖1。從圖中可知，槲皮素與其他干擾組分分離效果良好，無雜質(zhì)峰干擾。

2.2 線性范圍及檢測(cè)限 線性方程為Y =6973.5X +151.64 （r2=0.9995），血漿中槲皮素在0.171～6.840 mg/L之間線性關(guān)系良好，血漿中檢測(cè)限為0.0570 mg/L。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 該方法的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果如表1所示。

2.4 提取回收率 低、中、高3個(gè)濃度血漿樣品中槲皮素的提取回收率分別為83.1%、85.6%、84.8%，平均提取回收率為84.5%，符合藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。

2.5 穩(wěn)定性考察 結(jié)果表明，血漿樣品預(yù)處理后室溫放置24 h穩(wěn)定；樣品經(jīng)4℃冰箱儲(chǔ)存72 h保持穩(wěn)定；樣品在-20℃冰凍保存2周穩(wěn)定。

圖1 大鼠血漿樣品中槲皮素的HPLC色譜圖

表1 血漿樣品中槲皮素的準(zhǔn)確度和精密度 （n=5；±s）

表1 血漿樣品中槲皮素的準(zhǔn)確度和精密度 （n=5；±s）

濃度（mg/L） 日內(nèi)精密度日間精密度測(cè)量值（mg/L） 準(zhǔn)確度（%） 精密度（%） 測(cè)量值（mg/L） 準(zhǔn)確度（%） 精密度（%）0.285 0.272±0.006 95.5 2.21 0.268±0.006 94.2 2.24 0.855 0.832±0.015 97.3 1.80 0.819±0.022 95.8 2.69 3.420 3.242±0.044 94.8 1.36 3.263±0.039 95.4 1.20

2.6 模型組大鼠的體重和血糖 與對(duì)照組大鼠體重（268.3±17.2）g、血糖（5.28±0.27） mmol/L比較，大鼠造模4周后體重（203.5±12.9） g、血糖數(shù)據(jù)（21.04±3.18）mmol/L明顯變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組大鼠呈現(xiàn)明顯的糖尿病癥狀：多飲、多食、多尿及體重急劇減少。血糖數(shù)據(jù)表明模型組大鼠為典型的糖尿病。

2.7 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 血藥濃度數(shù)據(jù)見表2、3，用3P97藥動(dòng)學(xué)程序?qū)ρ帩舛葦?shù)據(jù)擬合計(jì)算，結(jié)果表明苦蕎提取物中的槲皮素在正常大鼠和糖尿病大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)均符合二房室模型，主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表4，其平均藥-時(shí)曲線見圖2。

3 討 論

表2 5只正常雄性SD大鼠體內(nèi)槲皮素血藥濃度數(shù)據(jù)（mg/L）

成功制備糖尿病大鼠模型是本實(shí)驗(yàn)的重要組成部分。目前，糖尿病大鼠造模以化學(xué)損傷法為主，即通過注射四氧嘧啶、鏈脲佐菌素、雙硫腙等化學(xué)藥物，制備糖尿病大鼠模型。也有一次性腹腔注射STZ55-60 mg/kg造模，還有高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射低劑量STZ造模[6-9]，綜合考慮大鼠造模的成活率以及與人體Ⅱ型糖尿病癥狀的接近，故本實(shí)驗(yàn)組選用高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素腹腔注射制造糖尿病大鼠模型，劑量為35 mg/kg。

表3 5只雄性糖尿病SD大鼠體內(nèi)槲皮素血藥濃度數(shù)據(jù)（mg/L）

糖尿病患者機(jī)體代謝旺盛，典型癥狀表現(xiàn)為多飲、多食、多尿、身體消瘦，即“三多一少”。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)曾選用體重為180～220 g 大鼠進(jìn)行造模，多數(shù)大鼠因過度消瘦或死亡，從而未完成實(shí)驗(yàn)，故本研究選擇體重為 250 g左右的大鼠以保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

灌胃苦蕎提取物后，槲皮素在糖尿病大鼠體內(nèi)與正常大鼠體內(nèi)相比發(fā)生了明顯的變化，其中Cmax1、Cmax2、AUC0-12明顯增加。這與文獻(xiàn)[10,11]報(bào)道鏈脲佐菌素及高血糖環(huán)境能造成肝臟病變以及引起肝臟代謝酶的變化，所以推測(cè)可能為體內(nèi)肝臟損傷及肝代謝酶變化導(dǎo)致槲皮素的代謝降低，從而導(dǎo)致糖尿病大鼠的Cmax和AUC0-12較正常大鼠有所升高。另外文獻(xiàn)[12]中認(rèn)為可能是糖尿病大鼠腸道微生態(tài)紊亂引起的產(chǎn)葡糖醛酸苷酶的細(xì)菌增加，從而導(dǎo)致黃酮苷轉(zhuǎn)化為黃酮苷元。本研究的苦蕎提取物中蘆丁和槲皮素均為其主要成分[13]，由于肝臟病變及肝代謝酶的變化，導(dǎo)致體內(nèi)黃酮成分蘆丁的升高，繼而蘆丁在體內(nèi)被葡糖醛酸苷酶代謝去苷轉(zhuǎn)化為槲皮素，導(dǎo)致了槲皮素在糖尿病大鼠體內(nèi)Cmax和AUC0-12的升高。本研究表明，同一藥物在不同病理狀態(tài)的體內(nèi)表現(xiàn)為不同的體內(nèi)過程，這正提示了以后的體內(nèi)過程研究最好在與人體病癥接近的動(dòng)物模型體內(nèi)進(jìn)行更有實(shí)際參考意義。

同時(shí)，本研究中大鼠灌胃苦蕎提取物后槲皮素在糖尿病大鼠體內(nèi)有明顯的雙峰現(xiàn)象出現(xiàn)，表明槲皮素在糖尿病的大鼠腸道中存在重吸收或者同類成分之間的互相轉(zhuǎn)化。通過上述推測(cè)分析，此現(xiàn)象可能為苦蕎提取物中的另一主要黃酮成分蘆丁在糖尿病大鼠體內(nèi)被葡糖醛酸苷酶代謝去苷轉(zhuǎn)化為槲皮素，從而導(dǎo)致二次吸收情況的發(fā)生，但具體的情況還需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)于苦蕎提取物的新藥及保健食品的開發(fā)，以及以后的臨床使用劑量均有一定的指導(dǎo)意義。

圖2 苦蕎提取物中槲皮素在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線

表3 苦蕎提取物中槲皮素在大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù) （n=5；>±s）

表3 苦蕎提取物中槲皮素在大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù) （n=5；>±s）

藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 正常大鼠 糖尿病大鼠t1/2β（h） 32.874±11.251 53.381±12.562 AUC0-12（mg·h/L） 5.982±2.361 10.248±4.103 Tmax1（h） 0.25 0.25 Tmax2（h） - 4 Cmax1（mg/L） 1.022±0.280 1.477±0.356 Cmax2（mg/L） - 0.602±0.090

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